張 瑩, 楊 靜, 馬躍新, 曹 玲, 黃 青

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 江蘇 南京 210023; 2. 江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,國(guó)家藥品監(jiān)督管理局化學(xué)藥雜質(zhì)譜研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 南京 210019)

近年來,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在肽和蛋白質(zhì)類新型治療藥物的蓬勃發(fā)展以及臨床新型大分子生物標(biāo)志物的深入發(fā)掘中被日益廣泛應(yīng)用[1,2]。應(yīng)用方式的迭代對(duì)生物大分子的分析技術(shù)提出了更高的要求[3]?；诘鞍踪|(zhì)特征肽段檢測(cè)的自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)(bottom up proteomics)是現(xiàn)有研究中具有較高靈敏度與分辨率的蛋白質(zhì)定性定量方法[4,5]。開發(fā)多肽的生物分析方法是極具挑戰(zhàn)的,除了所需的低檢出限外,多肽的非特異性吸附性質(zhì),使其極易在接觸到的材料表面發(fā)生吸附,進(jìn)而導(dǎo)致分析全流程中待測(cè)物的丟失或干擾,給定性和定量分析引入巨大風(fēng)險(xiǎn)[6,7]。例如在蛋白組學(xué)研究的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫搜索中,即使系統(tǒng)中微量肽段的損失或殘留亦可能導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果[8]。而在高靈敏度的多肽定量方法的開發(fā)中,肽段的非特異吸附對(duì)定量分析的線性、準(zhǔn)確度和精密度均有負(fù)面影響[9]。低濃度肽段溶液的吸附性質(zhì)會(huì)更加明顯,表現(xiàn)形式為標(biāo)準(zhǔn)曲線的非線性,最終導(dǎo)致定量限的不必要升高以及方法的重復(fù)性差[10]。

已有一些研究在分子水平上解釋這種吸附行為,然而目前對(duì)其潛在的機(jī)制和相互作用仍然知之甚少。Eeltink等[11]基于分子動(dòng)力學(xué)模擬,提出了一種三相分子機(jī)制解釋肽段從溶液吸附到強(qiáng)相互作用不帶電固定相上的原理。Kristensen等[12]研究了樣品容器對(duì)陽離子多肽吸附的影響,當(dāng)1 μmoL/L肽溶液在硼硅酸鹽或聚丙烯瓶中存儲(chǔ)1 h后,肽段的回收率僅有10%～20%。也有研究通過在溶劑中添加有機(jī)試劑、酸/堿性溶液、表面活性劑、吸附競(jìng)爭(zhēng)劑或調(diào)整流動(dòng)相組成等方法減少這類吸附[13,14]。這些研究論文大多對(duì)一組特定的多肽和/或表面材料進(jìn)行研究,但均未給出可用來預(yù)測(cè)多肽吸附特性的規(guī)律,也未給出通用的解決吸附的方法[15]。

鑒于上述問題,本研究選擇牛血清白蛋白(BSA)作為模型蛋白質(zhì),以其酶解后的肽段作為包含親水性和疏水性多肽的“典型”多肽組樣本。首先通過超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(UPLC-HRMS)的測(cè)定,分析常見多肽理化參數(shù)與上述多肽組的非特異吸附程度的關(guān)聯(lián)性。然后基于超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(UPLC-QQQ-MS/MS)建立對(duì)強(qiáng)吸附肽段吸附程度的評(píng)估方法,從樣品制備至分析測(cè)定建立全過程試驗(yàn)設(shè)計(jì),考察不同材質(zhì)的制備、儲(chǔ)存耗材對(duì)肽段吸附的影響,以及考察不同色譜條件對(duì)肽段殘留的影響,最終提出多肽全流程分析中減少非特異性吸附的通用型策略。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

BSA標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥96%)、二硫蘇糖醇、碘代乙酰胺、亮氨酸腦啡肽均購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。胰蛋白酶購自美國(guó)Progema公司;碳酸氫銨和乙腈購自德國(guó)Merck公司;甲酸購自美國(guó)Thermo Fisher公司;所有實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(Millipore,美國(guó))。

