章 峰，臧曉南*，徐曉婷

(1.中國海洋大學 海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

引 言

海洋紅藻與藍藻具有復雜的捕光系統(tǒng)，該系統(tǒng)由錨定到類囊體膜外側(cè)的藻膽體(Phycobilisome)結(jié)構(gòu)組成。藻膽體能吸收葉綠素捕光波長范圍以外的光，并將光能轉(zhuǎn)移至葉綠素和光合反應中心以進行光合作用，這使得藻類植物的光吸收范圍幾乎遍布了整個可見光區(qū)域[1]。藻藍蛋白(Phycocyanin)是藻膽體的重要組成部分，它能吸收550至650 nm范圍內(nèi)不同波長的光，并將之輸入光合作用系統(tǒng)[2]。而以葉綠素和載體蛋白構(gòu)成捕光復合物的綠色光合生物(green-lineage photosynthetic organisms)只能利用可見光中的藍紫光(430～450 nm)和橙紅光(640～660 nm)，而難以利用450～640 nm區(qū)域內(nèi)的光[3]。所以如果能夠利用藻藍蛋白拓寬綠色光合生物的捕光光譜，將有可能增強其光合作用，促進其生長。

萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是現(xiàn)代微藻研究中的模式生物之一。這種單細胞光合綠藻有著簡單的生命周期和易于獲得的突變體[4]。研究者們在萊茵衣藻的分子遺傳研究中開發(fā)出了大量成熟的工具和技術(shù)[5]。甚至有學者將萊茵衣藻稱為光合酵母[6]。在對光合作用的分析上，萊茵衣藻具有獨特的優(yōu)勢：在單細胞衣藻中更容易研究在不同環(huán)境條件下基因表達的整體調(diào)控；在含乙酸鹽的培養(yǎng)基中，萊茵衣藻的細胞數(shù)會在5～7 h內(nèi)翻一番，并在不到兩周的時間內(nèi)完成其生長周期，因此其遺傳分析很快[7]。因此，萊茵衣藻是研究異源捕光蛋白表達與光能傳遞的理想對象。

有光學活性的藻膽蛋白的異源重組表達已經(jīng)比較成熟。如，Tooley等人在大腸桿菌中表達了具有熒光活性的C-藻藍蛋白α亞基[8]。Jin等人成功異源表達了具有熒光活性的藻紅蛋白[9]。此外，藻膽蛋白在萊茵衣藻表達系統(tǒng)中也成功獲得了表達：Su等人在萊茵衣藻中成功表達了別藻藍蛋白β亞基和別藻藍蛋白雙亞基[10, 11]。但是目前關(guān)于在萊茵衣藻的中表達有光學活性的藻膽蛋白的報道很少見，而關(guān)于藻膽蛋白對萊茵衣藻光合作用的影響的研究更是罕見。

本研究中我們探究了具有光學活性的藻藍蛋白對萊茵衣藻光合作用與生長的影響，并比較了在光合自養(yǎng)和混合營養(yǎng)兩種營養(yǎng)方式下藻藍蛋白對萊茵衣藻的影響。而考慮到藻藍蛋白的光學活性與藻藍膽素息息相關(guān)，而藻藍膽素的生物合成基于血紅素，通過血紅素氧化酶和鐵氧還蛋白氧化還原酶催化的還原和異構(gòu)化步驟而產(chǎn)生[12]，血紅素氧化酶和鐵氧還蛋白氧化還原酶在合成具有光學活性的藻藍蛋白中至關(guān)重要。因此本研究在對藻藍蛋白進行研究的同時，也對血紅素氧化酶和鐵氧還蛋白氧化還原酶進行了研究。本研究為探索異源藻膽蛋白與類囊體膜間的光能傳遞奠定了基礎(chǔ)，并對以此為基礎(chǔ)構(gòu)建新型光合系統(tǒng)進行了嘗試。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

