■汪 鈺 劉寬博 李愛科 施晶晶 何貝貝 郭雙雙 王永偉*

(1.國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院糧食品質(zhì)營養(yǎng)研究所，北京 100037；2.武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430040)

當(dāng)前我國優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料供需矛盾日趨緊張，受國內(nèi)外多重因素影響，豆粕的價(jià)格和供應(yīng)呈現(xiàn)波動趨勢，影響了畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2021年3月15日印發(fā)了《飼料中玉米豆粕減量替代工作方案》，方案中提出“要充分挖掘利用雜糧、雜粕、糧食加工副產(chǎn)物等替代資源，加強(qiáng)飼料糧玉米、豆粕的減量替代技術(shù)研究”。在此背景下，充分開發(fā)糧油加工副產(chǎn)物飼料資源，拓寬豆粕替代原料已是畜牧行業(yè)發(fā)展的必由之路，對于保障飼料糧供需平衡、穩(wěn)定糧食安全大局也具有重要意義[1]。 菜粕可作為替代豆粕的一種蛋白質(zhì)原料，年產(chǎn)量可達(dá)900 萬噸以上，其粗蛋白（CP）水平可達(dá)40%左右，含硫氨基酸含量高；B 族維生素及礦物元素（鈣、磷、鐵、硒等）含量也較高[2]。然而，菜粕中含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，如硫葡萄糖苷、異硫氰酸酯（ITC）、噁唑烷硫酮（OZT）、粗纖維等，其中硫葡萄糖苷作為主要的抗?fàn)I養(yǎng)成分，在芥子酶的作用下降解為ITC 和OZT，損害動物機(jī)體甲狀腺功能及繁殖性能[3-4]；此外，菜粕中也存在一些真菌毒素，如黃曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和嘔吐毒素（DON）等，具有較強(qiáng)的毒害作用[5-6]，以上因素引起菜粕不能合理高效應(yīng)用。有研究表明，菜粕（尤其是非雙低菜粕）在日糧的添加比例不宜高于10%[7]。近年來菜粕的脫毒處理研究較多，其中固態(tài)發(fā)酵是微生物脫毒的有效手段之一。菜粕經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后其抗?fàn)I養(yǎng)成分降低、適口性增加，改善了畜禽的采食及健康狀況[8]。用黑曲霉于32 ℃條件下發(fā)酵菜粕3 d可使菜粕中ITC 降低56.11%；以枯草芽孢桿菌、糞腸球菌及假絲酵母以1∶1∶2 的比例于30 ℃條件下發(fā)酵菜粕3 d 可使菜粕中小肽提高88.76%，ITC 降低96.20%[9-10]。

目前，對于菜粕發(fā)酵工藝優(yōu)化多以單一指標(biāo)的變化為篩選標(biāo)準(zhǔn)，具有一定的片面性，為了更全面預(yù)測菜粕的最佳發(fā)酵工藝，可對多個(gè)指標(biāo)賦予權(quán)重進(jìn)行綜合分析，從而獲得最佳發(fā)酵工藝。本研究從提升菜粕營養(yǎng)品質(zhì)并降低其抗?fàn)I養(yǎng)因子的角度出發(fā)，通過單菌篩選、混菌發(fā)酵設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，綜合多指標(biāo)加權(quán)優(yōu)化工藝，以期獲得優(yōu)質(zhì)飼用發(fā)酵菜粕，為固態(tài)發(fā)酵菜粕的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

混合型菜粕購自四川成都。

釀酒酵母（SC16-1、SC17-1、SC17-2）、枯草芽孢桿菌（BS15-3、BS17-1）均由國家糧食與物資儲備局科學(xué)研究院保藏；曲霉（增香曲霉、紅曲霉）購自武漢佳成生物制品有限公司。

培養(yǎng)基：YPD 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

篩選7 株菌進(jìn)行單菌發(fā)酵試驗(yàn)，根據(jù)營養(yǎng)指標(biāo)、抗?fàn)I養(yǎng)指標(biāo)和真菌毒素指標(biāo)的測定結(jié)果，從7株菌中篩選3 株菌進(jìn)行混菌發(fā)酵菜粕試驗(yàn)；由篩選出的3 株菌設(shè)計(jì)不同菌株配比及發(fā)酵時(shí)間的L9（34）四因素三水平正交試驗(yàn)及驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)