數(shù)據(jù)采集與分析:超高效液相色譜-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(Synapt XS, Waters,美國(guó));超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(6500 plus, AB Sciex,美國(guó)); Unifi操作軟件(Waters,美國(guó))。

電荷性、酸堿性、水溶性、相對(duì)分子質(zhì)量的理論數(shù)值參考網(wǎng)站:https://www.genscript.com.cn/tools/peptide-molecular-weight-calculator; HPLC指數(shù)[16]、等電點(diǎn)(pI)的理論數(shù)值經(jīng)Unifi軟件計(jì)算得到;平均疏水指數(shù)(grand average of hydropathicity, GRAVY)參考網(wǎng)站:https://web.expasy.org/protparam/。數(shù)據(jù)分析以SPSS Statistics 23軟件進(jìn)行。

1.2 樣品制備方法

取10 mg BSA溶于10 mL水中,制得1 mg/mL蛋白儲(chǔ)備液,進(jìn)一步以水稀釋為100 μg/mL的工作液。取200 μL上述工作液于蛋白質(zhì)低吸附離心管中;加入65 μL 500 mmol/L碳酸氫銨和60 μL 50 mmol/L二硫蘇糖醇,于60 ℃水浴加熱60 min對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行還原;放冷至室溫后加入120 μL 50 mmol/L碘代乙酰胺,于暗處反應(yīng)30 min進(jìn)行烷基化;加入100 μg/mL的胰蛋白酶5 μL,于37 ℃水浴中酶解8 h,加入甲酸20 μL終止反應(yīng),12 000 g離心15 min后,取200 μL上清置于蛋白質(zhì)低吸附的進(jìn)樣瓶中作為混合肽段溶液待測(cè)。

1.3 超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜方法參數(shù)

色譜條件:色譜柱采用Waters Acquity Premier Peptide CSH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫為40 ℃;流速為0.25 mL/min;流動(dòng)相A、B兩相分別為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液。洗脫梯度為0～1 min, 1%B; 1～13 min, 1%B～40%B; 13～13.1 min, 40%B～90%B; 13.1～16 min, 90%B; 16～16.1 min, 90%B～1%B; 16.1～20 min, 1%B。進(jìn)樣器溫度10 ℃;進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件:毛細(xì)管電壓3 kV,錐孔電壓30 V,離子源溫度120 ℃,脫溶劑氣溫度450 ℃,錐孔氣流速25 L/h,脫溶劑氣流速800 L/h。電噴霧電離(ESI)源、正離子模式下測(cè)定,MSE模式采集,掃描范圍m/z50～2 000;數(shù)據(jù)采集時(shí)使用亮氨酸腦啡肽校正液進(jìn)行實(shí)時(shí)質(zhì)量校正,以保證采集質(zhì)量數(shù)的準(zhǔn)確性與重復(fù)性。采集后的數(shù)據(jù)使用Unifi軟件處理。

1.4 相對(duì)殘留量的測(cè)定和肽段分級(jí)策略

將1.2節(jié)混合肽段溶液經(jīng)上述條件采集、Unifi軟件分析后,可得BSA酶解后肽段組的實(shí)際肽段組成和每個(gè)肽段的響應(yīng)值A(chǔ)rea(供試品溶液)。

在進(jìn)樣上述供試品溶液后連續(xù)進(jìn)樣3針空白溶劑,以3針空白溶劑中檢測(cè)到的對(duì)應(yīng)肽段響應(yīng)之和Area(Blank 1+Blank 2+Blank 3)計(jì)為該肽段的殘留總量,該肽段的相對(duì)殘留量為肽段的殘留總量與肽段響應(yīng)值的比值。

基于肽段的響應(yīng)與相對(duì)殘留量,可將BSA酶解后的肽段組分為如下四類:Class Ⅰ,響應(yīng)高且無殘留的肽段;Class Ⅱ,響應(yīng)高但有殘留的肽段;Class Ⅲ、Class Ⅳ分別為響應(yīng)低,無吸附和有吸附的肽段。響應(yīng)的高低以是否大于中位數(shù)計(jì),有無殘留以Area(Blank 1+Blank 2+Blank 3)是否有檢出判斷。