萊茵衣藻(C.reinhardtii)細胞壁缺失突變株cc849，購自衣藻資源中心(University of Minnesota)；基于萊茵衣藻cc849而制備的可穩(wěn)定表達鈍頂節(jié)旋藻FACHB 314藻藍蛋白的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻藻株Cr-PC和可穩(wěn)定表達鈍頂節(jié)旋藻FACHB 314藻藍蛋白、血紅素氧化酶與鐵氧還蛋白氧化還原酶的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻藻株Cr-PCHP，均獲于中國海洋大學海洋生命學院藻類遺傳技術(shù)與育種研究室。其中轉(zhuǎn)基因藻株Cr-PC和Cr-PCHP具有對潮霉素B的抗性，而對照cc849沒有。

所有萊茵衣藻藻株均在TAP培養(yǎng)基(pH 6.8)中混合營養(yǎng)培養(yǎng)，在HS培養(yǎng)基(pH 6.8)中光合自養(yǎng)培養(yǎng)，TAP培養(yǎng)基和HS培養(yǎng)基的配方如表1和表2所示。培養(yǎng)的溫度為23oC。光照強度為50 μmol·m-2s-1，光/暗周期為12:12 h。

表1 TAP培養(yǎng)基配方

表2 HS培養(yǎng)基配方Table 2 Formula of HS medium

1.2 77K低溫熒光發(fā)射光譜測定

將分別在HS培養(yǎng)基和TAP培養(yǎng)基中進行光合自養(yǎng)培養(yǎng)與混合營養(yǎng)培養(yǎng)的藻株cc849、Cr-PC和Cr-PCHP在50μmol·m-2s-1的光照強度中培養(yǎng)。

3000×g離心10 min以收獲細胞。根據(jù)Akio的方法，將細胞重懸于含有15%PEG4000的新鮮TAP培養(yǎng)基中[13]，將樣品稀釋至總?cè)~綠素濃度為50μg/mL(總?cè)~綠素濃度按照Porra等人的方法測得[14])。將樣品置于黑暗環(huán)境中暗適應15 min，然后裝入玻璃管中并在液氮中充分冷凍。將其裝入F-4600熒光光譜儀(Hitachi，日本)，測量樣品從600 nm至800 nm的熒光發(fā)射光譜，其中縫隙寬度為5 nm，激發(fā)波長為435 nm(葉綠素a的最大激發(fā)波長)和580 nm(藻藍蛋白的特征激發(fā)波長)。每個藻株的數(shù)據(jù)均來自于3個不同的生物學重復，且僅在p<0.05時具有顯著差異。

1.3 萊茵衣藻光合參數(shù)的測定

取分別在HS培養(yǎng)基和TAP培養(yǎng)基中進行光合自養(yǎng)培養(yǎng)與混合營養(yǎng)培養(yǎng)的藻株cc849、Cr-PC和Cr-PCHP，通過Dual-PAM-100測量系統(tǒng)(Heinz Walz GmbH，德國)測量其PS II和PS I的光合作用的表觀電子傳遞速率[15]。3000×g離心10 min以收集細胞，將獲得的細胞均勻重懸于新鮮的TAP培養(yǎng)基中，使得其總?cè)~綠素濃度達到50 μg/mL。將樣品在黑暗環(huán)境中暗適應3 min，然后測定樣品的快速光響應曲線，光化光光強設(shè)置為16、39、71、132、204、286、408、578、802、1087、1434和1857 μmol·m-2s-1，每次激發(fā)持續(xù)30 s。將轉(zhuǎn)基因藻株Cr-PC、Cr-PCHP和對照cc849培養(yǎng)到第8天以進行測量。每個藻株均設(shè)有3個生物學重復，且僅在p<0.05時具有顯著差異。

1.4 生長曲線與干重積累測定

測量了在HS培養(yǎng)基中光合自養(yǎng)生長和在TAP培養(yǎng)基中混合營養(yǎng)生長的轉(zhuǎn)基因藻株Cr-PC、Cr-PCHP和對照cc849的生長速率和干重積累。每個樣品都設(shè)有3個生物學重復，且僅在p<0.05時具有顯著差異。

