趙婉清 李巧 李瑩 楊柳 鄭茜之 張虎芳

摘要：線粒體基因組是系統(tǒng)發(fā)育常用的分子標(biāo)記，本研究旨在對(duì)獵蝽科昆蟲的線粒體基因組進(jìn)行比較研究，著重分析基因重排、堿基組成、密碼子使用偏好性等特征，并構(gòu)建基于13個(gè)蛋白編碼基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。在GenBank數(shù)據(jù)庫下載獵蝽科11亞科30屬代表物種的線粒體基因組序列，通過Geneious 8.0.4抽提各編碼基因的序列。利用MEGA 7.0統(tǒng)計(jì)堿基組成、氨基酸和核苷酸序列信息位點(diǎn)、起始密碼子、終止密碼子、相對(duì)密碼子使用頻率（RSCU）等序列基本信息。另外，利用DnaSP 6.0計(jì)算蛋白編碼基因的非同義替換率（Ka）和同義替換率（Ks），并通過Ka/Ks值比較基因的核苷酸進(jìn)化速率。通過jModelTest選擇進(jìn)化模型，在MrBayes 3.2.2軟件中構(gòu)建基于貝葉斯法（BI）的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明：獵蝽科線粒體基因組均呈共線性結(jié)構(gòu)，沒有發(fā)現(xiàn)大面積的基因重排現(xiàn)象，只有部分序列中rrnS和trnT基因編碼方向與原始序列編碼方向相反，trnR和cytb基因出現(xiàn)多拷貝的現(xiàn)象。獵蝽科線粒體最常使用ATN起始密碼子和TAA終止密碼子。BI系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)獵蝽科各亞科之間的關(guān)系進(jìn)行了一定的解析，光獵蝽亞科（Ectrichodiinae）和獵蝽亞科（Reduviinae）為并系群，真獵蝽亞科（Harpactorinae）和錐獵蝽亞科（Triatominae）為單系群。本研究為獵蝽科昆蟲的線粒體基因組進(jìn)行了比較分析，為后續(xù)研究該科系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：獵蝽科;線粒體基因組;比較基因組學(xué);系統(tǒng)發(fā)育;分子標(biāo)記;基因重排;堿基組成;密碼子使用偏好性

中圖分類號(hào)： S433.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）12-0034-08

收稿日期：2021-11-23

基金項(xiàng)目：山西省高等學(xué)校科技創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào)：2019L09841）;忻州師范學(xué)院院級(jí)科研基金（編號(hào)：2018KY04）。

作者簡(jiǎn)介：趙婉清（1989—），女，山西靈石人，博士，主要從事昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)研究。E-mail：zhaowanqing@vip.163.com。

通信作者：張虎芳，博士，教授，主要從事昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)研究。E-mail：zh_hufang@sohu.com。

線粒體具有獨(dú)立的基因組，且在真核生物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在。線粒體基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、排列緊密、進(jìn)化速率較快、能夠獨(dú)立復(fù)制、編輯效率高，是系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化、種群遺傳學(xué)、生物地理學(xué)等常用的標(biāo)記基因[1-3]。隨著生物測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，GenBank數(shù)據(jù)庫中的昆蟲線粒體基因組序列越來越多，為昆蟲線粒體的比較分析以及分子系統(tǒng)學(xué)研究提供了新的方向和依據(jù)。昆蟲線粒體基因組一般包括37個(gè)編碼基因（13個(gè)蛋白編碼基因、22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因）和一段控制區(qū)[4]。對(duì)近緣物種進(jìn)行比較線粒體基因組學(xué)研究可以為物種的分類和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系奠定理論依據(jù)。

獵蝽科（Reduviidae）隸屬于半翅目（Hemiptera）異翅亞目（Heteroptera），廣布于世界各地，種類較多，是異翅亞目中的一個(gè)大科[5]。該科多為捕食性昆蟲，某些種類可以捕食褐飛虱、草地貪夜蛾、斜紋夜蛾、煙青蟲等害蟲，是農(nóng)林業(yè)中重要的天敵昆蟲，對(duì)該科昆蟲的研究具有一定的科學(xué)和經(jīng)濟(jì)意義[6-9]。獵蝽科世界已知6 000余種，我國(guó)記錄13個(gè)亞科400余種[5]。以往對(duì)獵蝽科系統(tǒng)發(fā)育的研究主要是基于少量分子數(shù)據(jù)，而對(duì)線粒體基因組的研究較少[10]。

