李梅梅，歐水平，劉欣旸，趙 云，宋寶寶，張 力，王 森，楊 明,3

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義 563099；3.江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004)

金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)為蘭科石斛屬植物，具有益胃生津、滋陰清熱等功效。金釵石斛的主要化學(xué)成分包括多糖、生物堿、黃酮、倍半萜苷、氨基酸及酚酸類、聯(lián)芐類、菲類等化合物，研究發(fā)現(xiàn)這些化合物具有抗腫瘤、降血糖以及保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等藥理作用[1]。金釵石斛可作為天然抗氧化劑的候選藥材，研究表明，金釵石斛總多酚[2]、總多糖[3]、總黃酮[4]、總生物堿[5]均有不同程度的自由基清除能力。但關(guān)于多成分分析與抗氧化活性之間的相關(guān)性未見(jiàn)報(bào)道，且不同的提取方法對(duì)于不同成分的溶出影響各異，各類成分與抗氧化活性之間關(guān)聯(lián)程度亦不明確。本研究采用超聲波法、浸漬法、水回流法、亞臨界水萃取法、閃式提取法、酶解法提取金釵石斛，分析不同提取方法對(duì)成分差異性的影響，測(cè)定其抗氧化活性，通過(guò)相關(guān)性分析初步確定金釵石斛的主要發(fā)揮抗氧化活性的物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 金釵石斛飲片(產(chǎn)品批號(hào)：201202，廣西神力制藥有限公司)；沒(méi)食子酸(98%，成都埃法生物科技有限公司)；石斛堿(98%，成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司)；蘆丁(98%，成都樂(lè)美天醫(yī)藥科技有限公司)；D(+)-無(wú)水葡萄糖、賴氨酸(98%，上海源葉生物科技有限公司)；纖維素酶(酶活力≥15 000 U/g，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 GENESYS 180紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技公司)；DL-820D超聲儀(上海之信儀器有限公司)；HH-S6水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；BPG-9070A精密鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；800Y型多功能不銹鋼粉碎機(jī)(永康市鉑毆五金制品有限公司)；水熱反應(yīng)釜(紹興艾麥實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.3 金釵石斛飲片預(yù)處理 將金釵石斛飲片放入烘箱中60℃干燥后粉碎，過(guò)50目篩，備用。

1.4 樣品制備

1.4.1 超聲波法 精密稱取金釵石斛粉末2 g，加60 mL水，超聲功率320 W提取20 min，提取3次，抽濾，合并濾液，濃縮，定容于100 mL量瓶[6]。

1.4.2 浸漬法 精密稱取金釵石斛粉末2 g，加60 mL水，70℃浸提90 min，提取3次，抽濾，合并濾液，濃縮，定容于100 mL量瓶[7]。

1.4.3 水回流法 精密稱取金釵石斛粉末2 g，加60 mL水，在80℃的條件下水浴回流提取2 h，提取3次，抽濾，合并濾液，濃縮，定容于100 mL量瓶[8]。

1.4.4 亞臨界水萃取法 精密稱取金釵石斛粉末2 g，加60 mL水，使用水熱反應(yīng)釜置烘箱130 ℃(水飽和蒸汽壓0.27 Mpa)進(jìn)行亞臨界水萃取操作20 min，提取3次，反應(yīng)完成后使用流水對(duì)反應(yīng)釜降溫，取出反應(yīng)液，離心(4 000 r/min，10 min)，抽濾，合并濾液，濃縮，定容于100 mL量瓶[9]。

1.4.5 閃式提取法 精密稱取金釵石斛粉末2 g，加60 mL水，浸泡30 min后，使用高速剪切機(jī)10 000 r/min常溫閃提3次，每次2 min，抽濾，合并濾液，濃縮，定容于100 mL量瓶[10]。

1.4.6 酶解法 精密稱取金釵石斛粉末2 g，加60 mL水，調(diào)節(jié)pH至5.0，加入纖維素酶0.6 g，50 ℃水浴2 h，充分酶解后取出，置90 ℃水浴滅酶10 min，冷卻后離心(4 000 r/min，10 min)，抽濾，濾渣添加纖維素酶0.3 g同樣條件再次酶解2次，合并濾液，濃縮，定容于100 mL量瓶[11]。

