王勝潔,魏子奇,曹 慧,徐 斐,葉 泰,袁 敏,吳秀秀,陰鳳琴,于勁松,郝麗玲

(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院,上海食品快速檢測工程技術(shù)研究中心,上海 200093)

在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,農(nóng)藥主要用于抑制農(nóng)作物中蟲類生長繁殖和預(yù)防病蟲害[1],但殘留在水果、蔬菜和糧食作物以及水、土壤等環(huán)境中的農(nóng)藥,會通過食物鏈不斷在人體內(nèi)累積,從而致畸、致癌、致突變等,嚴(yán)重影響了人們的日常食用安全。為此,國家制定了嚴(yán)格的限量和檢測標(biāo)準(zhǔn),以對食品中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行控制。目前,檢測農(nóng)藥常用的方法為色譜法,主要包括氣相色譜法、高效液相色譜法(HPLC)和毛細(xì)管電泳法[2-4]等。這些方法雖然具有較高的靈敏度,但需要熟練的技術(shù)人員、復(fù)雜的樣品制備過程及昂貴的儀器設(shè)備,因此有必要開發(fā)出新的農(nóng)藥快速檢測技術(shù)。

分子印跡聚合物(MIP)具有高度選擇性、特異識別性,可以從復(fù)雜食品中富集痕量目標(biāo)物[5],還具有耐高溫高壓、耐酸堿、不易被破壞且能重復(fù)使用等優(yōu)良特性[6]。MIP 對目標(biāo)物的專一性識別能夠有效解決傳統(tǒng)農(nóng)藥殘留檢測方法存在的特異性差、受反應(yīng)物質(zhì)干擾大等問題,已被廣泛應(yīng)用于待測樣品中目標(biāo)物的選擇性富集,但并不能實現(xiàn)同步檢測。目前已經(jīng)發(fā)展出多種印跡聚合物的標(biāo)記檢測技術(shù),在這些技術(shù)中,量子點熒光探針技術(shù)因具有快速、靈敏、簡便的特點而受到廣泛關(guān)注。將不同粒徑的熒光量子點修飾于材料中,還可在同一激發(fā)光下實現(xiàn)對目標(biāo)物的同步檢測[7]。

將分子印跡技術(shù)與量子點修飾技術(shù)結(jié)合形成針對農(nóng)藥分子的印跡熒光探針,即可通過探針的熒光猝滅或增強(qiáng)判斷農(nóng)藥的含量變化。該方法具有抗干擾能力強(qiáng)、選擇性高等優(yōu)點,對農(nóng)藥殘留檢測具有獨特優(yōu)勢,可以實現(xiàn)對目標(biāo)物的高靈敏快速檢測。因此,本工作首先對分子印跡技術(shù)的原理、制備方法及應(yīng)用進(jìn)行概述,在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步闡述了量子點修飾的分子印跡熒光探針在農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用和展望。

1 MIP的合成原理及制備方法

1.1 MIP的合成原理

分子印跡技術(shù)是模擬天然抗原和抗體特異性識別的機(jī)制[8],通過合成特定的MIP對目標(biāo)模板進(jìn)行選擇性識別。由于其具有人工合成的識別位點,即使在存在結(jié)構(gòu)類似物的情況下也能夠重新結(jié)合目標(biāo)分析物。MIP 的合成步驟如圖1 所示,主要分為3個步驟:功能單體和模板分子在一定比例下,通過合適的條件,以共價鍵或非共價鍵作用方式發(fā)生預(yù)聚合反應(yīng),形成預(yù)聚合物;預(yù)聚合物與致孔劑、交聯(lián)劑在熱或者光作用下發(fā)生聚合反應(yīng);反應(yīng)結(jié)束后利用合適的洗脫劑去除模板,從而形成與目標(biāo)物大小、形狀、結(jié)構(gòu)相匹配的空穴。當(dāng)存在目標(biāo)模板時,制備好的MIP內(nèi)部功能基團(tuán)與其特異結(jié)合,充分發(fā)揮MIP的特異識別功能[9-10]。