實驗前先在含有10 μg/mL潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基中活化所需藻株。再將之接種到不含潮霉素B的300 mL培養(yǎng)基中。接種后的初始細胞濃度為6×105cells/mL。每天測量各樣品在750 nm處的吸光值，并繪制成生長曲線。在接種后的第10天取9 mL培養(yǎng)物，3800×g離心15 min收集細胞，并用雙蒸水洗滌2次，在冷凍干燥機中干燥至恒重后測定干重。

1.5 統(tǒng)計與分析

本研究中生物學重復的設(shè)置情況和數(shù)據(jù)的分析方法如下所示。在2種培養(yǎng)條件下，本研究中所有的藻株皆設(shè)有3個生物學重復。在數(shù)據(jù)分析中，對每個藻株的每個數(shù)據(jù)點都根據(jù)生物學重復取其平均值。本研究使用Microsoft Excel計算了每個數(shù)據(jù)點平均值的標準差，并顯示于圖中。本文使用Microsoft Excel的T-Test函數(shù)計算2組數(shù)據(jù)間的p值，并且僅在p<0.05時認為各數(shù)據(jù)點間具有顯著差異，在p>0.05時我們認為各數(shù)據(jù)點間沒有顯著的差異。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻藻株的77K低溫熒光發(fā)射光譜分析

將在HS培養(yǎng)基和TAP培養(yǎng)基中培養(yǎng)的藻株Cr-PC，Cr-PCHP和對照cc849，用435 nm(葉綠素a的特征激發(fā)波長)和580 nm(藻藍蛋白的特征激發(fā)波長)的激發(fā)光激發(fā)并測量其低溫熒光發(fā)射光譜，據(jù)此確定轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中重組藻藍蛋白的光學活性以及藻藍蛋白對萊茵衣藻光合系統(tǒng)的影響。

如圖1-A和圖1-C所示，當激發(fā)光波長為435 nm時，無論是培養(yǎng)在HS培養(yǎng)基中的還是在TAP培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)基因藻株Cr-PC、Cr-PCHP，其在670 nm處都有一個對照中沒有的熒光發(fā)射峰，且Cr-PCHP的峰值高于Cr-PC(p= 3.83×10-6和4.92×10-4)。此時轉(zhuǎn)基因藻株和對照中代表著PS II和PS I的熒光發(fā)射峰(685 nm和715 nm)[16]峰值大小相當(p>0.05)。當激發(fā)光波長為580 nm時，如圖1-B所示，培養(yǎng)在HS培養(yǎng)基中的Cr-PCHP在685 nm和715 nm處的熒光發(fā)射峰峰值高于Cr-PC(p=6.78×10-7和4.92×10-13)，且兩者峰值都高于對照(p= 2.43×10-9、1.03×10-17和7.55×10-3、8.97×10-15)。此時Cr-PCHP在藻藍蛋白的特征峰620 nm處的峰值亦高于Cr-PC(p=1.03×10-4)，且兩者都高于對照(p=4.66×10-9和8.52×10-6)(天然條件下藻藍蛋白的熒光特征發(fā)射峰在640 nm處[17]，但蛋白質(zhì)的重組表達可能使其熒光發(fā)射峰產(chǎn)生遷移)。而對于培養(yǎng)在TAP培養(yǎng)基中的藻株，如圖1-D所示，685 nm處Cr-PCHP和Cr-PC的熒光峰峰值相差無幾(p=1.64×10-1)，且都顯著高于對照(p=5.46×10-3和2.00×10-4)，715 nm處Cr-PCHP和Cr-PC的峰值則略低于對照,但不顯著(p>0.05)?？偟膩砜矗珻r-PCHP和Cr-PC的光合系統(tǒng)有所提升。與此同時，Cr-PCHP和Cr-PC在620 nm處的藻藍蛋白的特征峰峰值差不多(p= 5.56×10-2)，但它們都高于對照(p=1.46×10-4和4.09×10-5)。