1.5 含量測(cè)定方法

1.5.1 總多酚 以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，采用福林酚比色法。樣品溶液1 mL，加入0.4 mol/L福林酚試劑0.4 mL，渦旋1 min，靜置3 min，再加入15%碳酸鈉溶液0.3 mL，渦旋1 min，室溫下靜置60 min，定容至2 mL，測(cè)定波長(zhǎng)750 nm處的吸光度A。[12]

1.5.2 總多糖 以無(wú)水葡萄糖為對(duì)照品，采用二硝基水楊酸法。單糖、總糖樣品溶液各200 μL，加入0.5 mL DNS溶液，搖勻90 ℃水浴5 min，冷水浴10 min，定容至2 mL，測(cè)定波長(zhǎng)540 nm處的吸光度A[13]。

1.5.3 總黃酮 以蘆丁為對(duì)照品，采用三氯化鋁比色法。樣品溶液100 μL，加入1%三氯化鋁溶液200 μL，用50%乙醇溶液補(bǔ)足1 mL，搖勻，室溫下靜置15 min，測(cè)定波長(zhǎng)274 nm處的吸光度A[14]。

1.5.4 總氨基酸 以賴氨酸為對(duì)照品，采用茚三酮比色法。樣品溶液100 μL，分別加入1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH=6.5)80 μL和2%茚三酮溶液120 μL，置沸水浴加熱30 min，取出放冷5 min后，加水定容至2 mL，測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處的吸光度A[15]。

1.5.5 總生物堿 以石斛堿為對(duì)照品，采用酸性染料比色法。生物堿樣品溶液(三氯甲烷萃取)1 mL，加入0.2 mol/L鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液(pH=4.5)0.5 mL和0.04%溴甲酚綠溶液0.4 mL，渦旋3 min萃取，靜置40 min待分層，測(cè)定波長(zhǎng)415 nm處的吸光度A[16]。

1.6 體外抗氧化活性測(cè)定

1.6.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定 將各提取液用蒸餾水稀釋成不同濃度梯度。取EP管3支，P1中加入DPPH無(wú)水乙醇溶液(0.04 mg/mL)和樣液各1.0 mL；P2中加入樣液和無(wú)水乙醇各1.0 mL；P3中加入DPPH無(wú)水乙醇溶液和蒸餾水各1.0 mL；搖勻后置于暗處反應(yīng)30 min，測(cè)定波長(zhǎng)517 nm處的吸光度值[17]。

式中：Ap1為實(shí)驗(yàn)組的吸光度；Ap2為對(duì)照組的吸光度；Ap3為空白組的吸光度。

1.6.2 鐵原子還原力測(cè)定 將各提取液用蒸餾水稀釋成不同濃度梯度。分別吸取100 μL不同濃度稀釋液于2 mL EP管中，并加入900 μL FRAP工作液，搖勻并避光反應(yīng)15 min，在593 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值[18]。對(duì)FeSO4標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以達(dá)到同樣吸光度值所需標(biāo)準(zhǔn)液濃度為FRAP值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0對(duì)不同水提取方法處理的金釵石斛提取液中的成分進(jìn)行單因素方差分析，Duncan多重比較來(lái)分析各提取方法的差異性；并通過(guò)相關(guān)系數(shù)法對(duì)提取液中成分和抗氧化活性進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，列出各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 金釵石斛水提取液5種成分及FeSO4標(biāo)準(zhǔn)液線性與范圍表

2.2 不同水提取方法中各成分變化對(duì)比

2.2.1 總多酚 通過(guò)方差分析和多重比較可知，不同水提取方法處理的金釵石斛總多酚含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中酶解法處理的總多酚成分含量最高(8.992±0.517)mg/g，閃式提取法處理的總多酚含量次高(7.703±0.277)mg/g，含量最低的為亞臨界水萃取法(6.563±0.036)mg/g(見(jiàn)圖1)。酶解法與其余5種方法處理的金釵石斛總多酚含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；閃式提取法與浸漬法處理的金釵石斛總多酚含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；超聲波法、水回流法、亞臨界水萃取法處理的金釵石斛總多酚含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