圖1 MIP的制備過程Fig.1 Preparation process of MIP

在MIP的制備過程中,模板分子與功能單體形成的預(yù)聚合體系對所制備的高分子聚合物的吸附性能和識別性能起著重要的作用[11]。因此,很多研究者在制備印跡聚合物前,首先采用紫外-可見分光光度法、等溫滴定量熱法、計算機(jī)模擬方法[12]、紅外-可見分光光度法[13]、核磁共振法[14]等篩選出相應(yīng)的功能單體。目前,已成功制備的MIP中的農(nóng)藥模板分子大多數(shù)含有硝基亞甲基(C＝CHNO2)、硝基胍(C＝NO2)和氰基脒(C＝NCN)等功能基團(tuán),還含有6-氯-3-吡啶(吡蟲啉)、2-氯-5-噻唑(噻蟲嗪)和四氫呋喃環(huán)(呋蟲胺)等活性基團(tuán)。篩選出的功能單體多為3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、苯基硅烷、丙烯酸、甲基丙烯酸等。這些功能單體和農(nóng)藥模板分子之間可以通過氫鍵、π-π鍵等穩(wěn)定價鍵結(jié)合,形成更穩(wěn)定的分子復(fù)合體系。

表1總結(jié)了農(nóng)藥模板與常用功能單體的作用方式及合成MIP的檢測應(yīng)用。

表1 農(nóng)藥模板與常用功能單體的作用方式及合成MIP的檢測應(yīng)用Tab.1 Action modes of templates of pesticides and common functional monomers and detection applications of synthetic MIP

1.2 MIP的制備方法

1.2.1 本體聚合法

本體聚合法指將模板分子、功能單體、交聯(lián)劑等按一定比例在溶劑中混合,去除氧后,加入合適的交聯(lián)劑或引發(fā)劑,通過加熱或者光引發(fā)聚合。這種制備方法操作較為簡便,但合成的剛性聚合物需要進(jìn)一步研磨和篩分,可能會破壞聚合物的結(jié)構(gòu)和印跡位點。而且采用此法制備的印跡聚合物的印跡位點被深深包埋在聚合物內(nèi)部,不利于模板的洗脫和待測物質(zhì)的吸附,導(dǎo)致傳質(zhì)速率慢,結(jié)合能力差[28]。ARIA 等[29]以吡蟲啉為模板,乙酰乙酸甲酯(MAA)為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)為交聯(lián)劑,在模板、功能單體、交聯(lián)劑的物質(zhì)的量比為1∶4∶20時,制備了吡蟲啉MIP。將MIP、非分子印跡聚合物(NIP)和固相萃取相結(jié)合,對土壤和番茄中吡蟲啉農(nóng)藥進(jìn)行提取,印跡因子(評價MIP好壞的指標(biāo)之一,印跡因子越大,說明其印跡效果越好)分別為21,17。

1.2.2 電化學(xué)聚合法

電化學(xué)聚合法采用電化學(xué)方法使模板分子、功能單體、交聯(lián)劑等在電極表面發(fā)生電聚合反應(yīng),直接形成MIP膜,再利用洗脫劑洗脫模板分子,得到電聚合分子印跡電極。采用電化學(xué)聚合法制備的分子印跡膜具有均勻、穩(wěn)定,形成的分子印跡腔結(jié)構(gòu)不易變形等優(yōu)點,因而以其為敏感元件構(gòu)建的印跡傳感器具有良好的選擇性和較高的靈敏性。但是,分子印跡電化學(xué)聚合法還具有一定的局限性,包括結(jié)構(gòu)易碎、在不同溶劑中溶解度有限、檢測過程中選擇性較差等[30]。ZHANG 等[31]開發(fā)了一種偶聯(lián)MIP的比率電化學(xué)傳感器。首先通過Au-S鍵將6-(二茂鐵基)己硫醇(Fc HT)自組裝到修飾金納米顆粒(Au NPs)的玻碳電極(GCE)上,再將功能單體鄰苯二胺(OPD)和模板分子吡蟲啉電聚合在傳感器表面形成分子印跡層,并將其應(yīng)用于吡蟲啉的檢測。該法對吡蟲啉農(nóng)藥檢出限為4.7×10－8mol·L－1,對實際樣品梨和橘子中吡蟲啉農(nóng)藥的回收率為97.0%～103.2%。

1.2.3 沉淀聚合法

沉淀聚合法是將分子印跡層沉積到固體基質(zhì)表面上的一種手段。相對于本體聚合法,沉淀聚合法有如下優(yōu)勢:制備的印跡聚合物不需要研磨過篩、洗脫模板分子相對容易、制備的過程中不需要表面活性劑。LI等[32]采用溶膠-凝膠法制備出二氧化硅載體,再以氰戊菊酯為模板,丙烯酰胺為功能單體,通過沉淀聚合法在其上合成SiO2-TiO2＠Ag＠MIPs。該聚合物對氰戊菊酯農(nóng)藥的吸附量達(dá)到24.1 mg·g－1,檢測線性范圍為1.0～100 nmol·L－1,檢出限達(dá)到0.2 nmol·L－1。