1.5 超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜方法參數(shù)

色譜條件:色譜柱采用Waters ACQUITY UPLC BEH C8(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫30 ℃;流速0.4 mL/min;流動(dòng)相A、B兩相分別為0.2%甲酸水溶液和0.2%甲酸乙腈溶液。洗脫梯度為0～2 min, 2%B; 2～5 min, 2%B～60%B; 5～5.1 min, 60%B～90%B; 5.1～8 min, 90%B; 8～8.1 min, 90%B～2%B; 8.1～11 min, 2%B。進(jìn)樣器溫度10 ℃;進(jìn)樣量5 μL。洗針液為90%乙腈水溶液(含0.2%甲酸)。

質(zhì)譜條件:離子化電壓5 500 V;氣簾氣壓力0.14 MPa;離子源溫度500 ℃;噴霧氣、輔助加熱氣壓力0.38 MPa。ESI源正離子模式下測(cè)定,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式采集,12條Class Ⅱ類肽段的離子對(duì)、碰撞能量(CE)、去簇電壓(DP)值經(jīng)Skyline軟件協(xié)助優(yōu)化后結(jié)果如表1所示。

表 1 BSA酶解后Class Ⅱ類肽段的離子對(duì)信息及MRM參數(shù)Table 1 Ion pair information and MRM parameters for Class Ⅱ peptides after enzymatic digestion of bovine serum albumin (BSA) hydrolysis

2 結(jié)果與討論

2.1 肽段的理化性質(zhì)與吸附程度

BSA是牛血清中的球蛋白,包含607個(gè)氨基酸殘基(為66.446 kDa)。本研究以BSA為模型蛋白質(zhì),將其用胰蛋白酶酶解,酶解后的肽段作為包含親水性和疏水性多肽的典型性多肽組樣本。經(jīng)1.3節(jié)方法數(shù)據(jù)采集和分析,結(jié)果顯示,BSA酶解后共測(cè)定到長(zhǎng)度5～28個(gè)氨基酸的肽段共計(jì)50條。將這些肽段的常見理化參數(shù)(包括電荷性、酸堿性、水溶性、肽段長(zhǎng)度、GRAVY、HPLC指數(shù)、pI值和親水性殘基占比)與肽段在液相色譜系統(tǒng)吸附程度(相對(duì)殘留量)及離心管中的吸附程度(肽段溶液在聚丙烯材質(zhì)的離心管中放置24 h后的回收率)進(jìn)行相關(guān)性分析。肽段溶液在液相色譜系統(tǒng)中的相對(duì)殘留量與肽段的HPLC指數(shù)、水溶性和肽段長(zhǎng)度呈顯著相關(guān)(p<0.05);在離心管中的回收率與HPLC指數(shù)和肽段長(zhǎng)度呈極顯著相關(guān)(p<0.01)。但僅有HPLC指數(shù)這一參數(shù)在理化參數(shù)和液相色譜系統(tǒng)中吸附和離心管中吸附的多元線性回歸分析中均呈顯著相關(guān)(p<0.05),相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.223、0.268。

上述結(jié)果提示我們,肽段的HPLC指數(shù)、水溶性和肽段長(zhǎng)度在篩選定量用特征肽段階段雖可用于初步評(píng)估肽段的吸附性質(zhì),但對(duì)肽段吸附程度差異的解釋度仍不足,無法用于準(zhǔn)確預(yù)測(cè)肽段的吸附情況。研究人員需要根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果評(píng)估肽段組實(shí)際吸附情況、探索減小前處理和分析過程中非特異吸附的方案。