*：與閃提、浸提、回流、亞臨界、超聲組相比，P<0.05；#：與酶解、回流、亞臨界、超聲組相比，P<0.05；**：與酶解、閃提、超聲、亞臨界組相比，P<0.05；##：與酶解、閃提、浸提組相比，P<0.05。

2.2.2 總黃酮 通過(guò)方差分析和多重比較可知，不同水提取方法處理的金釵石斛總黃酮含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中水回流法處理的總黃酮成分含量最高(11.723±0.055)mg/g，酶解法處理的總黃酮成分含量次高(11.081±0.279)mg/g，浸漬法處理的總黃酮成分含量最低(9.513±0.091)mg/g(見(jiàn)圖2)。水回流法、酶解法、閃式提取法處理的總黃酮含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；超聲波法、浸漬法處理的總黃酮含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；亞臨界水萃取法與其余幾種方法處理的總黃酮含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

*：與亞臨界、超聲、浸提組相比，P<0.05；#：與回流、酶解、閃提、浸提、超聲組相比，P<0.05；**：與回流、酶解、閃提、亞臨界組相比，P<0.05。

2.2.3 總氨基酸 通過(guò)方差分析和多重比較可知，不同水提取方法處理的金釵石斛總氨基酸含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中酶解法處理的總氨基酸成分含量最高(20.828±0.390)mg/g，超聲波法處理的總氨基酸成分含量次高(12.547±0.062)mg/g，水回流法處理的總氨基酸成分含量最低(10.099±0.079)mg/g(見(jiàn)圖3)。酶解法與其余五種方法處理的金釵石斛總氨基酸含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；浸漬法與亞臨界水萃取法的金釵石斛總氨基酸含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

*：與超聲、浸提、亞臨界、閃提、回流組相比，P<0.05；#：與酶解、浸提、亞臨界、閃提、回流組，P<0.05；**：與酶解、超聲、閃提、回流組，P<0.05；##：與酶解、超聲、亞臨界、浸提、回流組，P<0.05；***：與酶解、超聲、浸提、亞臨界、閃提組相比，P<0.05。

2.2.4 總生物堿 通過(guò)方差分析和多重比較可知，不同水提取方法處理的金釵石斛總生物堿含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中水回流法處理的總生物堿成分含量最高(5.017±0.099)mg/g，酶解法處理的總生物堿成分含量次高(4.728±0.032)mg/g，閃式提取法處理的總生物堿成分含量最低(4.258±0.042)mg/g(見(jiàn)圖4)。水回流法與其余五種方法處理的金釵石斛總生物堿含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；超聲法、浸漬法、亞臨界水萃取法、閃式提取法處理的金釵石斛總生物堿含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

*：與酶解、超聲、浸提、亞臨界、閃提組相比，P<0.05；#：與回流、超聲、浸提、亞臨界、閃提組相比，P<0.05；**：與回流、酶解組相比，P<0.05。

2.2.5 總多糖 通過(guò)方差分析和多重比較可知，不同水提取方法處理的金釵石斛總多糖含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中亞臨界水萃取法處理的總多糖成分含量最高(54.747±0.203)mg/g，水回流法處理的總多糖成分含量次高(49.45±0.674)mg/g，超聲法處理的總多糖成分含量最低(23.731±0.177)mg/g(見(jiàn)圖5)。6種方法處理的金釵石斛總多糖含量差異均具有顯著性(P<0.05)。

*：與回流、浸提、閃提、超聲、酶解組相比，P<0.05；#：與亞臨界、浸提、閃提、超聲、酶解組相比，P<0.05；**：與亞臨界、回流、閃提、超聲、酶解組相比，P<0.05；##：與亞臨界、回流、浸提、超聲、酶解組相比，P<0.05；***：與亞臨界、回流、浸提、閃提、超聲組相比，P<0.05；###：與亞臨界、回流、浸提、閃提、酶解組相比，P<0.05。

2.3 體外抗氧化活性分析

2.3.1 各水提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力 由圖6可以看出，不同水提取方法的金釵石斛提取液均有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，在樣品質(zhì)量濃度0.1～10 mg/mL時(shí)，隨著樣品濃度的增大，DPPH自由基清除率也隨之增大。其中水回流法提取的金釵石斛提取液DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到98.76%。不同水提取方法的金釵石斛提取液的清除能力大小排序?yàn)椋核亓鞣?閃式提取法>酶解法>超聲波法>浸漬法>亞臨界水萃取法，其清除DPPH自由基的IC50值分別為(0.896±0.018)、(0.987±0.021)、(1.004±0.020)、(1.281±0.023)、(1.300±0.011)及(1.311±0.043)mg/mL。

