■尹 皚 王 亮 杜 紅 易 鑫 舒 剛，*

（1.眉山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川眉山 620010；2.紅河學(xué)院應(yīng)用技術(shù)研究院，云南紅河 661199；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川成都 611130）

仔兔斷奶腹瀉，是肉兔養(yǎng)殖中的常見多發(fā)病，發(fā)病率和死亡率高，還會(huì)引起仔兔生長受阻，給養(yǎng)兔場造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。飼料中添加抗生素是防治該病的有效手段，但從2020年7月開始，我國飼料行業(yè)進(jìn)入“無抗”時(shí)代，仔兔斷奶腹瀉發(fā)生率與日俱增。為解決仔兔斷奶腹瀉和尋找新型抗生素替代品成為養(yǎng)兔業(yè)研究的熱點(diǎn)。

烏梅散是收載于2015 版獸藥典，是由烏梅、柿餅、黃連、姜黃、訶子組成的復(fù)方制劑，主要應(yīng)用在治療豬、牛、羊出現(xiàn)冷汗、腹脹以及下痢不止等方面。在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)在烏梅散原有組成的基礎(chǔ)上減去其中的柿餅，添加黨參、白術(shù)、茯苓，可達(dá)到固腸收澀、止瀉、清熱祛濕、健脾滲濕的功效。同時(shí)，采用傳統(tǒng)煎煮方法煎煮后進(jìn)行噴霧干燥，得到加味烏梅散提取物，更有利于加入畜禽飼糧中，方便使用。目前，加味烏梅散提取物還沒有在斷奶兔生產(chǎn)中的應(yīng)用研究，本試驗(yàn)旨在探討斷奶仔兔飼糧中加入加味烏梅散提取物，對斷奶仔兔生長性能和免疫功能、抗氧化能力的影響，考察該提取物作為替抗產(chǎn)品的潛力，為其在肉兔無抗飼養(yǎng)中應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

健康、體重相當(dāng)和遺傳背景一致的240只38日齡斷奶伊拉肉兔[（732.48±10.26）g]，購自四川滿潤隆生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司。

1.2 試驗(yàn)藥物與試劑

加味烏梅散（由烏梅、黃連、姜黃、訶子、黨參、白術(shù)、茯苓組成）提取物自制（采用傳統(tǒng)煎煮法，水煎3次后合并煎液經(jīng)噴霧干燥而成，1.0 g提取物相當(dāng)于生藥10 g）。免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）用ELISA檢測試劑盒及丙二醛（MDA）、超氧化物歧化物（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化指標(biāo)檢測試劑盒，均購自南京建成生物科技有限公司。

酶標(biāo)儀（型號(hào)為Multiskan FC），購自賽默飛世爾儀器有限公司；臺(tái)式離心機(jī)（型號(hào)為JIDI-4D-WS），購自廣州吉迪儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（型號(hào)為UV-1200），購自上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將240只38日齡斷奶伊拉肉兔按照公母各半、均重相近的原則分為4 組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只兔（公母各半）。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧；試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0.5、1.0 g/kg和2.0 g/kg的加味烏梅散提取物。

1.4 基礎(chǔ)飼糧組成與營養(yǎng)水平

基礎(chǔ)飼糧配方設(shè)計(jì)參照NRC（1977）肉兔營養(yǎng)需要并結(jié)合伊拉肉兔生長發(fā)育特點(diǎn)設(shè)計(jì)，然后加工成直徑4 mm、長10 mm 的顆粒料。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.5 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)開始前徹底清理和消毒兔舍、兔籠和飲水管道。所有分組在同一兔舍進(jìn)行，采用雙排階梯式雙層籠中進(jìn)行飼養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)1 只，由試驗(yàn)人員管理。每天早上8：00喂食1次，可自由進(jìn)食和飲水。兔舍每日打掃并消毒，自然光照，并及時(shí)清除糞便。分組后進(jìn)行免疫巴氏桿菌滅活苗和兔瘟疫苗，并記錄每天采食量，觀察腹瀉等情況。