2.2 肽段的分類策略

在無法僅使用理化參數(shù)對(duì)肽段吸附性質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)的情況下,篩選用于定量的特征肽段時(shí),需要通過具體實(shí)驗(yàn)對(duì)備選肽段的吸附性質(zhì)和質(zhì)譜響應(yīng)進(jìn)行預(yù)篩選。本研究根據(jù)BSA酶解后肽段組的質(zhì)譜響應(yīng)值、殘留程度設(shè)計(jì)了肽段的四分類策略。以BSA實(shí)測(cè)得的50條酶解肽段為例,分級(jí)為Class Ⅰ類高響應(yīng)、無吸附肽段11條;Class Ⅱ類高響應(yīng)但有吸附肽段12條(如圖1a所示)。Class Ⅰ類是性質(zhì)最優(yōu)異的備選待測(cè)肽段,但在實(shí)際研究中,初始Class Ⅰ類的肽段數(shù)量可能非常有限,且需要進(jìn)一步結(jié)合肽段的特異性、修飾情況、酶解性質(zhì)等進(jìn)行逐級(jí)漏斗式篩除,最終甚至無法直接從中篩得可用的目標(biāo)肽段。因此,通過實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化使肽段最少吸附甚至不吸附,將Class Ⅱ類肽段轉(zhuǎn)化為Class Ⅰ類,可極大地增加蛋白/多肽分析方法開發(fā)的靈活性。

圖 1 (a)肽段的分級(jí)策略及(b)非特異性吸附因素考察和優(yōu)化流程Fig. 1 (a)Grading strategy of peptides (b) nonspecific adsorption factor examination and optimization process

鑒于上述目的,本研究針對(duì)方法開發(fā)全過程中可能產(chǎn)生非特異吸附的影響因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)(圖1b所示),從前處理裝置的選擇與色譜條件優(yōu)化兩個(gè)角度,嘗試減小或消除BSA酶解后Class Ⅱ類肽段的吸附。

2.3 前處理裝置對(duì)肽段回收率的影響與選用

2.3.1離心管對(duì)回收率的影響

將BSA酶解后的混合肽段溶液(1.2節(jié))稀釋至以總蛋白計(jì)5 000 (高)、500(中)、50(低)ng/mL 3個(gè)水平的樣品溶液,分別取800 μL置于3種1.5 mL離心管中(n=3)。離心管種類分別為改性聚丙烯材質(zhì)(PP-LB)的蛋白質(zhì)低吸附離心管和實(shí)驗(yàn)室常用的普通聚丙烯材質(zhì)(PP-A、PP-B)離心管。為模擬酶解環(huán)境,將裝有3個(gè)水平樣品溶液的上述離心管置于37 ℃水浴中,分別在0、5、12、24 h后取出,渦旋混勻后取100 μL溶液至PP-LB進(jìn)樣瓶中,以1.5節(jié)方法測(cè)定,回收率為第xh測(cè)定的峰面積與第0 h測(cè)定峰面積的比值。

結(jié)果顯示:3種不同離心管的平均回收率在中、高水平下均無顯著差異(p=0.51,回收率均大于80%);在低水平下PP-LB管的平均回收率(94.01%)顯著高于低水平下PP-A(82.43%)和PP-B(76.62%)管。此外,PP-LB離心管在所有水平下,對(duì)12條典型有吸附肽段的回收率離散程度(SD)、最小回收率(Min)、回收率小于80%的肽段個(gè)數(shù)(Count), 3項(xiàng)指標(biāo)亦均優(yōu)于PP-A、PP-B管(見圖2a)。離心管的材質(zhì)一般為普通聚丙烯,肽段上若有疏水性殘基則易與其發(fā)生疏水性結(jié)合,這種結(jié)合不會(huì)因振蕩等外力而脫落,易造成肽段的損失。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過改性處理的蛋白質(zhì)低吸附的聚丙烯材質(zhì)離心管表現(xiàn)出良好的普適性的抗吸附性能。有研究人員通過X射線光電子能譜(XPS)分析表明,改性材料表面的氧含量高于普通的聚丙烯管,較高的含氧量可能會(huì)增加管壁的水合程度,從而抑制與肽段的結(jié)合[17]。因此,對(duì)肽段不易吸附的改性聚丙烯離心管是樣品配制、儲(chǔ)存、酶解反應(yīng)容器等步驟中的優(yōu)選。