菜粕粉碎過20 目，經(jīng)過121 ℃15 min 高壓滅菌后，取60 g 至500 mL 燒杯中，以料水比5∶3 的比例，將菌液或菌粉一并添加至菜粕原料中，用玻璃棒攪拌均勻，6層紗布捆扎，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵，定時(shí)翻料。發(fā)酵4 d結(jié)束后，50 ℃烘干樣品，粉碎待測。

1.3.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)1.3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果，從7 株菌中篩選出3 株菌進(jìn)行不同菌株配比及發(fā)酵時(shí)間的四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)（表1），根據(jù)每種菌在發(fā)酵菜粕中的初始含量為1×106CFU/g的原則，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表（見表2）進(jìn)行菜粕的發(fā)酵。

表1 因素水平

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.4 測定指標(biāo)及方法

將發(fā)酵菜粕在50 ℃電熱恒溫真空干燥箱中烘干，低溫粉碎機(jī)粉碎后測定發(fā)酵菜粕的相應(yīng)指標(biāo)。水分及揮發(fā)物含量的測定按照GB/T 10358—2008測定；CP含量按照GB/T 6432—2018測定；酸溶蛋白含量參照NY/T 3801—2020 測定；粗纖維含量按照GB/T 6434—2006測定；ITC含量按照GB/T 13087—2020測定；單寧含量按照GB/T 27985—2011測定。其中圖1中OZT 含量按照NY/T 1799—2009 測定；AFB1、DON含量及ZEN 含量均采用維德維康酶聯(lián)免疫法試劑盒法檢測。表3 中OZT 含量按照GB/T 13089—2020 測定；AFB1 含量參考GB/T 36858—2018 測定；DON 含量參考GB/T 30956—2014 測定；ZEN 含量參考GB/T 28716—2012測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），用Duncan’s 法進(jìn)行數(shù)據(jù)間的多重比較，P＜0.05為差異顯著。采用GraphPad Prism進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果（見圖1）

圖1 單菌發(fā)酵菜粕的綜合指標(biāo)

不同菌株發(fā)酵菜粕的品質(zhì)比較，由圖1可知，不同枯草芽孢桿菌發(fā)酵菜粕，以BS15-3發(fā)酵菜粕的酸溶蛋白水平更高，OZT水平更低，菜粕的真菌毒素水平均較低，因而在兩株枯草芽孢桿菌中選擇BS15-3作為后續(xù)發(fā)酵菌株。不同曲霉菌發(fā)酵菜粕的CP和酸溶蛋白水平均提高，綜合氣味、活菌數(shù)等因素選擇增香曲霉粉進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵。不同釀酒酵母發(fā)酵菜粕，以SC17-1發(fā)酵菜粕的酸溶蛋白水平最高，與未發(fā)酵菜粕差距最小，其OZT 及真菌毒素水平均低于菜粕原料。因此，從7株單菌中選擇枯草芽孢桿菌BS15-3、增香曲霉及釀酒酵母SC17-1作為后續(xù)混菌發(fā)酵菜粕的菌株。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果（見表3和表4）

表3 正交試驗(yàn)不同組合發(fā)酵菜粕的營養(yǎng)與抗?fàn)I養(yǎng)成分比較（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

表3（續(xù)） 正交試驗(yàn)不同組合發(fā)酵菜粕的營養(yǎng)與抗?fàn)I養(yǎng)成分比較（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

由表3可知，不同正交組合的發(fā)酵菜粕的營養(yǎng)與抗?fàn)I養(yǎng)指標(biāo)的水平有所不同。綜合考慮發(fā)酵菜粕的營養(yǎng)與抗?fàn)I養(yǎng)指標(biāo)及飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB 13078—2017（ITC 4 000 mg/kg、OZT 2 500 mg/kg、DON 500 μg/kg、ZEN 500 μg/kg、AFB1 50 μg/kg），進(jìn)行各指標(biāo)間相關(guān)性分析，并根據(jù)相關(guān)性結(jié)果進(jìn)行綜合分析。

