趙瀟瀟 于秋紅 嵇江淮 王世佳王仁東李冬果*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)臨床生物力學(xué)基礎(chǔ)研究北京市重點實驗室，北京 100069；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院高壓氧科，北京 100070；4.浙江腫瘤醫(yī)院放射物理科，杭州 310022；5.浙江省放射腫瘤學(xué)重點實驗室，杭州 310022)

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)是最常見且最致命的腫瘤之一，被歸類為Ⅳ級膠質(zhì)瘤[1]。它是一種高度侵襲性腫瘤其特征是腦血管的改變和周圍組織沿血管空間的逐漸侵襲[2]。GBM細(xì)胞通常會侵入距腫瘤塊幾厘米的地方，甚至可以跨入對側(cè)半球[3]。目前GBM的治療標(biāo)準(zhǔn)[4]包括手術(shù)切除，然后輔以放射治療(以下簡稱放療)和輔助治療。但由于這些腫瘤的彌散性浸潤性質(zhì)，很少能實現(xiàn)完全切除，GBM患者在治療結(jié)束后容易復(fù)發(fā)，中位生存時間約15個月，且預(yù)后較差[5-6]。因此，迫切需要在GBM準(zhǔn)確的分子機制和可靠的治療靶點的研究中取得新進展。

癌癥是異常遺傳和表觀遺傳事件的結(jié)果。表觀遺傳機制是無法用DNA序列的變化來解釋的穩(wěn)定遺傳特征，與組蛋白修飾一樣，DNA甲基化并不影響基因組DNA序列本身[7]，而是在CG二核苷酸胞嘧啶上增加一個甲基(CH3)基團。在哺乳動物中，5 mC參與了長期的沉默過程，如X染色體失活、基因組印記、生殖系基因的體細(xì)胞沉默和重復(fù)DNA元素的沉默[8]。根據(jù)DNA甲基化的異常變化對腫瘤的診療和預(yù)測生物標(biāo)志物被認(rèn)為具有廣泛的前景。

近年來，多是對GBM中啟動子異常甲基化動力學(xué)進行研究[9]，也有少量對增強子甲基化方面的研究[10]。異常甲基化增強子會導(dǎo)致多種疾病，其中包括多種癌癥的基因表達異常[11]。研究[12]顯示，與啟動子相比，增強子區(qū)域的甲基化狀態(tài)與靶基因表達的相關(guān)性更強。然而，只有少量研究[13-14]關(guān)注增強子區(qū)域且增強子甲基化模式在GBM中仍不清楚。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及預(yù)處理

本研究從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫中下載GBM腫瘤樣本(GSE36278)和正常樣本(GSE42861)的甲基化數(shù)據(jù)，包括136個腫瘤樣本和58個正常樣本。腫瘤樣本和正常樣本的DNA甲基化數(shù)據(jù)是通過Infinium HM450k平臺用同樣方法獲得的。從基因組數(shù)據(jù)共享數(shù)據(jù)庫(genomic data commons,GDC)數(shù)據(jù)門戶下載患者臨床數(shù)據(jù)和136例GBM樣本的表達數(shù)據(jù)。人類全基因組的注釋數(shù)據(jù)(V19)收集于GENCODE數(shù)據(jù)庫[15]。

對于甲基化數(shù)據(jù)，每個探針的甲基化水平用β值表示。β值=Imeth/(Imeth+Iunmeth)，其中Imeth為甲基化強度，Iunmeth為未甲基化強度。為確保甲基化水平的準(zhǔn)確性，移除在所有樣本中的甲基化水平超過30%為缺失值的探針。然后，本研究使用 “DMwR” R包中的knnImputation函數(shù)[16]對甲基化數(shù)據(jù)缺失值進行處理。將下載的RNA-seq(FPKM)數(shù)據(jù)使用log2轉(zhuǎn)換進行標(biāo)準(zhǔn)化，表達值為0的用數(shù)據(jù)集中的最小正數(shù)代替，最終獲得蛋白編碼基因(protein-coding genes，PCGs)的表達譜數(shù)據(jù)。

1.2 構(gòu)建增強子區(qū)域和啟動子區(qū)域

本研究整合已文獻[17]和GPL13534注釋文件，從而獲得了位于增強子的探針。本研究將這兩部分探針合并，并刪除重復(fù)的探針。結(jié)果保留161 708個增強子探針用于后續(xù)分析。已有研究[18-19]顯示，典型增強子區(qū)域的中位間隔大小約為1 000 bp。因此，本研究以一個增強子探針坐標(biāo)為基準(zhǔn)，分別向其上游和下游擴展500 bp的區(qū)間來構(gòu)建增強子區(qū)域。重疊的增強子區(qū)域被連接，并擴展成較大的區(qū)間，然后計算增強子區(qū)域中CpG探針的平均值，作為增強子區(qū)域的DNA甲基化水平[20]。