1.2.4 乳液聚合法

乳液聚合法是將交聯(lián)劑、功能單體與模板混合,并經(jīng)劇烈攪拌或超聲處理使其在含有表面活性劑的水相中乳化。與經(jīng)過研磨和篩分的材料相比,由乳液聚合法制得的印跡聚合物可改善結(jié)合位點表面的均質(zhì)性。但是,乳液聚合法仍存在不足,通常需要使用大量化學(xué)物質(zhì),如表面活性劑、緩沖溶液和穩(wěn)定劑等,這些化學(xué)物質(zhì)在合成印跡聚合物后必須去除,從而會使洗脫過程變得復(fù)雜[33]。反相微乳液法是最常見的乳液聚合法,GHANI等[34]基于聚合物量子點(PQDs)和碳量子點(CQDs),采用反相微乳液法分別制備了兩種不同的分子印跡熒光傳感器(PQDs＠MIP和CQDs＠MIP),并應(yīng)用于啶蟲脒農(nóng)藥的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),PQDs＠MIP 具有更寬的檢測范圍,在0.08～109 nmol·L－1內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,檢出限低至0.02 nmol·L－1,可應(yīng)用于水和蘋果中啶蟲脒的檢測。

2 熒光量子點

MIP一般應(yīng)用于對目標(biāo)分子的吸附和富集,但不能實現(xiàn)對其同步快速檢測。近年來,很多研究者采用不同的標(biāo)記物標(biāo)記制備好的MIP,并將其應(yīng)用于目標(biāo)物的選擇性富集和快速檢測。與其他熒光團(tuán)、有機(jī)染料相比,量子點因具有出色且獨特的光學(xué)特性、較高的熒光量子產(chǎn)率等優(yōu)點[35],已被廣泛應(yīng)用于痕量物質(zhì)的檢測中。量子點的感應(yīng)機(jī)制取決于其發(fā)光靈敏度,大多數(shù)熒光猝滅或恢復(fù)原理是目標(biāo)分析物與量子點熒光團(tuán)之間存在化學(xué)或物理相互作用[36]。表2總結(jié)了近年來量子點在不同農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用,其中GQDs為石墨烯量子點。

表2 量子點在不同農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用Tab.2 Application of quantum dots in detection of different pesticides

2.1 碳量子點

近些年,CQDs作為有毒量子點的環(huán)保替代品,引發(fā)人們的極大關(guān)注[42]。CQDs的主要優(yōu)點包括無毒、高光穩(wěn)定性、低成本和高表面鈍化性能等,其他有利特性包括出色的生物相容性、化學(xué)惰性和高比表面積[43],因此將CQDs作為響應(yīng)信號可以對不同的農(nóng)藥進(jìn)行檢測。CQDs熒光傳感器的設(shè)計分為3種[44]:CQDs納米顆粒直接與目標(biāo)物發(fā)生反應(yīng),并導(dǎo)致CQDs熒光信號發(fā)生變化;CQDs與特定受體結(jié)合后功能化,以構(gòu)建熒光納米傳感器;將CQDs與熒光團(tuán)、底物和猝滅劑結(jié)合在一起。表3總結(jié)了近幾年CQDs在不同農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用。AMJADI等[45]設(shè)計了一種雙發(fā)射介孔結(jié)構(gòu)的分子印跡熒光傳感器,對三唑醇類殺蟲劑進(jìn)行檢測。以APTES、硅酸乙酯、十六烷基三甲基溴化銨、NH3·H2O 作為反應(yīng)原料,通過溶膠-凝膠法制備m MIP＠CD/QDs納米顆粒,其中CQDs作為參比信號包裹在二氧化硅核內(nèi),Cd Te/CdSQDs提供檢測信號。此傳感器的線性范圍為20～160μg·L－1,檢出限為6.4μg·L－1,用于河水和廢水樣品中殺蟲劑的檢測。

表3 CQDs在不同農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用Tab.3 Application of CQDs in detection of different pesticides