多指標(biāo)加權(quán)綜合評分分析，以CP增加率（U，%）、酸溶蛋白增加率（V，%）、ITC降解率（W，%）、OZT降解率（X，%）及單寧降解率（Y，%）為評價(jià)指標(biāo)，以熵值法計(jì)算賦予各指標(biāo)權(quán)重[11-12]，進(jìn)行綜合評價(jià)指標(biāo)Z（其中Z=0.19U+0.31V+0.01W+0.01X+0.49Y）。

由表4 可知，依據(jù)直觀分析得出的最優(yōu)組合為A2B1C1D3；依據(jù)5 種指標(biāo)進(jìn)行綜合評定排名，以正交試驗(yàn)組合8（A3B2C1D3）的綜合評分最高。根據(jù)極差分析結(jié)果，各因素對菜粕發(fā)酵綜合評定效果的主次順序?yàn)椋篋＞C＞A＞B，即發(fā)酵時(shí)間＞芽孢桿菌＞增香曲霉＞釀酒酵母。由表5方差分析得出，C（芽孢桿菌）與D（發(fā)酵時(shí)間）對發(fā)酵菜粕的綜合評分影響極顯著（P＜0.01）。因而，本研究中以正交試驗(yàn)組合8（A3B2C1D3），即增香曲霉∶釀酒酵母SC17-1∶枯草芽孢桿菌BS15-3配比為3∶4∶2，且發(fā)酵時(shí)間為4 d時(shí)，菜粕發(fā)酵效果最佳；與菜粕原料相比，正交組合8的CP提高了8.22%、酸溶蛋白提高了102.54%、ITC 降低了68.77%、OZT降低了56.94%、單寧降低了6.44%。

表4 正交試驗(yàn)綜合評分結(jié)果

表5 正交試驗(yàn)綜合評分方差分析

2.3 正交驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，對組合A3B2C1D3進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行指標(biāo)測定，發(fā)酵菜粕干物質(zhì)基礎(chǔ)的CP、ITC 及OZT 依次為：45.50%、140.10 mg/kg、140.43 mg/kg。CP 水平略低于正交試驗(yàn)組中數(shù)據(jù)，而ITC及OZT水平更低，總體優(yōu)于正交試驗(yàn)結(jié)果。因而，以增香曲霉∶釀酒酵母SC17-1∶枯草芽孢桿菌BS15-3 配比=3∶4∶2，且發(fā)酵時(shí)間為4 d，作為菜粕發(fā)酵的最優(yōu)條件。

3 討論

3.1 不同菌株對菜粕發(fā)酵指標(biāo)的影響

使用不同菌株發(fā)酵菜粕對于菜粕品質(zhì)的提升程度不同。酵母菌作為一種干基CP 50%左右的真菌，將其添加至菜粕中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，可通過轉(zhuǎn)化非蛋白氮及菌體蛋白來提高發(fā)酵后菜粕的粗蛋白水平[13-14]。釀酒酵母自身的功能成分及代謝產(chǎn)物，可提高植物發(fā)酵過程所需的部分營養(yǎng)，刺激動物機(jī)體的免疫性能[15]。枯草芽孢桿菌可破壞植物細(xì)胞壁的成分及促進(jìn)部分酸性蛋白酶的活性、細(xì)菌素及抗菌肽的分泌，進(jìn)而促進(jìn)植物原料中大分子物質(zhì)的進(jìn)一步降解[16]。利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵菜粕，可產(chǎn)生枯草菌素及其他含氮化合物，可為菜粕發(fā)酵過程合成有機(jī)物提供氮源[17]。曲霉中部分菌株可作為蛋白酶的生產(chǎn)菌株，可分泌中性及酸性蛋白酶。此外，枯草芽孢桿菌亦可產(chǎn)生蛋白酶，促進(jìn)菜粕中營養(yǎng)物質(zhì)的釋放與吸收[18]。