本研究選取獵蝽科11亞科30屬的代表物種，進(jìn)行該科線粒體基因組的比較分析和系統(tǒng)發(fā)育研究。對(duì)線粒體基因組的排列、堿基組成、序列信息位點(diǎn)、密碼子使用情況等進(jìn)行比較分析，并基于貝葉斯法（Bayesian inference，BI）構(gòu)建獵蝽科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 序列獲取

本研究選取獵蝽科11亞科30屬的代表物種進(jìn)行研究，通過NCBI中的GenBank數(shù)據(jù)庫（https//www ncbi.Nlm.nih.gov/）下載獲得線粒體序列，詳細(xì)的序列信息見表1。

1.2 數(shù)據(jù)分析

利用Geneious 8.0.4[11]軟件從線粒體基因組序列中抽提出各編碼基因，再利用SequenceMatrix[12]串聯(lián)成所需的數(shù)據(jù)集。對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，蛋白編碼基因需將核苷酸序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列，保存比對(duì)后的核苷酸序列;RNA基因直接進(jìn)行比對(duì)后保存核苷酸矩陣序列。在SequenceMatrix中分別將蛋白編碼基因串聯(lián)成13個(gè)蛋白編碼基因（protein-coding genes，PCGs）、重鏈編碼的蛋白編碼基因（PCGs-J）和輕鏈編碼的蛋白編碼基因（PCGs-J）3個(gè)數(shù)據(jù)集。在MEGA 7.0[13]中統(tǒng)計(jì)堿基組成和序列信息位點(diǎn)，并計(jì)算同義密碼子相對(duì)使用頻率（RSCU）。在DnaSP 6.0[14]軟件中計(jì)算蛋白編碼基因的非同義替換率（nonsynonymous substitution rate，Ka）和同義替換率（synonymous substitution rate，Ks），進(jìn)而統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因的核苷酸進(jìn)化速率，即Ka/Ks值。為了探究獵蝽科昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，選取臭蟲科1種溫帶臭蟲（Cimex lectularius）作為外群，基于13個(gè)蛋白編碼基因構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹。BI發(fā)育樹在MrBayes 3.2.2[15]中運(yùn)行計(jì)算，運(yùn)行10 000 000代，每1 000代抽樣1次，舍去收斂前的樣本。利用jModelTest[16]預(yù)測(cè)進(jìn)化模型，預(yù)測(cè)結(jié)果為GTR+I+G模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體基因組全序列的結(jié)構(gòu)

截至2021年10月，GenBank共收錄了獵蝽科11亞科30屬的昆蟲線粒體基因組序列110條，為研究該科昆蟲的比較線粒體基因組學(xué)研究奠定了良好基礎(chǔ)。與半翅目其他昆蟲類似，獵蝽科線粒體基因組共37個(gè)編碼基因，其中13個(gè)蛋白編碼基因、22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因，還包括一段非編碼控制區(qū)。線粒體基因組長(zhǎng)度范圍為13 977～16 759 bp，最長(zhǎng)的是伐獵蝽（Phalantus geniculatus），最短的是海南桿蝓獵蝽（Ischnobaenella hainana）。

2.2 基因重排現(xiàn)象

獵蝽科30屬代表物種的線粒體基因組均呈共線性結(jié)構(gòu)，沒有發(fā)現(xiàn)大面積的基因重排現(xiàn)象。通過依次比較30條線粒體基因組，對(duì)個(gè)別出現(xiàn)重排的序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較作圖分析。由圖1可知，Agriosphodrus dohrni和Brontostoma colossus線粒體基因組中rrnS基因編碼方向與原始序列編碼方向相反;Dipetalogaster maximus線粒體基因組中trnT基因編碼方向與原始序列編碼方向相反;獵蝽Brontostoma colossus線粒體基因組中trnR基因有多拷貝現(xiàn)象，形成trnR-trnA-trnR的排列方式;Eratyrus mucronatus線粒體基因組中cytb出現(xiàn)多拷貝現(xiàn)象。