圖 2 肽段溶液在不同樣品容器中放置24 h后的回收率Fig. 2 Peptides recoveries after 24 h storage in different sample containers Recoveries of Class Ⅱ peptide solutions at three levels (50, 500, 5000 ng/mL) stored in different centrifuge tubes (Fig. 2a) and sample vials (Fig. 2b) after 24 h. PP-LB(LB): lowbind polypropylene tubes or vials; PP-A(A) and PP-B(B): polypropylene tubes from company A and B; PP: polypropylene vials; Glass/G: glass vials; Average: average recovery, %; SD: standard deviation; Min: minimum; Count: the number of peptides solutions with recoveries less than 80%.

此外,我們還觀察到,肽段組在低濃度溶液中發(fā)生吸附的相對(duì)損失顯著高于中、高濃度樣品溶液。以圖2a中典型肽段P7為例,在低、中、高濃度溶液下的回收率分別為69.49%、89.98%、95.40%。這可能歸因于濕固體表面積的結(jié)合能力有限[17],即吸附能力有限,這一現(xiàn)象會(huì)體現(xiàn)為肽段標(biāo)準(zhǔn)曲線的非線性。鑒于低濃度的肽段更容易被吸附這一特性,配制盡可能高濃度的儲(chǔ)備液或在低濃度下合理添加抗吸附劑可提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。

最后,大部分肽段的被吸附情況都與時(shí)間長(zhǎng)度呈正相關(guān),但吸附速率呈現(xiàn)個(gè)體間差異。仍以肽段P7為例,其回收率在3種不同離心管中隨時(shí)間變化情況如圖3a所示。5 h內(nèi)P7在3種離心管中的回收率均大于80%;但隨著放置時(shí)間的增長(zhǎng),5～24 h內(nèi)回收率逐漸下降。因此,在研究中通過酶解條件等前處理方法的優(yōu)化,減少前處理總時(shí)長(zhǎng),降低因反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)導(dǎo)致的肽段損失是十分必要的。

圖 3 不同樣品容器中低濃度肽段P7溶液的 回收率變化趨勢(shì)(n=3)Fig. 3 Trends of the recovery of low concentrations of peptide P7 solutions in different sample containers (n=3)

2.3.2進(jìn)樣瓶對(duì)回收率的影響

待測(cè)肽段溶液轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶后,一般放置一定時(shí)長(zhǎng)后注入U(xiǎn)PLC-QQQ-MS/MS測(cè)定,因此進(jìn)樣瓶中的吸附特征考察亦十分必要。本研究考察了蛋白質(zhì)低吸附聚丙烯、聚丙烯、玻璃3種常見材質(zhì)進(jìn)樣小瓶對(duì)肽段吸附程度的影響。分別取2.3.1節(jié)高、中、低3種水平的樣品溶液200 μL于3種不同材質(zhì)的進(jìn)樣小瓶中(n=3)。將裝有肽段溶液的進(jìn)樣小瓶置于進(jìn)樣盤(10 ℃),于0、2、10、24 h后進(jìn)樣分析,計(jì)算回收率。結(jié)果如圖2b所示:(1)在蛋白質(zhì)低吸附聚丙烯進(jìn)樣瓶中,所有12條肽段均可穩(wěn)定保存24 h(回收率大于80%);回收率的離散程度、最小回收率、回收率小于80%的肽段個(gè)數(shù),3項(xiàng)指標(biāo)亦明顯優(yōu)于玻璃瓶和聚丙烯瓶;(2)在低濃度的情況下,玻璃瓶中僅有5條肽段(P3、P6、P8、P9、P11)的回收率高于80%,其余7條肽段回收率分散分布在0～70%之間。玻璃材質(zhì)中的肽段吸附呈現(xiàn)較大的個(gè)體差異性,這可能與不同肽段殘基帶電性質(zhì)與玻璃表面硅烷醇基團(tuán)的靜電吸附作用不同有關(guān)[11]; (3)未改性的聚丙烯瓶中所有肽段回收率均低于80%,大部分肽段被完全吸附(回收率<10%),故不建議使用。

