馬 超, 賈 磊，* , 陳春秀, 何曉旭, 劉張倩, 于燕光 鄭德斌, 宓慧菁, 戴媛媛, 周 律

(1.天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221；2. 清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院，北京 100091)

引 言

半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)是我國廣受市場認(rèn)可的海水工廠化養(yǎng)殖魚類，其主要養(yǎng)殖方式為全封閉式循環(huán)水養(yǎng)殖，該模式具有節(jié)水節(jié)能、生態(tài)環(huán)保、高密度養(yǎng)殖等優(yōu)勢，能夠解決環(huán)境污染問題，提高水產(chǎn)品質(zhì)量。針對于養(yǎng)殖系統(tǒng)中殘餌溶蝕和糞便產(chǎn)生的氨氮過量積累[1]，循環(huán)水系統(tǒng)中生物過濾技術(shù)可降低氨氮、亞硝酸鹽氮等有害物質(zhì)的濃度達(dá)到養(yǎng)殖水體循環(huán)使用的目的[2]。生物濾池是循環(huán)水系統(tǒng)有效運(yùn)行的核心環(huán)節(jié)，而其中生物膜的細(xì)菌群落又起到了關(guān)鍵作用[3-6]。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者采用各種方法分析研究了循環(huán)水系統(tǒng)中生物濾池細(xì)菌群落，如用16S rRNA基因克隆文庫[7-8]、PCR-DGGE[9-10]等，相比這些傳統(tǒng)方法，宏基因組方法更能全面深入了解微生物群落組成和多樣性。雖然也有很多學(xué)者應(yīng)用高通量測序方法對循環(huán)水系統(tǒng)細(xì)菌群落進(jìn)行了研究[11-12]，但多數(shù)只關(guān)注于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)(α和β多樣性)，無法對其功能展開研究。目前，PICRUSt[13]功能預(yù)測分析在細(xì)菌群落多樣性分析中已經(jīng)廣泛應(yīng)用[14-16]，但在循環(huán)水生物濾池細(xì)菌研究中應(yīng)用較少，它的應(yīng)用將為探明生物濾池細(xì)菌群落組成和功能提供重要幫助。本研究從半滑舌鰨海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)三級生物濾池中采集水樣及生物填料上的生物膜，運(yùn)用高通量測序技術(shù)，對生物膜細(xì)菌群落多樣性及功能預(yù)測進(jìn)行初步研究，揭示了生物濾池內(nèi)部細(xì)菌群落的多樣性，為進(jìn)一步揭開研究生物濾池脫氮效果提供數(shù)據(jù)，對海水循環(huán)水系統(tǒng)中生物濾池的構(gòu)建、優(yōu)化及提高脫氮效率具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

半滑舌鰨循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)建于天津?yàn)I海新區(qū)天世農(nóng)水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，該系統(tǒng)自2018年1月開始運(yùn)行, 其水處理流程由養(yǎng)魚池、微濾機(jī)、臭氧-蛋白質(zhì)分離器、浸沒式生物過濾器、紫外線消毒等環(huán)節(jié)組成，系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定，日換水量約占總的 5%，循環(huán)次數(shù)為 20 次/d。2018 年4月開始養(yǎng)殖半滑舌鰨，于2019年4月采集樣品，分別從同一循環(huán)水系統(tǒng)的三級生物濾池隨機(jī)采集生物膜樣品及水體樣品。按照水流方向順序?qū)⑸餅V池分別標(biāo)為1號、2號、3號，并在每個濾池中選取3個采樣點(diǎn)用滅菌后的剪刀剪取彈性毛刷樣品約30 g放入50 mL滅菌離心管中；并用2 L無菌采水瓶采集水體樣品。所有生物膜及水體樣品各取平行樣3組(1號生物濾池生物膜樣品:A1,A2,A3；2號生物濾池生物膜樣品：B1，B2，B3；3號生物濾池生物膜樣品：C1，C2，C3；1號生物濾池水樣：A4，A5，A6；2號生物濾池水樣：B4，B5，B6；3號生物濾池水樣：C4，C5，C6)。所有樣品保存于預(yù)先滅菌的冰盒中，并迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品總DNA提取

