邱巧麗, 陳曉紅, 潘勝東, 金米聰

(寧波市疾病預防控制中心, 浙江省微量有毒化學物健康風險評估技術研究重點實驗室, 浙江 寧波 315010)

牛蛙屬于大型的食用蛙類,近年已成為我國養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的兩棲動物,逐漸成為人們餐桌上的美食。牛蛙中的雌激素含量是人們普遍關注的食品安全性問題之一。雌激素主要有天然雌激素(雌三醇、雌酮、雌二醇等)和人工合成雌激素(17α-炔二雌醇、己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚、醋酸雙烯雌酚等),天然雌激素廣泛存在于動物體內(nèi),但由于人工合成雌激素具有影響動物性別分化、縮短動物生長周期和增加脂肪沉積等效應,常被不法養(yǎng)殖戶加入飼料中提高飼養(yǎng)效率,造成其在動物體內(nèi)殘留[1-3]。雌激素不易降解,通過食物鏈進入人體后,在極低的含量下(1.0 ng/L)就會對生物體產(chǎn)生明顯的影響[4],具有較強的生物活性和潛在的致癌性[2,3],可能會引發(fā)先兆子癇[5]、肝癌(肝纖維化)[6]、乳腺癌[7,8]等疾病,在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》(中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號)[9]中規(guī)定食品動物禁止使用己二烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚及其鹽、酯。鑒于雌激素的危害性以及在動物性食品中的普遍存在,建立靈敏度高、準確性好、操作簡便的動物性食品中雌激素殘留的分析方法十分必要。

動物性食品中雌激素的常用檢測方法主要有氣相色譜-串聯(lián)質譜法(GC-MS/MS)[10-12]和液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)[13-18]。GC-MS/MS要求目標分析物具有一定的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性,雌激素對熱穩(wěn)定,但不易揮發(fā),需要對其進行衍生化處理以增加揮發(fā)性,衍生步驟繁瑣且難以控制,同時需尋找特異性的衍生化試劑[10-12],對于大批量的樣品檢測耗時長、效率低。而LC-MS/MS則無需進行衍生,能夠實現(xiàn)高通量快速檢測,且假陽性率低,適用于食品基質中痕量藥物殘留的分析,是目前主要的檢測方法之一[13-20]。肉類食品基質成分復雜,需采用預處理技術進行凈化以減少基質效應(ME),常用的技術有固相萃取(SPE)、分散固相萃取、固相微萃取、QuEChERS等[17-23],一般來說,SPE的重復性和精密度要優(yōu)于其他3種萃取技術,更適用于肉類食品中痕量雌激素殘留的準確定量檢測。文獻[20-22]多數(shù)采用吸附性SPE小柱,但該類小柱需經(jīng)活化、上樣、淋洗和洗脫4個程序,操作繁瑣、費時,PRiME HLB通過型SPE小柱大大提高了檢測的便捷性,適用于大樣本的高通量快速篩查,在肉類食品的殘留分析中已有較多的應用[24-26],但未見肉類雌激素測定的應用文獻報道。另外,在同時分析雌激素的多殘留時,色譜流動相改性劑的種類和濃度對雌激素分析靈敏度有顯著影響,文獻報道較多的有低濃度氨水[1,18]和低濃度氟化銨[23],并且認為添加氟化銨可以提高類固醇激素的電噴霧離子化效率和響應值。本研究通過優(yōu)化流動相體系,以0.5 mmol/L氟化銨水溶液-乙腈為流動相,采用PRiME HLB通過型SPE小柱凈化牛蛙中的9種雌激素,采用超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用法(UPLC-MS/MS)建立了快速、靈敏、準確的分析方法,為動物食品中雌激素殘留的準確測定提供了新的思路。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Exion LC-TRIPLE QUAD 6500+超高效液相色譜-三重四極桿質譜儀(美國AB Sciex); N-EVAP 112水浴干浴氮吹儀(美國Organomation公司); Sigma 3-30K高速臺式冷凍離心機(德國Sigma公司); Multi Reax振蕩器(德國Heidolph公司); 20位固相萃取裝置(美國Agilent公司)。

乙腈和甲醇(HPLC級)均購自美國Thermo Fisher公司;乙酸乙酯(HPLC級)購自美國TEDIA公司;乙酸銨、氨水(HPLC級)購自德國Merck公司;氟化銨(純度≥99.99%)購自麥克林公司;有證標準品雌三醇(estriol,E3)、17β-雌二醇(17β-estradiol,β-E)、17α-雌二醇(17α-estradiol,α-E)、17α-炔二雌醇(17α-ethynylestradiol,EE2)、雌酮(estrone,EI)、己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)、己二烯雌酚(dienestrol,DE)、己烷雌酚(hexestrol,HEX)、醋酸雙烯雌酚(dienestrol diacetate,DD)均購自北京振翔科技有限公司,純度均大于99%。

