熊果酸殼聚糖納米顆粒的制備工藝優(yōu)化及評價

趙路潔，段續(xù),2*，曹偉偉，任廣躍,2，劉盼盼，任星

1(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽，471023)2(糧食儲藏安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州，450001)

熊果酸是一種存在于天然植物中的代表性的五環(huán)三萜類小分子化合物[1]。熊果酸具有廣泛的生物學活性，如保肝、抗炎、抗氧化、美白、抗菌和抗糖尿病等作用[2-3]。此外，熊果酸還具有毒性低，易從自然界獲取的特點[4]。盡管熊果酸具有各種生物活性和安全性，但由于其水溶性差且生物利用度低，因此尚未廣泛應用于保健產(chǎn)品和化妝品等產(chǎn)品中[5-6]。因此，有必要探索克服上述問題的合適方法，擴大熊果酸的應用范圍，進一步發(fā)揮熊果酸的生物活性。

為了提高熊果酸的溶解度和生物利用度，目前已經(jīng)開發(fā)了多種類型的熊果酸遞送系統(tǒng)，如固體包合物，脂質(zhì)體，納米乳劑和水凝膠。與其他遞送系統(tǒng)相比，天然聚合物納米粒子由于具有無毒、尺寸小、靶向性強、有效的滲透能力及提高生物利用度等多重優(yōu)勢而成為研究熱點[7-8]。殼聚糖是線性且由天然陽離子幾丁質(zhì)部分脫乙酰而獲得的聚合物，具有生物相容性、無毒性和可生物降解性[9]?；跉ぞ厶堑募{米顆粒作為納米載體用于遞送活性成分，可以增強活性成分的穩(wěn)定性、促進其吸收和生物利用度的增加[10]。HERNANDEZ-PATLAN等[11]制備的姜黃素殼聚糖納米?？梢杂行岣呓S素的穩(wěn)定性和滲透性。WU等[12]制備的負載白藜蘆醇的殼聚糖納米顆?？梢燥@著提高白藜蘆醇的溶解度和穩(wěn)定性。THANDADANI等[13]研究表明殼聚糖納米顆粒具有很好的生物降解性、生物相容性、抗氧化活性且無毒。因此，殼聚糖納米顆粒是用于改善活性成分的穩(wěn)定性和溶解性的有效載體。與其他合成殼聚糖納米顆粒的方法相比，離子凝膠法具有反應條件簡單溫和、方便、無毒的優(yōu)點[14]。然而，目前國內(nèi)外關于采用離子凝膠法以三聚磷酸鈉為交聯(lián)劑制備負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的研究鮮有報道。

本研究以殼聚糖和三聚磷酸鈉為載體，采用離子凝膠法制備負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒，運用單因素試驗和正交試驗方法以熊果酸包埋率為指標篩選最佳制備條件，以期提高熊果酸的溶解度，擴大其在保健產(chǎn)品和化妝品行業(yè)中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熊果酸(純度98.0%)，上海源葉生物科技有限公司；殼聚糖(脫乙酰化≥90.0%)，上海藍季科技發(fā)展有限公司；三聚磷酸鈉(分析純)，天津市風船化學試劑科技有限公司；吐溫-80(分析純)，天津市德恩化學試劑有限公司；乙酸(分析純)，江蘇強盛功能化學股份有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2600紫外可見分光光度計，龍尼柯(上海)儀器有限公司；HJ-6A數(shù)顯磁力加熱攪拌器，常州普天儀器制造有限公司；TG16-WS臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；TM3030Plus掃描電子顯微鏡，日本日立高新技術公司；Nano ZS90馬爾文激光粒度儀，上海普迪生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 熊果酸殼聚糖納米顆粒的制備工藝

參考文獻[15-16]的方法制備負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒。在室溫下，將殼聚糖加入體積分數(shù)為1%的乙酸溶液中，磁力攪拌8 h，得到澄清溶液，將其用0.45 μm 微孔膜過濾，得到殼聚糖溶液。用質(zhì)量濃度0.1 g/mL的氫氧化鈉溶液將殼聚糖溶液的pH調(diào)節(jié)至5.0，然后加入質(zhì)量分數(shù)為1%的吐溫-80，并在室溫下磁力攪拌20 min。然后，按照熊果酸與殼聚糖的質(zhì)量比3∶1將溶解于乙醇的熊果酸溶液滴加至上述溶液中，并在磁力攪拌下30 min。按照殼聚糖與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比5∶1將質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的三聚磷酸鈉溶液緩慢滴加到混合溶液中，并磁力攪拌45 min以獲得熊果酸殼聚糖納米顆粒懸浮液。將納米顆粒懸浮液以12 000 r/min離心20 min，并用蒸餾水洗滌沉淀物以除去未結合的熊果酸，然后噴霧干燥，將獲得的負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒粉末存儲在干燥器中直至分析。