1.6 測定項(xiàng)目

1.6.1 生長性能測定

在試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)（在早上8：00）對各個(gè)重復(fù)兔進(jìn)行空腹稱重，記錄試驗(yàn)期各重復(fù)耗料量，以單只兔為單位計(jì)算平均日增重、平均日采食量和料重比。

平均日增重（g/d）=（試驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重-試驗(yàn)開始時(shí)體重）/試驗(yàn)天數(shù)

平均日采食量（g/d）=（投料量-剩料量）/（試驗(yàn)天數(shù)×每個(gè)重復(fù)兔只數(shù)）

料重比=日采食量/日增重

記錄腹瀉個(gè)體和死亡個(gè)體數(shù)量，最后以組為單位計(jì)算腹瀉率與病死率。

腹瀉率（%）=腹瀉只數(shù)/總只數(shù)×100

死亡率（%）=死亡只數(shù)/總只數(shù)×100

1.6.2 免疫器官指數(shù)測定

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)選擇4只（2公2母）接近平均體重的試驗(yàn)兔，通過斷頸的方法進(jìn)行屠宰。屠宰前禁食12 h，不禁水。稱量宰前重、各免疫器官重量，并計(jì)算免疫器官指數(shù)。

免疫器官指數(shù)（g/kg）＝免疫器官重量（g）/宰前活體重（kg）

1.6.3 血清免疫指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)測定

屠宰前對兔子進(jìn)行耳靜脈采血，采集的血液靜置3 h，待血液凝固后，5 000 r/min 離心5 min，收集血清，裝入EP管中于-80 ℃保存，用于測定血清免疫指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)（1 周內(nèi)完成測定）。免疫指標(biāo)IgA、IgG、IgM 和抗氧化指標(biāo)丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）含量均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)

采用Excel 2016軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)，然后使用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用LSD 法進(jìn)行多重比較。數(shù)據(jù)使用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 加味烏梅散提取物對肉兔生長性能的影響（見表2）

表2 加味烏梅散提取物對肉兔生長性能的影響

由表2 可知，各組平均日增重比較，1.0 g/kg 組與2.0 g/kg 組比對照組顯著提高了13.65%、12.52%（P＜0.05）；與0.5 g/kg 組差異不顯著（P＞0.05）。各組平均日采食量比較，各組差異不顯著（P＞0.05），對照組平均日采食量最高。各組料重比比較，1.0 g/kg 組與2.0 g/kg組比對照組顯著降低16.06%、18.31%（P＜0.05）；與0.5 g/kg 組差異不顯著（P＞0.05）。各組腹瀉率比較，各試驗(yàn)組顯著低于對照組，其中0.5 g/kg組比對照組顯著降低24.86%（P＜0.05），1.0 g/kg組與2.0 g/kg 組比對照組顯著降低57.86%、59.92%（P＜0.05），1.0 g/kg組與2.0 g/kg 組比0.5 g/kg 組分別顯著降低43.92%、46.66%（P＜0.05）。存活率比較，各試驗(yàn)組都高于對照組，1.0 g/kg組最高。

2.2 加味烏梅散提取物對肉兔免疫器官指數(shù)的影響（見表3）

由表3 可知，肉兔圓小囊重量比較，1.0 g/kg 組與2.0 g/kg 組分別顯著高于對照組10.32%、9.52%（P＜0.05）。圓小囊指數(shù)比較，1.0 g/kg組與2.0 g/kg組分別顯著高于對照組8.93%、8.04%（P＜0.05）。脾臟重量比較，1.0 g/kg組與2.0 g/kg組分別顯著高于對照組10.24%、9.45%（P＜0.05）。脾臟指數(shù)比較，1.0 g/kg組與2.0 g/kg組分別顯著高于對照組22.22%、25.93%（P＜0.05）。

表3 加味烏梅散提取物對肉兔免疫器官指數(shù)的影響

2.3 加味烏梅散提取物對肉兔血清免疫指標(biāo)的影響（見表4）

表4 加味烏梅散提取物對肉兔血清免疫指標(biāo)的影響(mg/mL)

由表4可知，IgA含量比較，1.0 g/kg組與2.0 g/kg組分別顯著高于對照組14.75%、16.39%（P＜0.05）。IgG含量比較，各組差異不顯著（P＞0.05），但各試驗(yàn)組平均值高于對照組。IgM含量比較，1.0 g/kg組與2.0 g/kg組分別顯著高于對照組13.24%、12.76%（P＜0.05）。