PRiME HLB(200 mg/6 mL)、HLB(200 mg/6 mL)、Silica(500 mg/6 mL)固相萃取柱均購自美國Waters公司,C18(500 mg/6 mL)固相萃取柱購自美國Supelco公司。

50份牛蛙樣品購自寧波當?shù)夭耸袌龊统小?/p>

1.2 樣品前處理

取1.0 g樣品于50 mL離心管中,加入5 mL乙腈渦旋提取5 min, 8 000 r/min冷凍離心5 min,取上清液,直接過PRiME HLB柱。收集流出液,氮吹至干,最后用50%(v/v)乙腈水溶液定容至1.0 mL,過0.22 μm聚四氟乙烯濾膜,UPLC-MS/MS檢測。

1.3 溶液配制

標準溶液:分別準確稱取9種雌激素標準品1.0 mg于9個10 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,配成質量濃度為100.0 mg/L的標準儲備液,于-20 ℃避光保存。分別準確吸取上述9種標準儲備液1.0 mL于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得質量濃度均為10.0 mg/L的9種混合標準中間溶液。

系列標準工作溶液:取適量10.0 mg/L的9種混合標準中間溶液,用50%(v/v)乙腈水溶液稀釋定容,制得質量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列標準工作溶液。

基質匹配標準工作溶液:取1.0 g空白樣品,按1.2節(jié)步驟進行前處理,得到空白基質溶液,再分別加入適量的10.0 mg/L 9種混合標準中間溶液,然后再用50%(v/v)乙腈水溶液稀釋定容,制得質量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、l0.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列基質匹配標準工作溶液。

1.4 色譜-質譜條件

色譜條件 色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動相A為0.5 mmol/L氟化銨水溶液,流動相B為乙腈,流量為0.3 mL/min,柱溫35 ℃,進樣體積為2 μL。梯度洗脫:0～0.5 min, 3%B; 0.5～2.0 min, 3%B～40%B; 2.0～8.0 min, 40%B～95%B; 8.0～10.9 min, 95%B; 10.9～11.0 min, 95%B～3%B; 11.0～12.0 min, 3%B。

質譜條件 霧化器壓力:344.7 kPa (50 psi);輔助器壓力:344.7 kPa (50 psi);氣簾氣壓力:241.3 kPa (35 psi);電噴霧電壓:+/- 4 500 V;離子源溫度:500 ℃;檢測方式:電噴霧正負離子切換模式(ESI+/ESI-),多反應監(jiān)測(MRM)。其他質譜參數(shù)見表1。

表 1 9種目標化合物的質譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of the nine target compounds

2結果與討論

2.1 流動相的優(yōu)化

文獻[3]報道,水-乙腈作為流動相比水-甲醇更有利于激素的離子化,本研究選用水-乙腈體系進行進一步優(yōu)化,著重考察了不同濃度及種類的流動相改性劑(如乙酸銨、氨水和氟化銨)加入到水-乙腈體系作為混合流動相對9種雌激素的分離效果和靈敏度的影響。結果表明,使用不同濃度的乙酸銨水溶液-乙腈體系,目標化合物靈敏度均較差,且雌醇類化合物在20.0 μg/L質量濃度下不能被檢出,不能滿足痕量檢測的要求。使用0.1%(v/v)氨水溶液-乙腈體系,負離子模式下檢測化合物的靈敏度均有了較明顯提高,可見NH3結合H的能力更強,使其酚羥基上的H脫去呈負離子,有利于雌激素電離成離子狀態(tài),增強其信號響應,提高靈敏度。但實驗結果顯示,雌醇類化合物的信號強度較雌酚類化合物弱,可能是因為HEX、DES和DE均含有兩個酚羥基,而雌醇類和雌酮只有一個酚羥基。采用0.5 mmol/L氟化銨水溶液-乙腈體系,9種雌激素的靈敏度(以信號強度計)均提高了一個數(shù)量級,結果(以HEX為例)見圖1, 20.0 μg/L的HEX標準溶液在10 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈體系、0.1%(v/v)氨水溶液-乙腈體系和0.5 mmol/L氟化銨水溶液-乙腈體系作為流動相條件下,目標化合物的靈敏度(以信號強度計)分別為103、104和105,說明氟化銨可在電噴霧負離子模式下為雌激素類化合物提供更好的信號,這可能是因為氟化銨中的F電負性較強,更易與H結合。而對于醋酸雙烯雌酚,氟化銨在水溶液中成弱酸性,更利于其得到H變成[M+H]+在正離子模式下檢測。

圖 1 HEX在不同流動相體系下的MRM圖Fig. 1 MRM chromatograms of hexestrol in different mobile phase systems a. 10 mmol/L ammonium acetate solution-acetonitrile; b. 0.1%(v/v) aqueous ammonia solution-acetonitrile; c. 0.5 mmol/L ammonium fluoride solution-acetonitrile.