2.3 堿基組成和序列信息位點(diǎn)分析

已測(cè)得的獵蝽科昆蟲線粒體基因組的堿基組成具有明顯的AT偏倚性，且AT含量最高的是Polytoxus fuscovittatus（77.8%），最低的是Panstrongylus rufotuberculatus（68.1%）。對(duì)A、T、G、C各堿基的組成進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，所有獵蝽科昆蟲中堿基A的含量均高于T的含量，AT-skew均大于0（0.09～0.19）;G的含量均高于C的含量，GC-skew 均小于0（-0.27～-0.12）。

對(duì)13個(gè)蛋白編碼基因的堿基組成進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2、圖3所示。atp8的（A+T）含量最高（75.54%），cox1的（A+T）含量最低（65.75%）。位于J鏈的蛋白編碼基因（PCGs-J），（A+T）含量為69.93%，且堿基A與T的含量相同，GC-skew為-0.15。位于N鏈的蛋白編碼基因（PCGs-N），（A+T）含量為74.57%，AT-skew為-0.37，GC-skew為0.26。

13個(gè)蛋白編碼基因的核苷酸和氨基酸序列的信息位點(diǎn)分析結(jié)果見圖4和圖5。cox1的保守性在核苷酸和氨基酸序列中均較高（47.63%和63.98%），而atp8基因的保守性較差（14.03%和9.20%）。蛋白編碼基因的核苷酸串聯(lián)序列中，保守位點(diǎn)有3 624個(gè)，變異位點(diǎn)有7 527個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)有6 362個(gè)。在氨基酸串聯(lián)序列中，保守位點(diǎn)有387個(gè)，變異位點(diǎn)有3 303個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)有3 007個(gè)。

2.4 密碼子使用情況

在獵蝽科線粒體蛋白編碼基因中，最常使用ATN起始密碼子，但也有一些特殊情況，如nad1、nad4L和nad5也會(huì)使用GTG和TTG為起始密碼子。在ATN起始密碼子中，ATG的使用頻率較高，如atp6和nad4的起始密碼子全部為ATG（圖6）。對(duì)于終止密碼子的使用，密碼子TAA的使用頻率最高，TA的使用頻率最低。在cox1、cox2、cox3和nad5中，以T結(jié)尾的情況較多（圖7）。

本研究統(tǒng)計(jì)了相對(duì)密碼子使用頻率（RSCU），使用頻率較高的密碼子為UUA（L）、GUU（V）和UAU（Y），使用頻率相對(duì)較低的為CCG（P）、CUC（L）和CUG（L）（表2）。在同義密碼子中，第3位以A/U結(jié)尾的密碼子比G/C結(jié)尾的密碼子使用頻率高。

2.5 蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)化速率

蛋白編碼基因的核苷酸Ka、Ks及Ka/Ks值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖8。所有基因的Ka/Ks值均小于1，表明受到了純化選擇的作用。其中，atp8的進(jìn)化速率最快，cox1的進(jìn)化速率最慢，具體的排列順序?yàn)閍tp8>nad4L>nad6>nad4>nad3>nad5>atp6>cox2>nad1>nad2>cox3>cytb>cox1。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

以臭蟲科作為外群，基于13個(gè)蛋白編碼基因序列構(gòu)建了獵蝽科30屬的BI系統(tǒng)發(fā)育樹（圖9）。結(jié)果表明，獵蝽科各亞科的關(guān)系得到了一定的解析，該科基部分支為盲獵蝽亞科（Saicinae），光獵蝽亞科（Ectrichodiinae）和獵蝽亞科（Reduviinae）為并系群，真獵蝽亞科（Harpactorinae）和錐獵蝽亞科（Triatominae）為單系群。錐獵蝽亞科（Triatominae）和細(xì)足獵蝽亞科（Stenopodinae）為姐妹群關(guān)系，盜獵蝽亞科（Peiratinae）和新獵蝽亞科（Centrocnemidinae）為姐妹群關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