肽段在進(jìn)樣瓶中的吸附現(xiàn)象與離心管(2.3.1節(jié))中不同的是:(1)上述吸附現(xiàn)象未隨肽段溶液濃度增大而有所改善(見圖2),在本實(shí)驗(yàn)測(cè)試的3個(gè)濃度下未見明顯的吸附飽和;(2)肽段溶液在進(jìn)樣小瓶中被吸附過程非常迅速,大量的肽段快速吸附到玻璃小瓶和塑料小瓶壁上進(jìn)而導(dǎo)致回收率較低。仍以P7為例,其在3種不同進(jìn)樣瓶中的回收率隨時(shí)間變化的趨勢(shì)如圖3b所示。蛋白質(zhì)低吸附進(jìn)樣瓶中肽段可在24 h內(nèi)不被吸附,但玻璃和普通聚丙烯材質(zhì)的進(jìn)樣瓶中肽段組在2 h內(nèi)即被迅速吸附;在2～24 h吸附速率放緩但仍持續(xù)發(fā)生,甚至可被吸附完全。在測(cè)定含有低濃度蛋白質(zhì)的樣品時(shí),大量吸附可造成假陰性的檢測(cè)結(jié)果。因此,由于無法保證進(jìn)樣的即刻性和樣品在進(jìn)樣器中放置時(shí)間的一致性,選擇蛋白質(zhì)低吸附的進(jìn)樣瓶開展實(shí)驗(yàn)是尤為重要的。

2.4 液相色譜系統(tǒng)中肽段殘留的影響與優(yōu)化

2.4.1色譜條件對(duì)殘留影響的考察

2.3節(jié)證明了肽段溶液在前處理接觸材料表面上的吸附會(huì)導(dǎo)致分析中回收率低、重復(fù)性差等問題,而肽段溶液在液相色譜系統(tǒng)中發(fā)生吸附,則會(huì)造成樣品間的交叉污染、假陽性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性差、線性范圍窄等一系列問題[18]。為此,本部分對(duì)5個(gè)常見色譜條件,即色譜柱固定相類型、柱溫,流動(dòng)相的流速、梯度、甲酸的體積分?jǐn)?shù)對(duì)色譜柱上的肽段殘留的影響進(jìn)行了系統(tǒng)考察。初始色譜條件為:柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min，流動(dòng)相A、B兩相分別為0.2%甲酸水溶液和0.2%甲酸乙腈溶液。下述色譜條件優(yōu)化過程中條件在此基礎(chǔ)上單一變化。在液相色譜系統(tǒng)中殘留的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為:將1.2節(jié)制備的混合肽段溶液稀釋至10 μg/mL,以如圖4a所示的流動(dòng)相梯度洗脫,包括有效梯度(2～6 min, 2%B～40%B)和高/低有機(jī)相交替循環(huán)的沖洗梯度來考察色譜柱上殘留。每個(gè)肽段在色譜柱上的殘留量以循環(huán)梯度洗脫出的肽段總峰面積計(jì)(見圖4b)。肽段在色譜柱上的相對(duì)殘留量的計(jì)算方法為高/低有機(jī)相交替循環(huán)的沖洗梯度檢出的峰面積與有效梯度檢出峰面積的比值。

圖 4 (a)用于評(píng)估色譜柱上殘留量的梯度洗脫程序及(b)殘留肽段的典型色譜圖Fig. 4 (a) Gradient program for column carryover evaluation and (b) typical chromatogram for the carryover peptides

肽段在色譜柱上的殘留受到多種因素的影響,我們首先考察了6種不同的色譜柱固定相(具體參數(shù)如表2所示)對(duì)肽段殘留的影響。結(jié)果如圖5所示,12條肽段的相對(duì)殘留量之和在色譜柱上體現(xiàn)為Polar C18>PFP>Cortecs C18+>BEH C18>CSH C18>BEH C8,相對(duì)殘留量最大和最小值之間相差38倍。C8色譜柱對(duì)所有肽段都有較低殘留的特性,CSH C18次之。與小分子相比,肽和蛋白質(zhì)的保留機(jī)制是一個(gè)較為復(fù)雜的過程,并且受到固定相多種相互作用力的影響[13]。推測(cè)C8色譜柱較短的碳鏈降低了鍵合相非極性作用的面積,因此較C18保留更弱，殘留也較低;性能次優(yōu)的CSH C18柱,在填料表面帶電雜化同時(shí),采用高性能表面(HPS)技術(shù),這種有機(jī)/無機(jī)雜化表面技術(shù)能在樣品與不銹鋼色譜柱之間形成屏障表層,減少接觸表面與待測(cè)物質(zhì)的相互作用,使殘留降低。