2.2 提取溶劑的篩選

DD結構式中沒有羥基但帶有酯基,其他8種雌激素的化學結構中均帶有一個或多個羥基基團,根據(jù)相似相溶原理,其在極性溶劑中的溶解度應較為理想,本實驗根據(jù)文獻考察了甲醇[18]、乙腈[13]和乙酸乙酯[27]3種溶劑對9種目標化合物的提取效率影響。實驗結果見圖2。結果表明,當提取溶劑依次為乙腈、乙酸乙酯、甲醇時,9種目標化合物中提取效率為70%～110%的數(shù)量逐漸減少。當乙腈作為提取溶劑時,9種雌激素的提取率均高于甲醇和乙酸乙酯,且提高15%～40%。結果表明乙腈作為提取溶劑優(yōu)于甲醇和乙酸乙酯。因此,本實驗選擇乙腈作為牛蛙中雌激素的提取溶劑。

圖 2 不同溶劑的提取效率對比(n=3)Fig. 2 Comparison of extraction efficiencies with different solvents (n=3)

2.3 固相萃取柱的優(yōu)化

根據(jù)文獻[20-22], HLB、C18、Silica固相萃取柱被應用于類固醇化合物的基質凈化中。PRiME HLB通過型SPE小柱相較這3種SPE小柱,可大幅減少操作時間,有效提高檢測效率。因此,本研究重點考察了HLB、C18、Silica和PRiME HLB柱4種不同的SPE小柱對牛蛙中9種雌激素殘留檢測的基質凈化影響。凈化過程如下。

HLB SPE柱:上清液氮吹至干,用3 mL 20%(v/v)乙腈水溶液溶解,過預先活化好的HLB柱,3 mL水淋洗,3 mL乙腈-甲醇(1∶1, v/v)洗脫;C18SPE柱:上清液氮吹至干,用3 mL (v/v)乙腈水溶液溶解,過預先活化好的C18柱,3 mL水淋洗,3 mL乙腈洗脫;Silica SPE柱:上清液氮吹至干,用3 mL (v/v)乙腈水溶液溶解,過預先活化好的Silica柱,3 mL正己烷淋洗,3 mL乙腈洗脫;PRiME HLB SPE柱:上清液直接過PRiME HLB柱。分別收集流出液,氮吹至干,最后用50%(v/v)乙腈水溶液定容至1.0 mL,過0.22 μm聚四氟乙烯濾膜,UPLC-MS/MS檢測。比較4種SPE小柱凈化后牛蛙中9種雌激素的加標回收率,結果見圖3和圖4。

圖 3 不同固相萃取柱的凈化性能對比(n=3)Fig. 3 Comparison of purification performance with different SPE columns (n=3)

圖 4 不同固相萃取柱凈化時9種雌激素的加標回收率占比Fig. 4 Ratios of spiked recoveries of the nine estrogens purification with different SPE columns

由圖3和圖4可知,未經(jīng)凈化處理的牛蛙樣品,9種目標化合物的回收率在70%～125%之間的占比為77.8%, DES存在較強的基質增強效應,DD存在較強的基質抑制效應,兩個化合物的回收率不能滿足檢測要求。經(jīng)Silica固相萃取柱凈化后,DD的回收率略有提升,但其他雌激素的回收率下降明顯,9種目標化合物回收率均低于70%,可見硅膠對雌激素的吸附保留作用弱,不適合用做雌激素的凈化材料。經(jīng)HLB固相萃取柱凈化后,DD的回收率略有提高,DES的回收率下降了35%,但是其他雌激素的回收率反而略有下降,通過對比實驗發(fā)現(xiàn)HLB小柱對DES、DE、HEX這3種雌激素的吸附力較強,單純用乙腈無法洗脫,必須用乙腈-甲醇(1∶1, v/v)才可以洗脫,可能HLB小柱對雌激素吸附能力較強無法被完全洗脫,導致樣品凈化過程中目標分析物流失。經(jīng)C18固相萃取柱凈化后,DD的回收率有了明顯提升,回收率提高30%, DES的回收率下降35%,可見C18柱可改善DE的基質增強效應和DD的基質抑制效應,但其他雌激素的回收率也略有不同程度的下降,使得回收率在70%～125%之間的化合物占比未提高。經(jīng)PRiME HLB柱凈化后,雖然部分化合物的回收率略微下降,但是所有化合物的回收率均在70%～125%之間,且DD的回收率從47%提高到了74%,有效改善了其基質抑制效應,同時,DES的回收率從180%降低到了123%,有效降低了其基質增強效應。因此,本實驗選擇PRiME HLB固相萃取柱作為凈化材料。