2.2 硅量子點

硅量子點(SiQDs)由于具有良好的水溶性、獨特的光學(xué)特性和較高的生物相容性,被廣泛開發(fā)用于制備高性能熒光傳感器。與Cd Te和CdS等重金屬半導(dǎo)體量子點相比,SiQDs具有更窄的光譜線寬以及易于制備、環(huán)保、高靈敏度等優(yōu)良特性[52-53],常作為熒光傳感器的檢測信號。YI等[54]以新型的SiQDs為基礎(chǔ)制備熒光傳感器,用于對農(nóng)藥的超靈敏檢測,檢測原理是乙酰膽堿氯化物(ACh)與乙酰膽堿酯酶(AChE)反應(yīng)形成膽堿,膽堿氧化酶(Ch Ox)催化氧化膽堿生成過氧化氫,導(dǎo)致SiQDs的熒光猝滅。加入農(nóng)藥后,AChE 的活性受到抑制,導(dǎo)致生成的過氧化氫減少,因此SiQDs的熒光強(qiáng)度升高,抑制效率與農(nóng)藥質(zhì)量濃度的對數(shù)呈線性相關(guān)。使用SiQDs熒光方法測定甲萘威、對硫磷、二嗪農(nóng)和甲拌磷,測定下限分別為7.25×10－9,3.25×10－8,6.76×10－8,1.9×10－7g·L－1。

2.3 修飾不同配體的量子點

配體在量子點的合成及其光學(xué)性質(zhì)的調(diào)節(jié)中起主要作用,在量子點的合成過程中,配體可以確保膠體穩(wěn)定,同時可控制形成具有單分散尺寸的納米顆粒。配體在量子點表面的修飾還能增加其穩(wěn)定性并降低生物毒性[55]。多種類型的材料,如巰基乙酸(TGA)[56]、3-巰基丙酸(3-MPA)[57]和生物聚合物材料[58]等已被用于量子點的修飾中。表4總結(jié)了近幾年不同配體修飾的量子點在農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用。GUO 等[59]用TGA 修飾帶負(fù)電的Cd Te量子點(TGA-Cd Te-QDs),用半胱胺穩(wěn)定帶正電的金納米顆粒(CS-Au NPs),并通過二者之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測草甘膦。由于靜電相互作用,帶相反電荷的TGA-Cd Te-QDs和CS-Au NPs可以形成熒光能量共振轉(zhuǎn)移供體-受體組件,從而有效地猝滅TGA-Cd Te-QDs的熒光強(qiáng)度。當(dāng)存在草甘膦時,通過靜電相互作用誘導(dǎo)CS-Au NPs聚集,從而導(dǎo)致猝滅量子點的熒光恢復(fù)。該方法已用于蘋果中草甘膦的檢測,線性范圍為0.02～2.0μg·kg－1,檢出限為9.8 ng·kg－1。

表4 不同配體修飾的量子點在不同農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用Tab.4 Application of quantum dots modified with different ligands in detection of different pesticides

3 基于熒光量子點探針的分子印跡技術(shù)在農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,農(nóng)藥的種類也隨之增多,常使用的農(nóng)藥有擬除蟲菊酯類農(nóng)藥、有機(jī)磷農(nóng)藥、新煙堿類農(nóng)藥等。這些農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)中廣泛應(yīng)用,在食品安全檢測中一直被人們高度關(guān)注[65]。為了改善基于量子點熒光傳感器的選擇性識別,分子印跡技術(shù)已作為一種常見的方法引入到識別單元中[66]。將量子點和MIP 相結(jié)合,能夠明顯改善MIP 對目標(biāo)物的吸附量,并提高聚合物對目標(biāo)物的特異性識別功能和傳質(zhì)速率,分子印跡熒光傳感器在分子識別領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用[67]。

3.1 在有機(jī)磷農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用

有機(jī)磷農(nóng)藥占全球化學(xué)農(nóng)藥市場的34%以上,并在疾病和害蟲的預(yù)防和控制中發(fā)揮積極作用[68]。有機(jī)磷農(nóng)藥由于顯示出較低的生物蓄積性、快速的生物降解、高毒性和廣泛的目標(biāo)范圍,被廣泛用于農(nóng)業(yè)中,以防治寄生蟲、保護(hù)農(nóng)作物[69-70]。然而,由于較長的半衰期和使用方法的不當(dāng),有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留物會對農(nóng)產(chǎn)品、環(huán)境和水系統(tǒng)造成嚴(yán)重污染[71],因此加強(qiáng)對有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測尤為重要。

TANG 等[72]將對硫磷作為模板分子,APTES和四甲氧基硅烷作為功能單體,Cd Te量子點作為檢測信號,通過反相微乳液聚合反應(yīng)制備了具有分子識別活性的表面分子印跡熒光納米粒子。該聚合物對對硫磷的線性范圍為0.05～1 000μmol·L－1,檢出限為0.218μmol·L－1,水樣中對硫磷的回收率為97.7%～100.59%。LI等[73]開發(fā)了一種新型的分子印跡熒光傳感器,用于樂果的檢測。隨著樂果濃度的增高,熒光猝滅效果增強(qiáng),即二者之間發(fā)生了熒光共振能量轉(zhuǎn)移。在最佳條件下,樂果的濃度在6×10－10～3.4×10－8mol·L－1內(nèi)可獲得良好的線性相關(guān),檢出限為1.83×10－10mol·L－1。該傳感器具有靈敏度高、線性范圍寬、檢出限低、使用方便等特點,已成功用于測定實際樣品中樂果的含量。