所有水樣用直徑為0.22 μm的無菌微孔濾膜(津騰，中國)抽濾，濾膜剪碎后放入 50 mL無菌離心管中，按照E.Z.N.A.? Water DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA)試劑盒的說明，提取水體中的樣品總DNA；所有生物膜樣品管中注入PBS緩沖液(0.15 mol/L NaCl，0.1 mol/L Na 2 EDTA，pH 值 8)，使用漩渦振蕩器進(jìn)行震蕩 5 min，反復(fù)操作 8～10次，收集水樣，將水樣14 000 r/min 離心 15 min(4℃)，收集沉淀用于DNA提取，基因組DNA釆用FastDNA SPIN Kit for soil(MP Biomedicals, Illkirch, France)按照操作說明提取。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和高通量測序

采用細(xì)菌通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′ ) 和926R(5′-CCGTCAATTYYTTTRAGTTT-3′)對16S rRNA基因的V4-V5區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 2min；94 ℃30 s, 56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5min，10 ℃ 保溫，8個循環(huán)，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在Illumina MiSeq 2×300 bp平臺上由微基生物科技(上海)有限公司完成測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

所有序列在97%的相似水平下被歸納為多個OTU(operational taxonomic unit)，使用軟件Mothur進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，然后比對進(jìn)行物種信息注釋使用的是SILVA128數(shù)據(jù)庫。用Mothur生成稀疏曲線、α-多樣性指數(shù)，UniFrac距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)、聚類分析等。采用在線統(tǒng)計(jì)工具LEfSe分析生物膜與水體中細(xì)菌的豐富度差異。生物膜功能和代謝途徑預(yù)測采用PICRUSt軟件進(jìn)行分析，基于在線分析平臺(http://picrust.github.io/picrust/)[13]將16S rRNA測序結(jié)果與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得功能預(yù)測信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序結(jié)果和α-多樣性

高通量測序結(jié)果表明，生物濾池中所有生物膜樣品和水樣的平均測序有效序列條數(shù)分別為44755和44084。結(jié)果表明所有樣品具有豐富的群落組成(表1)，其中水樣的Sobs、Ace、Chao1指數(shù)均高于生物膜樣品，說明水樣中的細(xì)菌種類更多，細(xì)菌群落的豐富度較高。

表1 不同樣品細(xì)菌多樣性評估表

2.2 稀釋性曲線

稀釋性曲線用來說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理，及評價(jià)測序量是否足以覆蓋所有類群。本研究中18個生物濾池中的樣品細(xì)菌稀釋性曲線如圖1所示，隨著測序深度的增加物種豐富度也開始增加，但在測序條數(shù)達(dá)到20 000條以上時，曲線趨向平緩。結(jié)果表明本研究的實(shí)驗(yàn)測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，已經(jīng)能夠代表物種的豐富度。

2.3 細(xì)菌群落組成

高通量測序結(jié)果表明，生物濾池中細(xì)菌主要由27個門組成，包括變 形 菌 門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、藍(lán)藻細(xì)菌門(Cyanobacteria) 等(圖2)，其中變形菌門在所有樣品中都是最優(yōu)勢門類，在9個生物膜樣品中優(yōu)勢門類前三的細(xì)菌門類分別為變形菌門(Proteobacteria，49%～66%)，擬桿菌門(Bacteroidetes，15%～36%)，浮霉菌門(Planctomycetes，5.6%～11.7%)；而生物濾池中的水體樣本中的前三細(xì)菌門類分別為變形菌門(Proteobacteria，66%-80%)，藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria，5.7%～10.2%)，擬桿菌門(Bacteroidetes，5.9%～10.1%)。