由于基因不僅受增強子甲基化的調(diào)控，也受啟動子甲基化的調(diào)控。為了獲得只受差異甲基化增強子區(qū)域(differential methylation enhancer regions, DMERs)調(diào)控的基因，本研究需要重新注釋啟動子區(qū)域，鑒別出可能受啟動子甲基化調(diào)控的基因，然后移除這些基因。本研究定義將基因轉(zhuǎn)錄起始位點(transcription start site, TSS)上游2 kb區(qū)域作為啟動子區(qū)，基因的DNA甲基化水平為映射到其啟動子區(qū)域的探針平均值[21-22]。

1.3 識別受差異甲基化增強子區(qū)域調(diào)控的靶基因

本研究利用基于線性模型設(shè)計的R包“l(fā)imma”[23]來識別腫瘤與正常樣本之間的DMERs和差異啟動子甲基化基因(differential promoter methylation genes, DPMGs)。采用Benjamini-Hochberg(BH)方法[24]對P進行校正。同樣，本研究也鑒定了DMERs以進行進一步分析。本研究選擇log2(FC)≥0.2和adjustedP≤0.05 的增強子區(qū)域作為高甲基化增強子區(qū)域，將log2(FC)≤-0.2 和adjustedP≤0.05 的增強子區(qū)域作為低甲基化增強子區(qū)域。為了獲得僅受DMERs調(diào)控的基因，本研究需要重新注釋啟動子區(qū)域，移除可能受啟動子甲基化調(diào)控的基因。研究[25]顯示，增強子和基因之間已知的最大距離約為1 Mbp。因此，本研究選擇了位于同一染色體上的DMER-PCGs對，基因的TSS與增強子區(qū)域之間的最大線性距離為1 Mbp。本研究用皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient, PCC)計算DMER與基因表達之間的相關(guān)性。基因表達被增強子甲基化負(fù)調(diào)控，高甲基化增強子區(qū)域可下調(diào)甚至沉默基因表達，而低甲基化增強子區(qū)域則傾向于激活基因表達[26]，因此本研究只保留了PCC<-0.2的DMER-PCGs對，且P≤0.01。

1.4 功能富集分析

為了預(yù)測DMERs調(diào)控的PCGs的功能，采用富集分析方法，對受低甲基化增強子區(qū)域調(diào)控的PCGs進行功能和通路的顯著性分析，使用R包“clusterProfiler”[27]來預(yù)測PCGs的功能。通過BH方法校正P，如果校正后的P≤0.05，該生物過程(biological process, BP)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)就認(rèn)為是顯著的。通過R包‘ggplot2 ’進行顯示。

1.5 生存分析

為了鑒別挑選出的PCGs是否具有良好的預(yù)后效果，本研究基于152個GBM患者的表達譜信息，依據(jù)中值將患者分為兩組。所有的研究均使用R 4.0.2完成。Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢測被用來評估兩組患者的生存差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GBM中增強子區(qū)域甲基化譜的構(gòu)建

為了研究在GBM中增強子的DNA甲基化模式，本研究應(yīng)用計算策略將增強子探針注釋到Infinium 450K陣列，從而構(gòu)建GBM增強子區(qū)域甲基化譜。在本研究中，增強子探針的收集來自先前發(fā)表的文獻的[17]補充文件和GPL13534注釋文件。利用上述方法構(gòu)造了113 178個非重疊增強子區(qū)域。其中增強子區(qū)域長度為1 000 bp占比79.99%,長度為>1 000 bp和<2 000 bp占比17.79%，其他占比2.22%(圖1A)。同樣，本研究將Infinium 450K陣列重新注釋到基因的啟動子區(qū)域。最終54 477個探針位于20 386個基因啟動子區(qū)域。雖然每個基因都有幾個探針定位到相應(yīng)的啟動子區(qū)域，但本研究只計算該基因啟動子中DNA甲基化探針的平均值作為該基因的DNA甲基化水平。

2.2 識別受差異增強子區(qū)域調(diào)控的基因

在對增強子區(qū)域甲基化譜進行預(yù)處理后，本研究從136個GBM樣本和58個正常組織樣本中識別出16 287個DMERs，其中包括2 271個高甲基化增強子區(qū)域和14 016個低甲基化的增強子區(qū)域。類似地，本研究基于基因啟動子甲基化譜共鑒別出4 889個DPMGs。為了獲得表達嚴(yán)格受差異啟動子甲基化調(diào)控的基因，本研究進一步計算每個DPMG甲基化值與其對應(yīng)基因表達值之間的PCC。結(jié)果顯示，共識別出167個可能受啟動子甲基化調(diào)控的基因，其中有144個低甲基化基因和23個高甲基化基因，這些基因?qū)慌懦谘芯恐狻榱舜_定哪些基因受DMERs調(diào)控，本研究結(jié)合多組學(xué)數(shù)據(jù)建立增強子與其靶基因(DMERs-相關(guān)基因)的關(guān)聯(lián)模型(如上方法描述)。

