榮杰峰, 許美珠, 張志勇, 鄒 強(qiáng), 徐敦明,鐘堅(jiān)海, 張松艷, 樂(lè)有東, 佘紫文
(1. 泉州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心, 福建 泉州 362000; 2. 廈門海關(guān)技術(shù)中心, 福建 廈門 361000)
棉隆,化學(xué)名稱為3,5-二甲基-1,3,5-噻二嗪-2-硫酮,是一種室溫下穩(wěn)定的晶體固體,具有熏蒸作用,常用于控制土壤真菌、殺蟲(chóng)、殺菌和除草,能有效殺滅根結(jié)線蟲(chóng)、土壤害蟲(chóng)、雜草及多種土傳病害,從而獲得潔凈及健康的土壤;棉隆是替代溴甲烷較理想的一種土壤處理劑[1,2]。棉隆在酸性土壤中會(huì)緩慢分解釋放異硫氰酸甲酯、甲胺、二硫化碳和硫化氫,通過(guò)土壤中的空間向上擴(kuò)散,殺死與之接觸的生物[3]。在經(jīng)棉隆處理后的土壤中種植農(nóng)產(chǎn)品時(shí),會(huì)引發(fā)食品中殘留從而造成對(duì)人體的危害,各國(guó)政府均制定了棉隆的殘留限量進(jìn)行監(jiān)控。日本和歐盟對(duì)棉隆的殘留定義都是以異硫氰酸甲酯來(lái)計(jì),日本對(duì)薯類、蔬菜、水果、香草類等植物源性食品中制定了50余個(gè)殘留限量值,殘留限量范圍為0.01~2 mg/kg,歐盟對(duì)谷物、堅(jiān)果、茶葉、香辛料、蔬菜、水果等植物源性食品中制定了280余個(gè)殘留限量,殘留限量范圍為0.02~0.15 mg/kg。目前,棉隆在我國(guó)的番茄、草莓、姜和菊科4種作物上有登記,我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中棉隆的殘留定義為棉隆及其代謝物異硫氰酸甲酯之和,并制定了番茄和姜中的臨時(shí)限量為0.02 mg/kg和2 mg/kg[4]。因此,為確保食品質(zhì)量安全,開(kāi)發(fā)植物源性食品中棉隆及異硫氰酸甲酯測(cè)定方法具有極其重要的作用。
文獻(xiàn)報(bào)道的棉隆及異硫氰酸甲酯測(cè)定方法主要有液相色譜(LC)測(cè)定棉隆[5];使用氣相色譜(GC)[6]、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)[6]、LC[7]和氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(GC-MS/MS)[8]測(cè)定異硫氰酸甲酯;相關(guān)方法僅測(cè)定棉隆和異硫氰酸甲酯中的一種。此外,馮義志等[9,10]建立了采用LC測(cè)定番茄和土壤中棉隆、GC-MS測(cè)定番茄和土壤中異硫氰酸甲酯的方法;徐峰等[11]建立了采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定草莓中棉隆、GC測(cè)定草莓中異硫氰酸甲酯殘留的檢測(cè)方法。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中均未實(shí)現(xiàn)使用一種前處理方法和同一種儀器設(shè)備對(duì)棉隆及異硫氰酸甲酯同時(shí)測(cè)定。因此,本研究擬使用一種前處理方法和同一種儀器設(shè)備,建立簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的植物源性食品中棉隆及其代謝物異硫氰酸甲酯殘留量的同時(shí)檢測(cè)方法。近年來(lái),相較于常規(guī)的單四極桿GC-MS儀,氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀因其抗干擾能力強(qiáng)和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于蔬菜、水果、糧谷、茶葉、藥材中農(nóng)藥、獸藥、非法添加物等的檢測(cè)中[12-16]。
本研究植物源性食品中殘留的棉隆及其代謝物異硫氰酸甲酯經(jīng)乙酸乙酯提取,提取液經(jīng)分散固相萃取凈化,建立了棉隆及其代謝物異硫氰酸甲酯的氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)方法。建立的方法操作簡(jiǎn)單便捷,能滿足植物源性食品中殘留的棉隆及其代謝物異硫氰酸甲酯的檢測(cè)要求。
Agilent 7890A-7000B氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司):配備電子轟擊(EI)源。無(wú)水硫酸鎂(MgSO4)、氯化鈉、丙酮、正己烷和乙醚均為分析純,購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙酸乙酯(色譜純)購(gòu)于美國(guó)TEDIA公司。乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA, 40~60 μm)、石墨化炭黑(GCB, 40~120 μm)和十八烷基鍵合硅膠(C18, 40~60 μm)購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。棉隆(C5H10N2S2,純度99.8%)和異硫氰酸甲酯(C2H3NS,純度98.0%)購(gòu)于廣州佳途科技股份有限公司。