圖2 不同樣品門水平上細(xì)菌相對豐度分布

兩組樣品微生物群落在屬分類水平均值分布情況如圖3，其中生物膜組樣品主要菌屬有Muricauda(7.46%)，Pseudomonas(3.88%)，Maribacter(2.31%)，其中屬于硝化細(xì)菌只有2類細(xì)菌，即氨氧化菌的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)和亞硝酸鹽氧化菌硝化螺菌屬(Nitrospira)，豐度均小于0.05%，生物膜樣品中含有59%未能分類的細(xì)菌。而養(yǎng)殖水體樣品中占比最高的菌屬是Pseudomonas(47.18%)，其次是Pseudomonas(3.71%)和Vibrio(2.86%)。

圖3 不同樣品屬水平上細(xì)菌相對豐度分布的分組均值

2.4 β-多樣性分析

基于unifrac距離的PCoA(principal co-ordinates analysis)和UPGMA(Unweighted pair group method with arithmetic mean)分析均能描述不同樣品間是否有顯著的微生物群落差異，如果兩個樣品的距離較近，那么則表示這兩個樣品的微生物群落組成較相似。本研究中的海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中生物濾池及其水樣細(xì)菌群落PCoA分析(unweighted unifrac)如圖4所示，在圖中所有生物膜樣品位于PC1軸左側(cè)，且每個生物濾池中的3個平行樣品距離較近，并遠(yuǎn)離其他2組；所有水體樣品位于PC1軸右側(cè)，除C5樣品外有較好的聚集性，且PC1軸的貢獻(xiàn)率達(dá)到了94.78%。UPGMA聚類分析結(jié)果(圖5)與PCoA分析結(jié)果相似，生物膜和養(yǎng)殖水體樣品分為2大組，以上結(jié)果均表明生物濾池中生物膜和養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有所差異，并且所有水體的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異不大，但不同生物濾池中生物膜細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有所差異。

圖4 生物濾池細(xì)菌多樣性的主坐標(biāo)分析

圖5 不同樣品UPGMA聚類圖 Fig.5 UPGMA clusters of different bacterial communities

2.5 LEfSe組間群落差異分析

通過使用在線統(tǒng)計(jì)工具LEfSe來進(jìn)一步分析生物膜與水體中細(xì)菌的豐富度差異，可以找出對樣品劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的群落或種屬，結(jié)果用聚類樹來表示(圖6)。結(jié)果表明，在門的水平上，生物膜樣品中6個門(Bacteroidetes、Planctomycetes、Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Chlorobi和Armatimonadetes)的細(xì)菌存在顯著差異；水體樣品中4個門(Proteobacteria、Cyanobacteria、Firmicutes和Actinobacteria)的細(xì)菌存在顯著差異。在屬的水平上，生物膜樣品中疣微菌門的Roseibacillus，浮霉菌門的Phycisphaera，酸桿菌門的Blastocatella，擬 桿 菌 門 的Muricauda、Psychroserpens、Chryseolinea，變形菌門的Mesorhizobium、Sphingorhabdus、Octadecabacter等 26個屬的細(xì)菌存在顯著差異; 水體中厚壁菌門的Brevibacillus，酸桿菌門的Acanthopleuribacter，擬桿菌門的Rubidimonas、Bacteroides和Dokdonia，變形菌門的Photobacterium、Vibrio、Pseudoalteromonas和Oceaniserpentilla等14個屬的細(xì)菌存在顯著差異。

圖6 不同樣品差異細(xì)菌分布

2.6 PICRUSt功能預(yù)測分析

為了獲得生物濾池生物膜細(xì)菌的功能，本研究采用PICRUSt軟件進(jìn)行菌群預(yù)測分析。通過比對KEGG數(shù)據(jù)庫(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)，共獲得6類生物代謝通路功能分析(一級功能層)，其中主要包括代謝(metabolism)、遺傳信息處理(genetic information processing)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)等(圖7)，占比分別為51.00%～52.35%、15.17%～16.73%和11.05%～14.01%。對預(yù)測基因三級功能層進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其主要由Transporters、General function prediction only、ABC transporters、DNA repair and recombination proteins等76個子功能組成，所有的樣品均發(fā)現(xiàn)有氮代謝功能(Nitrotoluene degradation)基因存在，且通過聚類分析表明，各級生物濾池生物膜細(xì)菌群落功能有所差異。