一直以來，果蠅（Drosophila yakuba）的線粒體基因組是公認(rèn)的昆蟲線粒體基因組的原始排列方式[17]。共線性分析結(jié)果顯示，獵蝽科昆蟲線粒體基因組的排列方式比較保守，大多數(shù)與原始排列方式一致，只存在少數(shù)基因重排現(xiàn)象，以基因編碼方向與原始序列編碼方向相反和基因多拷貝現(xiàn)象為主。其中，rrnS和trnT基因的編碼方向出現(xiàn)與原始序列編碼方向相反的情況，trnR和cytb基因均多拷貝了1次。

獵蝽科線粒體基因組長(zhǎng)度范圍為13 977～16 759 bp，具有明顯的AT偏倚性，A+T含量為68.1%～77.8%，且堿基A的含量均高于T，堿基G的含量均高于C。13個(gè)蛋白編碼基因中， cox1的保守性較高，而atp8基因的保守性較差。同時(shí)，采用Ka/Ks值比較基因進(jìn)化速率結(jié)果也表明，atp8的進(jìn)化速率最快，cox1的進(jìn)化速率最慢，與先前的相關(guān)研究結(jié)果[18]一致。13個(gè)蛋白編碼基因的Ka/Ks值均小于1，可能是受到了純化選擇的作用[19]。

在密碼子的使用上，除偏好使用的ATN起始密碼子外，獵蝽科線粒體蛋白編碼基因也會(huì)以GTG和TTG作為起始密碼子。對(duì)于終止密碼子來說，除完整的TAA和TAG密碼子使用頻率較高外，不完整的TA和T在獵蝽科蛋白編碼基因中也很常見。這些不完整的終止密碼子會(huì)在轉(zhuǎn)錄形成mRNA后轉(zhuǎn)變成完整的終止密碼子[20]。同義密碼子相對(duì)使用頻率結(jié)果顯示，以A/U結(jié)尾的密碼子使用頻率高于G/C結(jié)尾的，與昆蟲線粒體基因組的高AT特性一致。

基于貝葉斯算法構(gòu)建的BI系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)獵蝽科各亞科的關(guān)系進(jìn)行了一定的解析，結(jié)果顯示獵蝽亞科為并系群，這與Weirauch選取162個(gè)形態(tài)特征對(duì)獵蝽科進(jìn)行的支序系統(tǒng)學(xué)分析結(jié)果[21]，以及趙廣宇采用COI基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果[10]一致。本研究中真獵蝽亞科和錐獵蝽亞科為單系群，與Carayon等的研究結(jié)果[22]相同。絨獵蝽亞科和光獵蝽亞科的姐妹群關(guān)系沒有得到驗(yàn)證，與2個(gè)亞科線粒體基因組序列較少有很大關(guān)系。另外，由于獵蝽科昆蟲的形態(tài)特征差異顯著，尚無嚴(yán)格的分類系統(tǒng)，高級(jí)階元間的關(guān)系非?；靵y。隨著獵蝽科被報(bào)道的線粒體基因組序列越來越多，系統(tǒng)發(fā)育的研究也將迎來新的進(jìn)展。

本研究選取了獵蝽科11亞科30屬的代表物種進(jìn)行比較線粒體基因組學(xué)研究，對(duì)線粒體基因組的重排現(xiàn)象、堿基組成、密碼子使用情況和蛋白編碼基因的核苷酸進(jìn)化速率進(jìn)行分析，并基于13個(gè)蛋白編碼基因構(gòu)建了獵蝽科昆蟲的BI系統(tǒng)發(fā)育樹。獵蝽科線粒體基因組呈共線性結(jié)構(gòu)，沒有發(fā)現(xiàn)大面積的基因重排現(xiàn)象，只出現(xiàn)了極個(gè)別的多拷貝和基因編碼方向與原始序列編碼方向相反的現(xiàn)象。在蛋白編碼基因中，cox1的保守性最高，進(jìn)化速率最慢;而atp8基因的保守性最差，進(jìn)化速率最快。BI系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)獵蝽科各亞科的關(guān)系進(jìn)行了一定的解析，為之后的系統(tǒng)進(jìn)化研究奠定了一定的基礎(chǔ)，但是由于該科昆蟲本身差異顯著、分類系統(tǒng)混亂，尚需進(jìn)一步的深入探究。

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