準(zhǔn)確稱取適量棉隆和異硫氰酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品,分別用乙酸乙酯配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;分別吸取適量的上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用乙酸乙酯配制成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。
吸取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,用空白樣品提取液(空白樣品按1.3節(jié)處理)稀釋成質(zhì)量濃度為5、10、50、200和1 000 μg/L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。
所有標(biāo)準(zhǔn)溶液均避光于-18 ℃以下保存。
1.3.1蔬菜和水果
稱取10 g(精確至0.01 g)試樣于50 mL塑料離心管中,加入4 g氯化鈉、10 mL乙酸乙酯,渦旋振蕩提取5 min; 4 000 r/min離心3 min。準(zhǔn)確吸取1.5 mL上清液于2 mL聚丙烯離心管中,加入50 mg GCB、50 mg PSA、50 mg C18和50 mg MgSO4,渦旋混合1 min, 14 000 r/min離心3 min,取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,待測(cè)。
1.3.2茶葉、谷物、堅(jiān)果和香辛料
稱取5 g(精確至0.01 g)試樣于50 mL塑料離心管中,加入10 mL乙酸乙酯,渦旋振蕩提取5 min; 4 000 r/min離心3 min。準(zhǔn)確吸取1.5 mL上清液于2 mL聚丙烯離心管中,谷物和堅(jiān)果提取液中加入50 mg GCB、50 mg PSA、50 mg C18和50 mg MgSO4,茶葉和香辛料提取液中加入125 mg GCB、50 mg PSA、50 mg C18和50 mg MgSO4,渦旋混合1 min, 14 000 r/min離心3 min,取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,待測(cè)。
DB-17MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)柱;柱箱升溫程序:35 ℃保持4 min,然后以10 ℃/min升溫至50 ℃,保持2 min;再以50 ℃/min升溫至230 ℃,保持2 min;最后以25 ℃/min升溫至280 ℃,保持0 min;載氣:氦氣,純度≥99.999%,恒流模式,流量為1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度:280 ℃;進(jìn)樣量:1 μL;進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣。
電子轟擊源:70 eV;離子源溫度:230 ℃;傳輸線溫度:280 ℃;溶劑延遲:4.2 min;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式:棉隆和異硫氰酸甲酯分別選擇一個(gè)定量離子對(duì)、一個(gè)定性離子對(duì),其保留時(shí)間、定量離子對(duì)、定性離子對(duì)和碰撞能量見(jiàn)表1。
表 1 棉隆和異硫氰酸甲酯的保留時(shí)間、定量離子對(duì)、定性離子對(duì)和碰撞能量Table 1 Retention times, quantitative ion pairs, qualitative ion pairs, and collision energies (CEs) of dazomet and methyl isothiocyanate
2.1.1儀器的選擇
在已有研究基礎(chǔ)上,嘗試了使用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)植物源性食品中棉隆及其代謝物異硫氰酸甲酯進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。結(jié)果表明使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)時(shí)棉隆的響應(yīng)較好,但異硫氰酸甲酯無(wú)響應(yīng);使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)時(shí),棉隆和異硫氰酸甲酯的響應(yīng)均較好,但進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)容易受樣品基質(zhì)干擾,色譜峰容易出現(xiàn)峰展寬、峰拖尾和干擾峰等現(xiàn)象,導(dǎo)致定性困難,方法準(zhǔn)確性無(wú)法滿足要求;只有在氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀上棉隆和異硫氰酸甲酯的響應(yīng)均良好,實(shí)際樣品檢測(cè)準(zhǔn)確度、精密度等均可滿足要求,最終確定使用氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)植物源性食品中棉隆及其代謝物異硫氰酸甲酯進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。