3.2 在擬除蟲菊酯類農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥作為一種商業(yè)殺蟲劑,具有毒性低、穩(wěn)定性好和對害蟲具有廣譜抗性等優(yōu)點,在農(nóng)業(yè)使用中越來越廣泛[3]。殘留在水果和蔬菜中的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥,在進(jìn)入人體后會影響中樞神經(jīng)系統(tǒng),繼而引起意識障礙和癲癇的發(fā)作,并且也會使內(nèi)分泌紊亂,嚴(yán)重影響了人們的日常食品安全。因此,加強(qiáng)對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢測十分有必要。LI等[74]采用反相微乳液法合成CdSe＠SiO2＠MIP,并應(yīng)用于水中痕量λ-氟氰菊酯的檢測。結(jié)果表明,λ-氟氰菊酯濃度在0.1～1 000μmol·L－1內(nèi),CdSe＠SiO2＠MIP 的相對熒光強(qiáng)度隨農(nóng)藥濃度的增加呈線性下降的趨勢,檢出限低至3.6μg·L－1。表5總結(jié)了擬除蟲菊酯類農(nóng)藥模板與常用功能單體的作用方式及合成MIP的檢測應(yīng)用。

表5 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥模板與常用功能單體的作用方式及合成MIP的檢測應(yīng)用Tab.5 Action modes of templates of pyrethroid pesticides and common functional monomer and detection applications of synthetic MIP

3.3 在新煙堿類農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用

新煙堿類農(nóng)藥在煙堿結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上修飾而得,包括吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲啉、呋蟲胺等。新煙堿類農(nóng)藥由于具有低毒、高效、低殘留等優(yōu)點,被廣泛用于抑制農(nóng)作物中蟲類的生長繁殖,但其殘留會給人類及生態(tài)環(huán)境造成威脅,因此有必要加強(qiáng)對農(nóng)副產(chǎn)品中、環(huán)境中新煙堿類農(nóng)藥的殘留檢測。量子點與分子印跡技術(shù)相結(jié)合,已被廣泛應(yīng)用于痕量物質(zhì)的檢測中,將其制備成熒光傳感器,不僅可以提高熒光探針的選擇性,還可以同時測定幾種不同的物質(zhì)。

LIU 等[79]開發(fā)出一種基于分子印跡熒光的噻蟲啉快速檢測試紙條。首先將氮摻雜石墨烯量子點(N-GQDs)浸入濾紙中,再將具有噻蟲啉的多巴胺在試紙條表面上自聚合,以形成均勻的聚多巴胺膜(PDA)。除去噻蟲啉模板后,合成的PDA＠MIP可以選擇性地識別噻蟲啉。結(jié)果顯示,噻蟲啉的質(zhì)量濃度為0.1～10 mg·L－1時,與N-GQDs的熒光猝滅程度呈線性相關(guān),檢出限低至0.03 mg·L－1。MARZIYE等[80]通過溶膠-凝膠法在硅碳量子點(Si-CDs)表面形成印跡層,并將合成的光傳感器用于啶蟲脒的選擇性檢測。結(jié)果表明,啶蟲脒農(nóng)藥的線性范圍為7～107 nmol·L－1,檢出限達(dá)到2 nmol·L－1,印跡因子為9.8,該熒光 傳感器(MIP＠Si-CDs)已成功用于實際樣品水和蘋果中啶蟲脒的定量分析中。

4 結(jié)論與展望

將量子點修飾技術(shù)和分子印跡技術(shù)相結(jié)合制備的新型熒光傳感器,不僅可以高特異性、高選擇性地識別目標(biāo)分子,還可以提高檢測的靈敏度。目前,分子印跡熒光傳感器已廣泛應(yīng)用于食品與農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域,起到了保障食品安全、保護(hù)生態(tài)環(huán)境等作用。但不足的是,由于農(nóng)藥的多樣性導(dǎo)致其在分子印跡應(yīng)用方面往往只能針對一個類別的農(nóng)藥,不具廣譜性;另外在分子印跡的應(yīng)用及量子點的開發(fā)中產(chǎn)生較多不確定性,如制備過程中有效去除模板分子技術(shù)還不成熟,性能優(yōu)異的熒光團(tuán)在分子印跡熒光傳感器中的應(yīng)用有待提高。