3.2 不同菌株配比及發(fā)酵時(shí)間對菜粕發(fā)酵狀態(tài)的影響

利用不同菌株混菌發(fā)酵菜粕，對于菜粕品質(zhì)的提升效果優(yōu)于單一菌株發(fā)酵效果。Shi等[19]利用黑曲霉發(fā)酵菜粕，測得發(fā)酵后菜粕中硫苷水平降低43.72%、ITC水平降低58.82%，OZT水平降低44.91%。Ashayerizadeh 等[20]以黑曲霉、嗜酸乳桿菌及枯草芽孢桿菌混菌發(fā)酵菜粕，以料水比1∶1.2，在30 ℃條件下發(fā)酵25 d，于50 ℃溫度下干燥3 d，測得發(fā)酵后菜粕中硫苷水平降低67.81%，植酸水平降低82.85%，粗纖維水平降低47.33%。Fazhi 等[21]以枯草芽孢桿菌及植物乳酸菌發(fā)酵菜粕，原料由75%的菜粕及25%的血粉組成，以料水比1∶1.2，厭氧發(fā)酵21 d，于50～60 ℃下干燥3 d，測得發(fā)酵后菜粕中ITC降低80.61%。Hao等[22]用枯草芽孢桿菌及格氏乳桿菌以4∶1 的比例發(fā)酵菜粕，在32 ℃條件下發(fā)酵5 d，于50 ℃溫度下干燥36 h，測得發(fā)酵后菜粕的CP水平提高了5.67%，小肽水平提高了170.06%，硫苷水平降低了45.26%，粗纖維水平降低31.19%。Hu 等[10]用枯草芽孢桿菌、糞腸球菌及產(chǎn)朊假絲酵母以1∶1∶2的比例發(fā)酵菜粕在30 ℃條件下發(fā)酵3 d，原料由80%的菜粕、10%的麥麩及10%的玉米粉組成，以料水比1∶1，于45 ℃溫度下干燥24 h，測得發(fā)酵后菜粕的CP 水平提高5.98%，小肽水平提高88.76%，粗纖維水平降低24.68%。Wang 等[23]用乳桿菌、地衣芽孢桿菌及酵母菌以1∶1∶1的比例發(fā)酵菜粕，原料由93.9%菜粕、5%的麥麩、1.54%硫酸銨及0.16%磷酸二氫鉀組成，以料水比1∶1.34，在30 ℃條件下發(fā)酵3 d，測得發(fā)酵后菜粕的CP水平提高12.09%、中性洗滌纖維水平降低14.64%，硫苷水平降低85.05%。Tie等[24]利用分步發(fā)酵法發(fā)酵菜粕，先利用麥麩于30 ℃條件下培養(yǎng)黑曲霉3 d，再用接種黑曲霉的麥麩以5%的比例加至70%的菜粕與30%的麥麩組成的原料，于30 ℃條件下發(fā)酵36 h，測得發(fā)酵后菜粕的CP水平提高19.33%，蛋白質(zhì)消化率提高18.26%。

本試驗(yàn)以增香曲霉、釀酒酵母SC17-1及枯草芽孢桿菌BS15-3發(fā)酵菜粕，原料僅由菜粕組成，發(fā)酵后菜粕CP 水平提高8.22%，酸溶蛋白水平提高102.54%，ITC 降低了68.77%，OZT 降低了56.94%，單寧降低了6.44%。菜粕自身品質(zhì)、原料組成、發(fā)酵菌株組合及發(fā)酵時(shí)間都可以影響發(fā)酵菜粕的營養(yǎng)品質(zhì)。本研究還發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵對于菜粕真菌毒素的降解不具有同步性，發(fā)酵菜粕的AFB1 水平降低了65.22%、ZEN 水平降低了46.33%，而DON無明顯變化。

4 結(jié)論

依據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)酵菜粕的最佳菌株配比為增香曲霉∶釀酒酵母SC17-1∶枯草芽孢桿菌BS15-3=3∶4∶2，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間為4 d 時(shí)，菜粕的內(nèi)源毒素含量顯著降低，其發(fā)酵效果最佳。