2.1.2色譜柱的選擇
從文獻(xiàn)[9-11]可知,可使用非極性、低流失的色譜柱DB-1(30 m×0.25 mm×0.25 μm)或者中等極性、低流失色譜柱TG-1701MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)分離異硫氰酸甲酯。實(shí)驗(yàn)比較了DB-5MS、DB-17MS、DB-1701 3種色譜柱對(duì)棉隆及異硫氰酸甲酯的分離效果,其中DB-5MS色譜柱為非極性色譜柱,極性與DB-1色譜柱相當(dāng);DB-17MS色譜柱為中等極性色譜柱;DB-1701色譜柱為低/中等極性色譜柱,其固定相及其極性和TG-1701MS色譜柱相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明棉隆和異硫氰酸甲酯在DB-5MS、DB-17MS、DB-1701 3種色譜柱上均可良好分離,主要區(qū)別在于DB-5MS色譜柱對(duì)異硫氰酸甲酯的保留能力較差,導(dǎo)致異硫氰酸甲酯在DB-5MS柱上出峰時(shí)間相對(duì)DB-17MS、DB-1701更早,從而可能受到溶劑峰的影響;最終,選擇DB-17MS柱作為本方法的色譜柱。
2.1.3質(zhì)譜條件的優(yōu)化
選擇10.0 mg/L的棉隆和異硫氰酸甲酯乙酸乙酯溶液進(jìn)行MS全掃描,選擇響應(yīng)較高的離子作為母離子,確定棉隆的母離子為89.0和162.1,異硫氰酸甲酯的母離子為73.1和71.9。再對(duì)相應(yīng)母離子進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描,其中棉隆響應(yīng)較好的MRM離子對(duì)為162.1>89.0, 89.0>44.1, 162.1>44.1;異硫氰酸甲酯響應(yīng)較好的MRM離子對(duì)為73.1>71.9, 71.9>45.0, 73.1>45.0;由于162.1>44.1和73.1>45.0的響應(yīng)相對(duì)較差且容易受到基質(zhì)的影響,所以放棄選擇這兩個(gè)離子對(duì)作為定性離子對(duì)。最終確定棉隆和異硫氰酸甲酯的定量及定性離子對(duì)見(jiàn)表1。0.1 mg/L基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中棉隆和異硫氰酸甲酯的提取離子色譜圖見(jiàn)圖1。
圖 1 棉隆和異硫氰酸甲酯的提取離子色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of dazomet and methyl isothiocyanate
2.2.1提取溶劑的選擇
實(shí)驗(yàn)選擇正己烷、丙酮、乙酸乙酯、乙醚配制1.0 mg/L棉隆和異硫氰酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)分析,結(jié)果表明棉隆在以上溶劑中的響應(yīng)和峰形均較好,而異硫氰酸甲酯在乙酸乙酯和丙酮為溶劑時(shí)峰形較好,在正己烷和乙醚為溶劑時(shí)峰展寬、峰形差,所以前處理提取溶劑選擇丙酮或者乙酸乙酯比較合適。因丙酮的極性較強(qiáng),容易把更多的葉綠素等干擾物質(zhì)提取出來(lái),且丙酮相比乙酸乙酯在水中的溶解度更高,為降低后續(xù)凈化處理的難度,最終選擇使用乙酸乙酯為提取溶劑。
2.2.2凈化試劑的選擇
實(shí)驗(yàn)考察了GCB、C18、PSA、MgSO44種物質(zhì)對(duì)棉隆和異硫氰酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行吸附后的回收率。分別稱取100 mg GCB、C18、PSA、MgSO4,對(duì)1 mL的棉隆和異硫氰酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 mg/L)吸附情況進(jìn)行考察。試驗(yàn)結(jié)果表明,PSA、C18、GCB、MgSO4對(duì)棉隆和異硫氰酸甲酯的吸附回收率都在90%~110%之間;說(shuō)明4種物質(zhì)均不會(huì)對(duì)棉隆和異硫氰酸甲酯造成吸附,因此,本方法使用GCB、PSA、C18除去提取液中的雜質(zhì)、MgSO4除去提取液中的水分。其中GCB對(duì)樣品中極性和非極性的有機(jī)化合物干擾物有極高的吸附力,對(duì)去除植物中色素有十分顯著的效果;PSA對(duì)植物源樣品基質(zhì)中的有機(jī)酸、色素、糖類等都有較好的凈化作用;C18可去除如揮發(fā)油、萜類、脂類等非極性化合物。
2.2.3吸附劑用量的優(yōu)化