表 2 色譜柱參數(shù)Table 2 Column characteristics

圖 5 固定相類型對(duì)肽段在色譜柱上殘留的影響Fig. 5 Effect of stationary phase types on peptide carryover on the chromatographic columns BEH-C8-opti is the carryover percentage obtained after optimization.

選擇殘留量中等的Cortecs C18+柱,進(jìn)一步考察流動(dòng)相中的甲酸體積分?jǐn)?shù)(0.1%、0.2%、0.3%),流速(0.2、0.3、0.4 mL/min),柱溫(30、40、50、60 ℃),梯度斜率G1、G2、G3、G4(2～6 min: 2%B～30%B、2%B～40%B、2%B～50%B、2%B～60%B)對(duì)肽段在色譜柱上殘留的影響。結(jié)果顯示,流速、梯度及甲酸的體積分?jǐn)?shù)對(duì)肽段殘留的影響,在12條肽段上呈現(xiàn)一定程度的同趨勢(shì)變化,因此以12條肽段的相對(duì)殘留量均值表征不同條件對(duì)殘留的影響(如圖6)。(1)在0.2、0.3、0.4 mL/min的流速下,肽段殘留量隨流速的增加而顯著降低(見圖6a)。這可能是由于流速增大使柱壓增加,進(jìn)而提高肽段在色譜柱頭的溶解度,使其在柱頭處的殘留減少,故本實(shí)驗(yàn)中0.4 mL/min為優(yōu)選流速。(2)4個(gè)梯度斜率G1、G2、G3、G4對(duì)殘留量的影響考察結(jié)果如圖6b所示,隨著G1～G4梯度的逐漸減緩,殘留量亦隨之降低。較緩梯度可以使大體積的肽段分子在臨界洗脫的有機(jī)溶劑濃度下被沖洗更長(zhǎng)時(shí)間,從而降低殘留[11]。但需指出的是,梯度過緩會(huì)增加分析時(shí)間,所以在研究中可平衡殘留量與分析時(shí)長(zhǎng)、分析通量,根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇梯度。(3)流動(dòng)相中甲酸的體積分?jǐn)?shù)對(duì)殘留的影響如圖6c所示,甲酸的體積分?jǐn)?shù)的增加使殘留量降低,這可能與肽段溶解度的增加或偶極相互作用、離子相互作用的降低有關(guān)[19,20]。但甲酸的體積分?jǐn)?shù)過高(如本例中0.3%較之0.2%)亦會(huì)抑制離子化效率,故應(yīng)權(quán)衡實(shí)際殘留量與靈敏度要求，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖们檫x擇流動(dòng)相內(nèi)加入甲酸的百分含量。

圖 6 不同色譜條件對(duì)肽段溶液在色譜柱上肽段殘留量的影響(n=3)Fig. 6 Effect of different chromatographic conditions on the carryover of peptides on the columns (n=3) a. flow rate; b. gradient; c. percentage of formic acid (FA) in mobile phase; d. column temperature. G1-G4 were the gradients of 2-6 min: 2%B-30%B, 2%B-40%B, 2%B-50%B, and 2%B-60%B.