圖6 不同水提取方法的金釵石斛提取液的DPPH自由基清除率

2.3.2 各水提取液的總還原力FRAP值 由圖7可以看出，當(dāng)不同水提取方法的金釵石斛提取液濃度為0.5～20 mg/mL時(shí)，F(xiàn)RAP值隨著濃度的增加而增大，總還原力FRAP值與DPPH自由基清除率結(jié)果相似。在濃度20 mg/mL時(shí)，水回流法的金釵石斛提取液FRAP值最大，是浸漬法的1.43倍。不同水提取方法的金釵石斛提取液的總還原力FRAP值大小排序?yàn)椋核亓鞣?閃式提取法>超聲波法>酶解法>亞臨界水萃取法>浸漬法。

圖7 不同水提取方法的金釵石斛提取液的總還原力

2.4 抗氧化活性與各成分含量的相關(guān)性分析 由表2可以看出，不同水提取方法的金釵石斛提取液中的總多酚含量與DPPH自由基清除率、FRAP值呈弱度正相關(guān)；總黃酮含量與DPPH自由基清除率、FRAP值呈極顯著中強(qiáng)度正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為0.819和0.704；總氨基酸含量與DPPH自由基清除率、FRAP值無(wú)相關(guān)性；總生物堿含量與DPPH自由基清除率、FRAP值呈中弱度正相關(guān)，其中與DPPH自由基清除率達(dá)到極顯著性水平(P<0.01)，與FRAP值達(dá)到顯著性水平(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)分別為0.762和0.498；總多糖含量與DPPH自由基清除率、FRAP值呈弱度相關(guān)，其中與FRAP值呈負(fù)相關(guān)。上述分析說(shuō)明，總黃酮、總生物堿是金釵石斛水提取液抗氧化活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

表2 金釵石斛成分含量與抗氧化活性相關(guān)性分析

3 討論

大部分的酚類化合物以苷元、糖苷、甲基化殘留物或者其他大分子的形式存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞液泡等組織中[19]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，借助纖維素酶降解細(xì)胞壁可促進(jìn)多酚成分的溶出，提高提取效率。文獻(xiàn)報(bào)道采用乙醇振蕩提取金釵石斛總多酚提取量為0.862 mg/g[2]，與本文中多酚含量相差較大，可能與金釵石斛的原產(chǎn)地(云南普洱)有關(guān)，本文原材料產(chǎn)自貴州赤水，說(shuō)明貴州赤水金釵石斛多酚含量高于云南普洱。水回流法、閃式提取法及酶解法對(duì)總黃酮的提取效率差異不大，可參考其他成分的變化來(lái)對(duì)提取方法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。目前黃酮成分大多采用有機(jī)溶劑提取，存在能耗大、環(huán)境污染等問(wèn)題，蔡莉等[14]用乙醇超聲提取不同采收期金釵石斛總黃酮含量范圍為0.31%～0.68%，均低于本研究的6種提取方法，說(shuō)明水可作為提取黃酮成分的備選溶劑，為今后金釵石斛總黃酮的綠色提取提供新思路。酶解法所提取的氨基酸含量是回流法的2倍，說(shuō)明酶解法的條件溫和，更適宜用于氨基酸的提取，不易破壞成分。文獻(xiàn)報(bào)道赤水金釵石斛氨基酸總量范圍為3.48～19.38 mg/g[20]，與本文結(jié)果一致，但本研究?jī)H采用茚三酮顯色法測(cè)定總氨基酸含量，后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)氨基酸的具體種類進(jìn)行分析，為金釵石斛營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)提供參考。錢桂敏[21]、敖嬌[11]分別采用閃式提取法、酶解法提取金釵石斛總生物堿，結(jié)果為0.45%、0.435%，與本文相差不大。生物堿的提取多采用傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法，本研究采用水提取方法仍能達(dá)到較高提取效率，可為今后生物堿的提取提供新思路。鄧維澤[22]、余芳[23]、曾宇馨等[24]采用超聲提取法所得多糖含量分別為3.11%、6.945%、7.49%，均高于本研究中的超聲提取法，對(duì)比工藝參數(shù)發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間(均大于40 min)與提取溫度(60 ℃以上)相差很大，結(jié)合亞臨界水萃取法的總多糖提取量結(jié)果，推斷提取溫度是總多糖的提取效率的一個(gè)重要因素，將總多糖提取量與提取溫度進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者呈高度極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.920，說(shuō)明提取溫度可能對(duì)于總多糖的提取有影響。本研究采用二硝基水楊酸法測(cè)定金釵石斛水提取液的單糖和總糖，通過(guò)總糖減去單糖得到總多糖的提取量。通過(guò)各提取液的單糖量對(duì)比發(fā)現(xiàn)，酶解法的單糖提取量最高(3.685±0.101)mg/g，是亞臨界水萃取法(1.856±0.010)mg/g的1.99倍。酶解法主要通過(guò)纖維素酶將纖維素大分子分解成單糖和寡糖，所以單糖的溶出量會(huì)比其他方法高。