植物源樣品種類繁多,基質(zhì)也比較復(fù)雜,所以使用分散固相萃取凈化時(shí)需要考慮兩種或多種吸附凈化劑,以較好地除去樣品中的葉綠素、脂類和糖類等干擾儀器分析的雜質(zhì)。實(shí)驗(yàn)復(fù)配了含量不同的3組吸附劑組合對(duì)代表性基質(zhì)蔬菜(韭菜)、水果(橙)、谷物(大米)、油料(杏仁)、茶葉和香辛料(孜然)空白樣品的0.20 mg/kg加標(biāo)樣提取液進(jìn)行凈化;提取凈化實(shí)驗(yàn)步驟按照1.3節(jié)進(jìn)行,考察不同組合吸附劑的凈化效果和添加回收率。如圖2所示,3種吸附劑組合下,異硫氰酸甲酯在6種基質(zhì)中的回收率均在80%~110%之間,均可滿足分析方法要求。棉隆在6種基質(zhì)中的回收率均非常高,表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng),隨著凈化試劑用量加大,回收率逐步下降但未降至滿足分析方法要求的水平;為了提高分析方法的準(zhǔn)確性,仍然需要采取其他方式補(bǔ)償棉隆的基質(zhì)效應(yīng)。綜合考慮凈化效果、成本、便捷性、儀器分析時(shí)基線干擾,選擇50 mg PSA+50 mg GCB+50 mg C18+50 mg MgSO4組合對(duì)蔬菜、水果、谷物和堅(jiān)果進(jìn)行凈化,對(duì)于色素含量較多的茶葉和香辛料,適當(dāng)加大GCB的用量,選擇50 mg PSA+125 mg GCB+50 mg C18+50 mg MgSO4組合對(duì)茶葉和香辛料進(jìn)行凈化。
圖 2 不同吸附劑組合對(duì)加標(biāo)空白樣品提取回收率的影響Fig. 2 Effect of different sorbents on the extraction recoveries of pesticides spiked in the blank sample
在吸附劑用量的優(yōu)化中可知,棉隆表現(xiàn)出強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng),且通過(guò)分散固相萃取凈化的方式無(wú)法將其回收率降至合理范圍,因此有必要對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行探究,以確保分析方法的準(zhǔn)確性。試驗(yàn)按照1.3節(jié)的前處理方法制備空白基質(zhì)溶液,按照1.2節(jié)的方法配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液上機(jī)檢測(cè),按以下公式對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估:ME=[(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率)-1]×100%。|ME|<20%為弱基質(zhì)效應(yīng),可忽略而無(wú)需采取補(bǔ)償措施;20%≤|ME|≤50%為中等程度基質(zhì)效應(yīng),|ME|>50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng),須采取措施補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)[17,18]。異硫氰酸甲酯和棉隆的基質(zhì)效應(yīng)如圖3所示,其中異硫氰酸甲酯在16種基質(zhì)中基質(zhì)效應(yīng)均較小(ME值為2.5%~13.6%),無(wú)需采用措施補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng);但棉隆表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)(ME值240.3%~331.2%),需采取措施補(bǔ)償,本研究采用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)法進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)的補(bǔ)償。
圖 3 不同樣品中棉隆和異硫氰酸甲酯的基質(zhì)效應(yīng)Fig. 3 Matrix effects of dazomet and methyl isothiocyanate in different samples
我國(guó)關(guān)于植物源性食品農(nóng)藥殘留檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.113-2018[19]及GB 23200.121-2021[20]等都采用了基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的定量方法進(jìn)行定量分析,然而針對(duì)多種多樣的樣品基質(zhì),在配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的過(guò)程中,大大降低了檢測(cè)效率。為提高檢測(cè)效率,本研究對(duì)代表性基質(zhì)的選擇進(jìn)行探討[21]。