2.4 基質效應考察

ME=(基質匹配工作溶液中各目標物的峰面積-標準工作溶液中各目標物的峰面積)/標準工作溶液中各目標物的峰面積。ME的正負分別表示基質增強效應和基質抑制效應。當│ME│小于20%時,表示弱基質效應,當│ME│為20%～50%時,表示中等基質效應,當│ME│大于50%時,表示強基質效應?？瞻讟悠方?jīng)提取后,加標可得10 μg/L的基質匹配工作溶液,將其與同濃度的標準工作溶液分別進行UPLC-MS/MS檢測,計算基質效應。結果表明,77.8%的化合物表現(xiàn)出弱基質效應,且均為弱基質抑制效應。DES和DD表現(xiàn)出強基質效應,其中DES的ME為63.9%,表現(xiàn)出強基質增強效應,DD的ME為-67.4%,表現(xiàn)出強基質抑制效應。經(jīng)PRiME HLB固相萃取柱凈化后,計算固相萃取后的基質效應(見圖5),結果表明,DES的ME為39.8%, DD的ME為-25.7%,其強基質效應有了明顯減弱,但還是存在中等基質效應,因此本實驗采用基質匹配標準曲線,以降低基質效應對目標化合物的影響。

圖 5 牛蛙中9種雌激素在凈化前后的基質效應Fig. 5 Matrix effects of the nine estrogens in bullfrogs before and after purification

2.5 方法學考察

2.5.1線性關系、檢出限和定量限

測定1.3節(jié)配制的系列基質匹配混合標準溶液,以各個雌激素的峰面積為縱坐標,質量濃度為橫坐標,考察9種雌激素的線性關系。結果顯示,9種雌激素在相應的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關系,相關系數(shù)(R)≥0.995 3 (見表2)。采用空白樣品加標的方式確定9種雌激素的方法檢出限(S/N=3)為0.17～0.33 μg/kg,方法定量限(S/N=10)為0.5～1.0 μg/kg(見表2)。質量濃度為10 μg/L的9種目標化合物的MRM圖見圖6。

表 2 9種化合物的線性方程、相關系數(shù)、檢出限、定量限、加標回收率和精密度(n=6)Table 2 Linear equations, correlation coefficients (R), LODs, LOQs, spiked recoveries and RSDs (n=6) of the nine compounds

圖 6 9種目標化合物的MRM圖Fig. 6 MRM chromatogram of the nine compounds

2.5.2加標回收率和精密度

以空白牛蛙樣品為基質,添加低(2.0 μg/kg)、中(10.0 μg/kg)、高(80.0 μg/kg) 3個水平的混合標準溶液,按1.2節(jié)步驟進行樣品前處理,采用UPLC-MS/MS檢測。每個加標水平做6次平行實驗,結果顯示,9種雌激素在低、中、高3個加標水平下的回收率(n=6)分別為107.4%～125.3%、67.0%～123.3%、65.1%～128.2%, RSD(n=6)分別為2.8%～11.3%、1.9%～6.9%、4.8%～17.6%,見表2。其中DES在3個水平下的加標回收率均較高,可能原因是基質對其增強作用比較顯著,其線性方程的相關系數(shù)較其他雌激素低,且檢出限也較高,一定程度說明基質效應對DES影響較大;中高濃度DD的加標回收率較低,可能原因是正離子監(jiān)測模式下,弱酸性的氟化銨提供H+的能力在高濃度系列下優(yōu)勢不那么明顯。

2.6 樣品測定

應用本研究建立的方法對市售50份牛蛙樣品中的9種雌激素殘留進行檢測,結果表明,有HEX、EI、DE檢出的樣品份數(shù)分別為9、6、3份,其中有3份樣品同時檢測出HEX、EI、DE,有3份樣品同時檢測出HEX、EI,有3份樣品只檢測出HEX。HEX、EI、DE三者的檢出量分別為0.5～0.8、0.5～0.7、0.6～0.8 μg/kg,含量較低,均接近定量限。

3 結論

本文通過篩選提取溶劑,優(yōu)化流動相體系,對比研究HLB、C18、Silica、PRiME HLB等4種不同類型固相萃取小柱的基質凈化效應,建立了基于PRiME HLB通過型固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜同時測定牛蛙中9種雌激素的分析方法,并將方法應用于50份市售牛蛙樣品中雌激素含量的檢測。建立的SPE-UPLC-MS/MS同時測定牛蛙中9種雌激素殘留的分析方法,具有操作簡便、高效、準確、靈敏的特點,適合于實驗室大批量樣品的快速檢測。