由于已知增強子甲基化水平與染色質(zhì)活性呈負(fù)相關(guān)[28]，本研究只保留了PCC<-0.2的DMER-基因?qū)?。最后，本研究得到?95對DMER-PCGs，其中包含有593個低甲基化增強子區(qū)域，82個高甲基化增強子區(qū)域和642個PCGs。整體來看，GBM中存在明顯的低甲基化模式(圖1B)。

2.3 靶基因的功能富集分析

為了評估DMERs調(diào)控的靶基因的生物學(xué)特性，本研究對642個PCGs進行功能富集分析。結(jié)果顯示，PCGs富集在許多與腫瘤進程相關(guān)的生物過程，比如細(xì)胞凋亡、突觸信號傳送與調(diào)節(jié)、組蛋白H3-K79甲基化的調(diào)控(圖1C)。對于KEGG通路富集分析，本研究發(fā)現(xiàn) PCGs在 KEGG中富集出多條與 GBM 相關(guān)的通路，比如ErbB(EGFR)、神經(jīng)營養(yǎng)因子、黏著斑黏附(圖1D)。

圖1 GBM中增強子區(qū)域的DNA甲基化模式

2.4 GBM中預(yù)后良好的PCGs的鑒別

為了評估這些表達受DMERs影響的PCGs是否可以作為GBM的預(yù)后因子，本研究將表達數(shù)據(jù)與患者臨床信息相結(jié)合，基于生存分析的結(jié)果，獲得了45個與GBM整體存活相關(guān)的PCGs(P<0.05，表1)。這些基因的異常表達可能是由于增強子異常甲基化調(diào)控的。它們可能是GBM潛在的診斷和治療的生物標(biāo)志物。在本研究中，DTX1和SLC2A3 在GBM中均屬于表達上調(diào)的基因。DTX1和SLC2A3 基因高表達組患者的生存期顯著縮短且預(yù)后差，可作為GBM患者的獨立預(yù)后因素(圖2)。

圖2 DTX1和SLC2A3基因生存分析

表1 預(yù)后良好的PCGs

3 討論

研究[12, 29]表明增強子通過甲基化介導(dǎo)表觀遺傳調(diào)控，對靶基因的表達進行異常調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致人類疾病。表觀遺傳調(diào)控已成為DNA甲基化等生物醫(yī)學(xué)研究的熱點[30]。癌癥中DNA甲基化的變化被認(rèn)為是開發(fā)有效的診斷、預(yù)后和預(yù)測標(biāo)志物的靶點。最近的研究[31-33]也報道了一些基因啟動子在GBM中的異常甲基化。然而，到目前為止，使用異常甲基化增強子識別GBM生物標(biāo)志物的研究很少。

本研究通過構(gòu)建增強子區(qū)域，對其進行差異甲基化分析并鑒別出可能受DMERs調(diào)控的PCGs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DMERs在GBM中多呈現(xiàn)一種低甲基化的模式。為了評估PCGs的生物學(xué)功能，對這些基因進行功能富集分析。本研究結(jié)果顯示PCGs參與了許多與腫瘤發(fā)生及進程相關(guān)的生物過程。由此推斷這些受DMERs調(diào)控的PCGs更有可能成為GBM潛在的診斷和治療的生物標(biāo)志物。其中EGFR 在GBM 和膠質(zhì)瘤中所發(fā)揮的作用已被廣泛研究，其可以通過促進血管生成和細(xì)胞侵襲從而促進腫瘤的惡化[34]。Neurotrophin 為 GBM 發(fā)展提供了微環(huán)境，并且促進腫瘤浸潤細(xì)胞的增生[35]。Huber等[36]發(fā)現(xiàn)DTX1的過表達增加了細(xì)胞的遷移和侵襲，這與ERK激活、miR-21水平和內(nèi)源性Notch水平相關(guān)。DTX1的Notch通路似乎是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的一種致癌因子，這些發(fā)現(xiàn)提供了新的潛在的治療靶點。研究[37-38]表明SLC2A3 在GBM中高表達,沉默期的表達可以抑制GBM細(xì)胞的增生和侵襲能力。本研究結(jié)果表明DTX1和SLC2A3 在GBM中表達的上調(diào)可能是受增強子區(qū)域的低甲基化調(diào)控，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生與發(fā)展。

然而，這項研究有一些需要強調(diào)的局限性。GBM的樣本采集是一個問題，這一缺陷可能會在一定程度上影響最終的結(jié)果。此外，本研究結(jié)果基于生物信息學(xué)分析。由于技術(shù)和時間限制，本研究沒有驗證在GBM動物模型和GBM患者腦組織中的結(jié)果。未來的功能研究和分子實驗仍需進一步探索其作用機制。

綜上，本研究通過構(gòu)建GBM中較為全面的增強子區(qū)域的甲基化譜，鑒定出GBM中表達可能受DMERs調(diào)控的PCGs，挖掘出與GBM預(yù)后相關(guān)的PCGs并加深對GBM中差異甲基化增強子調(diào)控模式的理解。同時，本研究為在表觀遺傳方面識別潛在的GBM生物標(biāo)志物和治療靶點提供了新的思路。