從圖3可知,油麥菜中棉隆的基質(zhì)效應(yīng)在16種基質(zhì)中接近于中位值,按照以下公式計(jì)算不同基質(zhì)相對(duì)油麥菜的基質(zhì)效應(yīng):相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)=[(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/油麥菜基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)-1]×100%,不同樣品中棉隆相對(duì)于油麥菜的基質(zhì)效應(yīng)如圖4所示,結(jié)果表明棉隆在15種基質(zhì)中相對(duì)油麥菜的基質(zhì)效應(yīng)均小于20%,表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)。因此,可以選擇油麥菜為代表性基質(zhì)配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液以補(bǔ)償棉隆的基質(zhì)效應(yīng),從而有效校正待測(cè)農(nóng)藥在其他基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng),通過(guò)此方法在保證定量準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的前提下,提高檢測(cè)效率。
圖 4 不同樣品中棉隆的相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)Fig. 4 Relative matrix effects of dazomet in different samples
用油麥菜空白基質(zhì)溶液配制質(zhì)量濃度為5、10、50、200和1 000 μg/L的系列棉隆和異硫氰酸甲酯基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按1.4節(jié)儀器條件進(jìn)行檢測(cè),以棉隆和異硫氰酸甲酯的質(zhì)量濃度(X, μg/L)為橫坐標(biāo),以棉隆和異硫氰酸甲酯的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,得到線性方程和相關(guān)系數(shù)(r);在空白樣品溶液中添加適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液后上機(jī)測(cè)定,以S/N=10確定定量限(LOQ),相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。
表 2 棉隆和異硫氰酸甲酯的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和定量限Table 2 Regression equations, correlation coefficients (r), linear ranges, and limits of quantification (LOQs) of dazomet and methyl isothiocyanate
分別對(duì)大白菜、韭菜、豇豆、油麥菜、茄子、姜、芹菜、馬鈴薯、橙、獼猴桃、西紅柿、辣椒、大米、茶葉、杏仁和孜然空白樣品進(jìn)行了不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)添加回收試驗(yàn),每個(gè)加標(biāo)水平做6個(gè)平行。棉隆及其代謝物異硫氰酸甲酯在這些植物源樣品中不同添加水平的平均回收率和精密度見(jiàn)表3。
表 3 棉隆和異硫氰酸甲酯在不同樣品中4個(gè)水平下的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of dazomet and methyl isothiocyanate spiked in different sample matrices at four spiked levels (n=6)
用本方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室日常樣品大白菜、韭菜、豇豆、油麥菜、茄子、姜、芹菜、馬鈴薯、橙、獼猴桃、西紅柿、辣椒、大米、茶葉、杏仁和孜然各6個(gè)進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果均為未檢出。
本文建立了氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定植物源性食品中棉隆及其代謝物異硫氰酸甲酯殘留量的檢測(cè)方法。與已有方法相比,本方法使用同一種前處理方法、同一臺(tái)儀器完成對(duì)植物源性食品中殘留的棉隆及其代謝物異硫氰酸甲酯的檢測(cè),該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確度好,能滿足植物源性食品中殘留的棉隆及其代謝物異硫氰酸甲酯的檢測(cè)需求,可為植物源性食品中殘留的棉隆及其代謝物異硫氰酸甲酯風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控提供有效的技術(shù)支持。