圖7 生物膜細(xì)菌群落PICRUSt功能預(yù)測分布(一級功能層)

3 討論

3.1 海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物濾池細(xì)菌群落組成

目前循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物濾池細(xì)菌群落組成的研究在國內(nèi)外已有開展[11,17-18]。Tal等[19]對海水金頭鯛循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物膜進(jìn)行了DGGE分析，發(fā)現(xiàn)濾池中有起硝化作用的氨氧化細(xì)菌和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(Nitrosomonascryotolerans)和硝化螺菌(Nitrospiramarina)。本實(shí)驗(yàn)則采用Illumina公司MiSeq測序平臺對3級生物濾池中生物膜和水體細(xì)菌群落組成進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其主要由變形菌門、擬桿菌門、浮霉菌門、藍(lán)藻細(xì)菌門等27個門，Nitrospira、Sphingomonas、Haliangium、Lysobacter、Gemmatimonas、Pseudomonas等屬的細(xì)菌組成，表現(xiàn)出細(xì)菌群落組成的豐富性。有研究表明變形菌門是海洋環(huán)境中的主要類群[21-22],本研究中發(fā)現(xiàn)生物濾池中的生物膜和養(yǎng)殖水體最優(yōu)勢菌群都是變形菌門，與Martins等[23]研究海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)細(xì)菌群落結(jié)果一致。本研究對三級生物濾池細(xì)菌群落進(jìn)行了分析，結(jié)果表明不同生物濾池生物膜細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有差異，細(xì)菌群落組成的PCoA分析表明3級的生物濾池中的養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為相似，生物膜細(xì)菌群落組成各不相同。

3.2 生物濾池中硝化作用分析

通過使用在線統(tǒng)計(jì)工具LEfSe分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生物膜與水體中的浮霉菌門細(xì)菌存在明顯差異，且在生物膜上發(fā)現(xiàn)有5.6%～11.7%的浮霉菌門細(xì)菌(圖2)。有研究發(fā)現(xiàn)在厭氧條件下，某些種類的微生物能夠發(fā)生以NO2-為電子受體, 以NH4+為電子供體, 將NH4+和NO2-轉(zhuǎn)變?yōu)榈獨(dú)獾纳^程[24-27]且這些微生物的系統(tǒng)發(fā)育地位屬于浮霉菌門細(xì)菌(Planctomycetes)[28]，因此推斷本研究循環(huán)水系統(tǒng)中生物膜含有大量浮霉菌門細(xì)菌參與進(jìn)行硝化作用。有研究表明，水體中常見與氮循環(huán)有關(guān)的細(xì)菌主要由α-、β-、γ-、δ-變形菌等組成，氨氧化細(xì)菌(ammonia oxidizing bacteria，AOB)主要有β-變形菌綱的亞硝化單胞菌(Nitrosomonas)、亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)和γ-變形菌綱的亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)等[29]。在屬水平上，本研究中生物濾池硝化細(xì)菌只有2類細(xì)菌，即氨氧化菌的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)和亞硝酸鹽氧化菌硝化螺菌屬(Nitrospira)，豐度都不高，并且在生物膜發(fā)現(xiàn)上含有超過50%未能分類的細(xì)菌(圖3)。之前就有研究表明，有細(xì)菌能夠進(jìn)行從氨到硝態(tài)氮的全部硝化過程[30-32]，這些微生物被定義為全程氨氧化微生物Comammox，并且Crab等研究循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)時同樣發(fā)現(xiàn)了此類細(xì)菌。所以生物膜上可能附著未能在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分類的全程氨氧化微生物。綜上所述，在本研究中的海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物濾池的生物膜起到了主要的硝化和反硝化作用，雖然生物膜上含有少量的亞硝化單胞菌屬和亞硝酸鹽氧化菌硝化螺菌屬細(xì)菌，但是同時發(fā)現(xiàn)大量的浮霉?fàn)罹臀茨芊诸惖募?xì)菌，推斷這些細(xì)菌有可能起到主要硝化作用，這些硝化細(xì)菌的反應(yīng)效率及條件還有待進(jìn)一步研究。