2.4 加味烏梅散提取物對肉兔血清抗氧化指標(biāo)的影響（見表5）

表5 加味烏梅散提取物對肉兔血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表5可知，MDA含量比較，2.0 g/kg組顯著低于對照組12.21%，其他各組間差異不顯著（P＞0.05）。SOD含量比較，1.0 g/kg組與2.0 g/kg組分別顯著高于對照組15.21%、22.80%（P＜0.05）。GSH-Px 含量比較，各試驗(yàn)組分別顯著高于對照組9.20%、32.78%、37.39%（P＜0.05），且1.0 g/kg組與2.0 g/kg組分別顯著高于0.5 g/kg組21.59%、25.81%（P＜0.05）。

3 討論

3.1 加味烏梅散提取物對肉兔生長性能的影響

中獸藥作為飼料添加劑對肉兔生長性能有顯著提高作用。曹禮靜等[2]將黨參、黃芪等組成中藥復(fù)方后添加到飼料中，顯著提高斷奶兔生長性能。崔曉娜[3]以黃芪、山楂、陳皮等多味中藥飼喂新西蘭斷奶仔兔顯著提高生長性能并減少了腹瀉率。而烏梅散出自《元亨療馬集》，收載于2015 版獸藥典。原方中的主藥烏梅澀腸止瀉，臣藥訶子、柿餅收斂固澀大腸，佐藥黃連清熱燥濕止痢，姜黃祛瘀止痛。諸藥合用，澀腸止瀉，清熱燥濕。已有報(bào)道證實(shí)烏梅散及其加味可以治療豬[4]、犢牛[5]、鴨的腹瀉，同時(shí)還促進(jìn)了鴨的生長[6]。現(xiàn)代藥理也證實(shí)烏梅水提液均能夠有效抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌和金黃色葡萄球菌的生長[7]，降低腸道pH，可改善腸道菌群[8]。崔念臻等[9]研究發(fā)現(xiàn)訶子不同提取組分對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌均具有抗菌活性；訶子粗提物發(fā)揮止瀉作用在于能抑制腸道平滑肌收縮[10]。黃連提取物不僅抑制有害菌，還能顯著促進(jìn)乳酸菌、雙歧桿菌的生長[11]。黨參和茯苓對腸道菌群都有較好的調(diào)節(jié)作用[12]。同樣，白術(shù)能改善腸動(dòng)力、調(diào)節(jié)腸功能紊亂、修復(fù)腸道黏膜損傷、抑制腸道炎癥、促進(jìn)潰瘍修復(fù)等達(dá)到有效治療腸道疾病的作用[13]。本試驗(yàn)也證實(shí)了1.0 g/kg 組與2.0 g/kg 組的平均日增重顯著高于對照組；料重比顯著低于對照組。各組腹瀉率比較，添加加味烏梅散提取物能顯著降低肉兔的腹瀉率，同時(shí)顯著提高存活率，并呈現(xiàn)劑量依賴性。

3.2 加味烏梅散提取物對肉兔免疫器官指數(shù)的影響

脾臟和圓小囊是兔類的重要免疫器官。脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官，含有多種免疫細(xì)胞。圓小囊位于盲腸與回腸相接處，是一個(gè)厚壁圓囊，是兔特有的結(jié)構(gòu)，可以作為屏障來抵抗烈性抗原對淋巴組織的入侵；也可以作為通道來傳遞抗原，重量及指數(shù)的增加能反映動(dòng)物免疫能力提高[14]。朱琪[15]使用烏梅配成復(fù)方，對肉雞免疫器官指數(shù)和新城疫抗體取得良好效果。尹莉莉[16]證實(shí)黨參多糖可顯著提高仔豬的胸腺、脾臟指數(shù)。陳麗玲等[17]證實(shí)白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能促進(jìn)斷奶仔豬生長性能和免疫功能。范磊等[18]證實(shí)茯苓多糖可以提高肉雞的生長性能、免疫器官指數(shù)水平。本研究結(jié)果表明1.0 g/kg組與2.0 g/kg組顯著提高圓小囊的重量和圓小囊指數(shù)；還顯著提高了脾臟重量和脾臟指數(shù)，與上述報(bào)道一致。