圖1 HS培養(yǎng)基和TAP培養(yǎng)基中的cc849，Cr-PC和Cr-PCHP藻株的低溫熒光發(fā)射光譜。Fig.1 Low-temperature fluorescence emission spectra of cc849, Cr-PC and Cr-PCHP in HS medium and TAP medium.A：435 nm激發(fā)時，HS培養(yǎng)基中各藻株的熒光發(fā)射光譜；B：580 nm激發(fā)時，HS培養(yǎng)基中各藻株的熒光發(fā)射光譜；C：435 nm激發(fā)時，TAP培養(yǎng)基中各藻株的熒光發(fā)射光譜；D：580 nm激發(fā)時，TAP培養(yǎng)基中各藻株的熒光發(fā)射光譜

以上結(jié)果表明，在表達了藻藍蛋白的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中存在著從藻藍蛋白到光合作用系統(tǒng)的光能傳遞，相比于對照cc849，轉(zhuǎn)基因藻株Cr-PCHP和Cr-PC的光合作用都受到了促進。當培養(yǎng)在HS培養(yǎng)基中時，Cr-PCHP中藻藍蛋白的光學活性高于Cr-PC，此時Cr-PCHP的光合作用受到的促進也更大；當培養(yǎng)在TAP培養(yǎng)基中時，Cr-PCHP中藻藍蛋白的光學活性與Cr-PC相差無幾，兩者光合作用所受到的促進也相當。

2.2 重組藻藍蛋白表達對萊茵衣藻光合作用影響的分析

測定了在HS培養(yǎng)基和TAP培養(yǎng)基中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因藻株Cr-PC，Cr-PCHP和對照cc849光合作用的表觀電子傳遞速率(ETRPS I和ETRPS II)。對于培養(yǎng)在HS培養(yǎng)基中的樣品，如圖2-A和2-B，轉(zhuǎn)基因藻株的ETRPS I和ETRPS II值都高于對照(p=4.55×10-2、4.64×10-2、5.75×10-3和1.46×10-2)，且藻株Cr-PCHP的ETRPS I和ETRPS II都高于Cr-PC(p=8.54×10-3和4.22×10-2)。即在HS培養(yǎng)基中光合自養(yǎng)生長時，Cr-PCHP和Cr-PC的光合作用比之對照都增強了，且Cr-PCHP增強得更多。而對于在TAP培養(yǎng)基中混合營養(yǎng)生長的樣品，如圖2-C和2-D所示，對照、Cr-PCHP和Cr-PC的ETRPS I依次遞增(p=1.27×10-2、3.85×10-2和4.95×10-2)；對照、Cr-PC和Cr-PCHP的ETRPS II大小相當，差異不顯著(p =2.12×10-1、2.61×10-1和2.12×10-1)。所以在TAP培養(yǎng)基中，Cr-PCHP和Cr-PC的光合作用比之對照也得到了增強，但其增強幅度低于HS培養(yǎng)基中的相同藻株。

圖2 HS培養(yǎng)基和TAP培養(yǎng)基中cc849，Cr-PC和Cr-PCHP藻株P(guān)S I和PS II的表觀電子傳遞速率。Fig.2 Apparent electron transfer rates of PS I and PS II of cc849, Cr-PC and Cr-PCHP in HS medium and TAP medium.A：HS培養(yǎng)基中各藻株的ETRPS I曲線；B：HS培養(yǎng)基中各藻株的ETRPS II曲線；C：TAP培養(yǎng)基中各藻株的ETRPS I曲線；D：TAP培養(yǎng)基中各藻株的ETRPS II曲線