柱溫對(duì)殘留的影響較為復(fù)雜,呈現(xiàn)出肽段的個(gè)體差異(見圖6d): 12條肽段在30～60 ℃條件下,殘留與柱溫呈現(xiàn)正相關(guān)(如P8)、負(fù)相關(guān)(如P1)，抑或影響微弱(如P6)3類情況。此結(jié)果與Honorine等[14]研究論述的高柱溫有助于降低殘留有所差異。這種肽段個(gè)體化的差異在Cortecs C18+、BEH C18和BEH C83根色譜柱之間表現(xiàn)亦非完全一致。我們推測(cè)這種復(fù)雜現(xiàn)象可能是多因素綜合作用的體現(xiàn):其一,為柱溫、柱頭壓力乃至肽段溶解度的綜合作用。低柱溫下系統(tǒng)壓力更高,柱頭處肽段溶解度增加而吸附減少[21]。其二,柱溫與肽段空間結(jié)構(gòu)乃至與固定相相互作用力的綜合作用。在低溫時(shí),肽段由于分子內(nèi)基團(tuán)的相互作用可能發(fā)生彎曲和折疊;在中等溫度時(shí),隨著溫度升高肽鏈展開,與固定相相互作用的位點(diǎn)增多;在高溫下完全展開時(shí),表現(xiàn)為趨近小分子,即隨著溫度升高保留量(殘留)有所下降;故在低、中、高整個(gè)溫度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出二階拋物線[19]。上述因素隨不同肽段氨基酸組成不同、固定相種類不同而呈現(xiàn)出差異化的結(jié)果,故對(duì)于柱溫的選擇應(yīng)隨待測(cè)肽段的不同做具體分析。本研究中最終使用的是殘留量最低的色譜柱BEH C8,在此色譜柱上有3條肽段不殘留,6條肽段隨柱溫升高殘留量略增,3條肽段隨柱溫升高,殘留量降低,因此選擇30 ℃作為本研究選擇的柱溫。

綜上所述,本研究得出的BEH C8色譜柱、0.4 mL/min流速、G4梯度、30 ℃柱溫、0.2%甲酸的流動(dòng)相作為減少肽段組殘留的最佳色譜條件。結(jié)果如圖5中BEH C8-Opti,將BEH C8色譜柱上的總體殘留由6種色譜柱中最低的0.67%,進(jìn)一步降低至0.17%;原8條有殘留的肽段中,6條降至零殘留,色譜柱上的總殘留量從25.46%降至0.17%(150倍)。此研究極大地拓展了定量肽段可選擇的空間。

2.4.2洗針液對(duì)殘留影響的考察

最后,我們考察了“弱”洗針液10%乙腈水溶液(含0.2%甲酸)、“強(qiáng)”洗針液90%乙腈水溶液(含0.2%甲酸)下,肽段在進(jìn)樣針及管路中的殘留情況。結(jié)果顯示,在排除柱上殘留因素后,使用弱洗針液時(shí),12條肽段的平均相對(duì)殘留量約為0.01%,使用強(qiáng)洗針液時(shí)肽段在進(jìn)樣針上均無殘留。在本實(shí)驗(yàn)研究中,針上殘留相對(duì)柱上殘留為次要因素,可通過強(qiáng)洗針液清洗至無殘留。

3 結(jié)論

非特異性吸附是多肽、蛋白質(zhì)定性研究中假陰性、假陽性以及定量分析中精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍、靈敏度欠佳的主要原因之一[20]。本文提出了一種評(píng)估和減小肽段組非特異吸附的通用型策略,對(duì)于模型蛋白中Class Ⅱ類易吸附的肽段組,通過在標(biāo)準(zhǔn)制備過程中合理選擇前處理裝置以及在液相色譜分析中優(yōu)化色譜條件,極大地提高了回收率并將肽段在液相色譜系統(tǒng)中的殘留降至最低。

本研究為吸附表象與生物大分子理化性質(zhì)的深入研究提供了新的思路;設(shè)計(jì)的優(yōu)化工作流程可為不同理化性質(zhì)多肽和蛋白質(zhì)分析方法開發(fā)提供參考;產(chǎn)生的詳實(shí)數(shù)據(jù)揭示了分析全流程中的吸附風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)和影響因素,在方法開發(fā)和驗(yàn)證過程中,應(yīng)該明確這些風(fēng)險(xiǎn)的存在,并需要采取措施確保它們被消除或最小化。