3.3 加味烏梅散提取物對肉兔血清免疫指標(biāo)的影響

血清免疫球蛋白主要存在于動(dòng)物血清中，對動(dòng)物的免疫功能具有主要意義。IgA是黏膜免疫中的主要分泌型抗體，可以提高機(jī)體呼吸道、消化道黏膜組織的抗病毒能力；IgG主要介導(dǎo)體液免疫的主要抗體；IgM是機(jī)體初次接觸抗原物質(zhì)時(shí)最早出現(xiàn)的免疫球蛋白，在抗感染中起著關(guān)鍵作用[18]。石軼男等[19]發(fā)現(xiàn)黨參多糖顯著提高肉雞血清中IgG含量和分泌型免疫球蛋白A（sIgA）的含量。趙小霞等[20]證實(shí)訶子可增強(qiáng)小鼠非特異性免疫應(yīng)答水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌，可以有效地增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能。張志軍等[21]證實(shí)茯苓多糖顯著提高小鼠IgA、IgG 和IgM 含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，1.0 g/kg 組與2.0 g/kg組可顯著提高肉兔血清中IgA、IgM的含量，這說明在飼糧中添加一定水平的加味烏梅散提取物有改善肉兔體液免疫的作用，可能主要與方中訶子、黨參、茯苓、白術(shù)等成分有關(guān)。

3.4 加味烏梅散提取物對肉兔血清抗氧化指標(biāo)的影響

MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，也是細(xì)胞氧化損傷的一個(gè)重要檢測指標(biāo)。測定MDA含量可以反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊和脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷程度的嚴(yán)重性[22]。SOD是機(jī)體細(xì)胞內(nèi)清除自由基的內(nèi)源抗氧化酶，廣泛存在生物體的組織中，能夠清除超氧陰離子自由基[23]。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，可保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害[24]。因此，血清中MDA 含量以及SOD、GSH-Px活性是衡量機(jī)體氧化和抗氧化的重要指標(biāo)。劉文生[25]發(fā)現(xiàn)黨參多糖能減緩過氧化氫造成的損傷，有效清除體內(nèi)自由基，增強(qiáng)SOD、GSH-Px活性和過氧化氫酶（CAT）的活性，降低血漿MDA含量。謝金炎等[26]研究發(fā)現(xiàn)訶子及其炮制品可以提高小鼠血清中總抗氧化能力（T-AOC）、SOD 含量，降低血清單胺氧化酶（MAO）、MDA含量，證明訶子及其炮制品對小鼠有明顯的抗氧化作用。杜娜[27]在日糧中添加黃連素可以有效緩解脂多糖誘導(dǎo)的生長性能抑制、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。張寶龍等[28]證實(shí)黨參可以提升黃顙魚血清中SOD、GSHPx活性，降低MDA含量。曹艷霞等[29]證實(shí)白術(shù)多糖可以顯著提高潰瘍大鼠的胃組織SOD活性，MDA含量顯著下降。茯苓多糖較強(qiáng)的抗氧化能力能夠減少機(jī)體內(nèi)自由基對細(xì)胞的破損，也能夠激活動(dòng)物機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，從而達(dá)到保護(hù)動(dòng)物本身的效果[30]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，2.0 g/kg組顯著降低MDA含量；1.0 g/kg組與2.0 g/kg組還顯著提高SOD、GSH-Px含量。綜合來看，這應(yīng)該是提取物中的有機(jī)酸、多糖、黃酮類等物質(zhì)發(fā)揮了提高抗氧化能力、清除機(jī)體內(nèi)自由基、保護(hù)機(jī)體正常細(xì)胞代謝的作用。

4 結(jié)論

①在肉兔日糧中添加加味烏梅散提取物可提高肉兔的生長性能，提高機(jī)體免疫力，提高血清抗氧化功能。

②本試驗(yàn)中，1.0 g/kg組與2.0 g/kg組效果較好，綜合考慮肉兔日糧中加味烏梅散適宜添加量為1.0 g/kg。