2.3 重組藻藍蛋白的表達對萊茵衣藻生長和生物量積累的影響

分析各藻株的生長曲線和干重積累情況，以研究轉(zhuǎn)基因藻株是否可以比對照cc849更快地生長和/或積累更多的生物質(zhì)。對于培養(yǎng)在HS培養(yǎng)基中的樣品，在光合自養(yǎng)生長時，Cr-PCHP的生長速率和最終細胞密度都高于對照(p=3.66×10-2)，而Cr-PC的生長速率和最終細胞密度則與對照相當(p=6.71×10-1)(圖3-A)。分析各藻株的干重積累情況，對照、Cr-PC和Cr-PCHP的干重依次遞增(p=2.82×10-2、3.26×10-2和9.32×10-3)(圖3-B)。即光合自養(yǎng)生長時，胞內(nèi)藻藍蛋白光學活性更強的Cr-PCHP能夠生長的更迅速并積累更多的生物質(zhì)。對于培養(yǎng)在TAP培養(yǎng)基中的樣品，在混合營養(yǎng)生長中，3個藻株在指數(shù)期的生長速率大小相當，藻株Cr-PC的最終細胞密度與對照相當(p=3.18×10-1)，但Cr-PCHP的最終細胞密度顯著低于Cr-PC和對照(p=1.93×10-2和5.20×10-3)(圖3-C)。分析各藻株的干重積累情況，Cr-PC的干重高于對照，而Cr-PCHP的干重則顯著低于對照(p=1.12×10-2)。即盡管胞內(nèi)藻藍蛋白光學活性相當，但是相比于對照，Cr-PC能夠積累更多的生物質(zhì)，而Cr-PCHP的生長則受到了顯著的抑制。

圖3 HS培養(yǎng)基和TAP培養(yǎng)基中cc849，Cr-PC和Cr-PCHP藻株的生長曲線和生物量積累。Fig.3 Growth curves and biomass accumulation of cc849, Cr-PC and Cr-PCHP in HS medium and TAP media.A：HS培養(yǎng)基中各藻株的生長曲線；B：HS培養(yǎng)基中各藻株的干重積累；C：TAP培養(yǎng)基中各藻株的生長曲線；D：TAP培養(yǎng)基中各藻株的干重積累

3 討論

本研究基于能穩(wěn)定表達鈍頂節(jié)旋藻FACHB 314藻藍蛋白的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻藻株Cr-PC和能穩(wěn)定表達鈍頂節(jié)旋藻FACHB 314藻藍蛋白、血紅素氧化酶與鐵氧還蛋白氧化還原酶的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻藻株Cr-PCHP，探究了光合自養(yǎng)和混合營養(yǎng)條件下藻藍蛋白對萊茵衣藻光合作用和生長的影響。

77K低溫熒光發(fā)射光譜結(jié)果顯示，當激發(fā)光波長為435 nm時，轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻在670 nm處有著對照中沒有的峰。在天然藻膽體中，能量的傳遞涉及3種攜有發(fā)色團的蛋白——LCM、β16和αB，它們的最大熒光發(fā)射峰為680 nm，負責將藻膽體捕獲的光能傳遞給類囊體膜上的葉綠素[18]。轉(zhuǎn)基因藻株中重組藻藍蛋白可能能夠直接或通過某些中介將能量傳遞給萊茵衣藻自身的光合系統(tǒng)核心，而此處位于670 nm處的熒光發(fā)射峰可能意味著轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻正處于這種能量傳遞的過程中。當激發(fā)光波長為580 nm時，相比于對照，Cr-PCHP和 Cr-PC的光合系統(tǒng)都得到了促進。HS培養(yǎng)基中的Cr-PCHP中的藻藍蛋白的熒光活性高于Cr-PC，Cr-PCHP的光合系統(tǒng)所受到的促進也大于 Cr-PC。而在TAP培養(yǎng)基中，Cr-PCHP和 Cr-PC中藻藍蛋白的熒光活性相近，Cr-PCHP和 Cr-PC所受到的促進也相當，且此時轉(zhuǎn)基因藻株的光合系統(tǒng)的提升幅度要低于HS培養(yǎng)基中的藻株。值得一提的是，由于血紅素氧化酶與鐵氧化蛋白氧化還原酶的缺失，Cr-PC中理應沒有藻藍膽素合成，其藻藍蛋白應當沒有光學活性[19]。但在Cr-PC中也檢測到了熒光藻藍蛋白的特征峰，這可能是因為萊茵衣藻中可能存在與藻藍膽素相似的色基，可以結(jié)合藻藍蛋白并賦予其光學活性。鑒于有學者從萊茵衣藻中分離出了結(jié)構(gòu)與膽色素相似的色素[20]，所以這是可能發(fā)生的。