3.3 PICRUSt功能預(yù)測分析

之前關(guān)于循環(huán)水系統(tǒng)生物濾池細(xì)菌群落的高通量測序分析主要關(guān)注于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)(α和β多樣性)，對于其功能的研究開展較少[7,17]?；诟咄繙y序的PICRUSt功能預(yù)測分析在各種不同生境微生物研究中已經(jīng)開始應(yīng)用。張菲等[15]采用PICRUSt功能預(yù)測分析對丹江口庫區(qū)表層浮游細(xì)菌進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，表層浮游細(xì)菌涉及氨基酸運(yùn)輸和代謝、轉(zhuǎn)錄等24個基因功能家族，且氮代謝能力整體趨勢為庫心高于渠首。Cleary等[16]采用高通量測序方法對印度尼西亞的Spermonde 群島周邊海水、沉積物等細(xì)菌群落進(jìn)行研究，并使用PICRUSt預(yù)測其功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同樣品細(xì)菌群落功能上具有差異。目前PICRUSt功能預(yù)測分析在海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物濾池中生物膜研究中鮮見報(bào)道，為了探明不同級別的生物濾池生物膜上細(xì)菌功能，本研究將高通量測序的結(jié)果使用PICRUSt軟件進(jìn)行菌群預(yù)測分析。結(jié)果表明，生物膜上細(xì)菌主要涉及代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理等6 類生物代謝通路，表現(xiàn)出生物膜在功能上的豐富性。通過PCoA和UPGMA分析生物膜細(xì)菌群落時發(fā)現(xiàn)各級生物濾池生物膜細(xì)菌群落組成所有差異，且PICRUSt預(yù)測結(jié)果也表明各級生物濾池生物膜細(xì)菌功能也有較大差異,所以推斷不同的細(xì)菌群落組成造成了各級生物膜功能的差異。所有的樣品在第三級功能層均發(fā)現(xiàn)有氮代謝功能(Nitrotoluene degradation)，說明所有生物膜細(xì)菌群落均具有氮元素循環(huán)功能。該結(jié)果初步分析了海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物濾池中生物膜細(xì)菌功能的差異，但是使用PICRUSt軟件進(jìn)行菌群功能預(yù)測分析時有一定的局限性，為了更準(zhǔn)確的掌握生物膜降低養(yǎng)殖水體中氮、磷等元素過程中的菌群功能，還需在以后的研究中結(jié)合宏基因組測序和氮磷等元素循環(huán)功能基因分析。

4 結(jié)論

針對半滑舌鰨海水循環(huán)水系統(tǒng)生物濾池細(xì)菌群落和功能研究鮮見報(bào)道的現(xiàn)狀，采用16S rRNA基因測序技術(shù)分析對其細(xì)菌群落組成進(jìn)行分析，并采用PICRUSt軟件預(yù)測其功能．結(jié)果表明3級生物濾池具有豐富的群落組成，主要由變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、藍(lán)藻細(xì)菌門(Cyanobacteria)等為主；生物膜上含有少量的亞硝化單胞菌屬和亞硝酸鹽氧化菌硝化螺菌屬細(xì)菌，不同生物濾池中生物膜細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有較大差異，并且推斷生物膜中含有大量浮霉菌門細(xì)菌和未能分類的細(xì)菌參與進(jìn)行硝化作用，PICRUSt功能預(yù)測分析表明生物膜上細(xì)菌主要涉及代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理等6類生物代謝通路,各級生物濾池生物膜細(xì)菌群落功能有所差異,所有樣品均發(fā)現(xiàn)有氮代謝功能(Nitrotoluene degradation)的基因。本研究從細(xì)菌群落組成、細(xì)菌群落多樣性及功能預(yù)測等角度初步分析了海水循環(huán)水系統(tǒng)3級生物濾池生物膜的差異，為循環(huán)水系統(tǒng)高效運(yùn)行提供了參考依據(jù)。