通過(guò)對(duì)不同水提取方法的金釵石斛提取液的成分對(duì)比分析可知，水回流法的總黃酮和總生物堿含量最高，酶解法的總多酚和總氨基酸含量最高，亞臨界水萃取法的總多糖含量最高。水回流法主要通過(guò)持續(xù)不斷的加熱使金釵石斛莖的植物細(xì)胞壁軟化破裂，使有效成分從細(xì)胞內(nèi)再擴(kuò)散到細(xì)胞外，再擴(kuò)散到溶劑中，該方法設(shè)備簡(jiǎn)單，易操作；酶解法主要借助纖維素酶降解細(xì)胞壁，減少細(xì)胞壁對(duì)成分溶出的阻礙，并將纖維素大分子分解成單糖和寡糖，該方法反應(yīng)條件溫和，不易破壞成分；亞臨界水萃取法通過(guò)借助特殊裝置使水達(dá)到亞臨界狀態(tài)，氫鍵打開(kāi)或減弱，降低水的極性，從而實(shí)現(xiàn)金釵石斛有效成分的快速溶出，此方法反應(yīng)時(shí)間短，提取效率高。

通過(guò)對(duì)金釵石斛水提取液的各類成分與抗氧化活性相關(guān)性分析可知，金釵石斛總黃酮和總生物堿與DPPH自由基清除率、FRAP值呈極顯著中強(qiáng)度正相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道鐵皮石斛總多酚、總黃酮、總生物堿與抗氧化活性之間有明顯的相關(guān)性，其中總黃酮為強(qiáng)相關(guān)，總多酚為弱相關(guān)[25]；霍山石斛干花中粗多糖、總多酚、總黃酮、總氨基酸與DPPH自由基清除率呈顯著正相關(guān)[26]；齒瓣石斛總多酚、總黃酮與DPPH自由基清除率呈正相關(guān)，而總生物堿、總黃酮與之呈負(fù)相關(guān)[27]。不同種屬石斛的成分與抗氧化活性相關(guān)性有所差異，金釵石斛總多酚與DPPH自由基清除率、FRAP值相關(guān)性不顯著，原因可能是各種屬石斛中總多酚組成不一樣，同一個(gè)大類中的某一單體成分對(duì)于抗氧化活性影響大，這個(gè)有待進(jìn)一步研究。

不同的水提取方法對(duì)金釵石斛各成分的影響各異，后續(xù)可根據(jù)不同需求選定提取方法進(jìn)行優(yōu)化達(dá)到某成分的最佳提取率，也可通過(guò)合適的兩種或幾種方法聯(lián)用提取獲得多成分高含量的金釵石斛提取物。目前可知金釵石斛總黃酮和總生物堿是重要的抗氧化活性物質(zhì)，可作為天然抗氧化劑的候選物質(zhì)，開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于化妝品、食品和保健品中。本研究?jī)H研究了各類成分含量與抗氧化活性的相關(guān)性，后續(xù)將進(jìn)一步研究抑制酪氨酸酶活性、保濕性等其他活性與成分之間的關(guān)系，為金釵石斛多功能高活性相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。