對各藻株光合作用表觀電子傳遞速率的分析也證實了以上推斷，該結(jié)果表明：HS培養(yǎng)基中，Cr-PCHP和Cr-PC的光合作用比之對照都增強了，且Cr-PCHP增強得更多；而TAP培養(yǎng)基中，Cr-PCHP和Cr-PC的光合作用比之對照也得到了增強，但增強幅度低于HS培養(yǎng)基中的相同藻株。線性電子傳輸中的ATP和NAD(P)H在卡爾文循環(huán)中被消耗，而環(huán)式光磷酸化產(chǎn)生的ATP可用于其他代謝過程，因此對細胞生長具有積極作用[21]，所以此處萊茵衣藻光合作用電子傳遞速率的上升利于其生長與生物質(zhì)的積累。

對各藻株生長曲線與干重積累的分析表明，HS培養(yǎng)基中的Cr-PCHP的生長速率更快，干重更大，而Cr-PC雖然無法生長得更快，但它也能積累更多的生物質(zhì)。而在TAP培養(yǎng)基中，Cr-PCHP的生長速度、最終細胞密度和干重都顯著低于對照，這可能是因為當光照強度僅為50 μmol·m-2s-1時，混合營養(yǎng)條件下萊茵衣藻主要依靠培養(yǎng)基中的營養(yǎng)生長，而多種外源蛋白的體內(nèi)表達給萊茵衣藻帶來了能量的負荷。有學者在萊茵衣藻中過表達了果糖1,6-二磷酸酶，并發(fā)現(xiàn)了高能負荷對細胞的生長有害[22]?；旌蠣I養(yǎng)條件下藻藍蛋白對萊茵衣藻光合作用的提升并不能起到主導作用，且會被外源蛋白表達所帶來的能量負荷抵消一部分，甚至外源蛋白的大量表達可能會拖慢萊茵衣藻的生長。所以TAP培養(yǎng)基中Cr-PCHP的生長受到抑制，而胞內(nèi)外源蛋白表達更少的Cr-PC雖然能積累更多的生物質(zhì)，但其生長速率和最終細胞密度卻也沒有得到顯著的提升。

HS培養(yǎng)基中不含任何碳源，萊茵衣藻在其中的生長完全依靠自身光合作用[23]。而TAP培養(yǎng)基中富含乙酸鹽[24]，乙酸鹽是萊茵衣藻生長的優(yōu)秀碳源，萊茵衣藻生長于其中時不僅能依靠光合作用生長，還能夠依靠培養(yǎng)基中的碳源，所以其生長速率遠大于在HS培養(yǎng)基中光合自養(yǎng)生長的相同藻株。相比于在TAP培養(yǎng)基中混合營養(yǎng)生長的萊茵衣藻，生長于HS培養(yǎng)基中的萊茵衣藻獲得的全部能量都源自光合作用，此時萊茵衣藻因藻藍蛋白對其光合作用促進而額外獲得的能量在其獲得的總能量中的占比可能更大，所以轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻相較于對照的生長優(yōu)勢也可能會更突出。

綜上所述，表達了藻藍蛋白的Cr-PC和表達了藻藍蛋白、血紅素氧化酶和鐵氧還蛋白氧化還原酶的Cr-PCHP中存在著自藻藍蛋白到光合反應中心的光能傳遞，這為研究藍藻光合元件在其他綠色光合生物中的應用奠定了理論基礎(chǔ)。本研究表明，藻藍蛋白能夠顯著促進在HS培養(yǎng)基中光合自養(yǎng)生長的萊茵衣藻的光合作用與生長，且這種促進在藻藍蛋白光學活性更強的Cr-PCHP中更顯著。而對于在TAP培養(yǎng)基中混合營養(yǎng)生長的萊茵衣藻，藻藍蛋白能夠促進其光合作用，但效果不如光合自養(yǎng)條件下顯著，且此時藻藍蛋白不能顯著促進萊茵衣藻的生長。