1.3.2 標準曲線繪制

配制成1 mg/mL的熊果酸儲備液，分別稱取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL儲備液，用乙醇定容至10 mL 容量瓶中，得到不同濃度的標準溶液。以乙醇作空白對照，在210 nm波長下測定溶液吸光度。得到標準曲線方程為：Y=8.097 1X-0.015 1,R2=0.999 3。其中Y為吸光度，X為熊果酸質(zhì)量濃度。

1.3.3 熊果酸殼聚糖納米顆粒包埋率的測定

參考文獻[17]的方法，取熊果酸殼聚糖納米粒懸液于10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，分離上清液，將沉淀物用蒸餾水洗滌3次。向沉淀物中加入乙醇，超聲處理15 min，然后用高速離心機以10 000 r/min離心15 min，適當稀釋，用紫外可見分光光度計測定離心后的上清液在210 nm波長處的吸光度，并通過熊果酸標準曲線計算熊果酸含量。包埋率根據(jù)公式(1)計算：

(1)

式中：M總為添加的熊果酸總量，mg；M為殼聚糖納米顆粒負載的熊果酸質(zhì)量，mg。

1.3.4 熊果酸殼聚糖納米顆粒的工藝優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗

(1)殼聚糖質(zhì)量濃度對熊果酸殼聚糖納米顆粒包埋率的影響

分別選取1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg/mL的殼聚糖質(zhì)量濃度，按照殼聚糖與熊果酸3∶1的質(zhì)量比添加熊果酸，按照殼聚糖與三聚磷酸鈉5∶1的質(zhì)量比，添加2.0 mg/mL的三聚磷酸鈉溶液，制備熊果酸殼聚糖納米顆粒，研究不同質(zhì)量濃度的殼聚糖對熊果酸殼聚糖納米顆粒包埋率的影響。

(2)殼聚糖與熊果酸質(zhì)量比對熊果酸殼聚糖納米顆粒包埋率的影響

采用3.0 mg/mL的殼聚糖質(zhì)量濃度，按照殼聚糖與熊果酸的質(zhì)量比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1添加熊果酸，按照殼聚糖與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比5∶1添加2.0 mg/mL的三聚磷酸鈉溶液，制備熊果酸殼聚糖納米顆粒，研究殼聚糖與熊果酸的不同質(zhì)量比對熊果酸殼聚糖納米顆粒包埋率的影響。

(3)殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比對熊果酸殼聚糖納米顆粒包埋率的影響

采用3.0 mg/mL的殼聚糖質(zhì)量濃度，按照殼聚糖與熊果酸質(zhì)量比為3∶1添加熊果酸，分別按照殼聚糖與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1，添加2.0 mg/mL的三聚磷酸鈉溶液，制備熊果酸殼聚糖納米顆粒，研究殼聚糖與三聚磷酸鈉的不同質(zhì)量比對熊果酸殼聚糖納米顆粒包埋率的影響。

1.3.4.2 正交試驗

在上述單因素試驗基礎上，選擇殼聚糖溶液質(zhì)量濃度、殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比和殼聚糖與熊果酸質(zhì)量比3個因素為試驗因素進行L9(34)正交試驗設計，考察因素與水平如表1所示，以熊果酸包埋率為指標確定最佳制備條件。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels in the orthogonal design

1.3.5 熊果酸殼聚糖納米顆粒表征及溶出度測定

1.3.5.1 掃描電子顯微鏡分析

將通過噴霧干燥得到的熊果酸殼聚糖納米顆粒粉末粘在導電膠上，用掃描電子顯微鏡觀察負載熊果酸殼聚糖納米顆粒的微觀結構和表面形態(tài)[18]。

1.3.5.2 粒徑測定

通過馬爾文激光粒度儀測量負載熊果酸殼聚糖納米顆粒的粒徑。稱取適量的殼聚糖納米顆粒粉末，用超純水適當稀釋后放于樣品池，于室溫下測定[19]。

1.3.5.3 體外溶出度測定

將負載熊果酸殼聚糖納米顆粒添加到裝有模擬胃液(pH=2.0, 0.01 mol/L HCI和0.09 mol/L NaCl)和模擬腸液(pH=6.9, 0.07 mol/L KH2PO4和0.2 mol/L NaOH)的燒杯中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中以120 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌，在適當?shù)臅r間間隔對懸浮液進行采樣，并用等體積的新鮮溶出介質(zhì)代替，取出的樣品用紫外可見分光光度計分析[20-21]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

每組試驗平行進行3次，使用Origin 2017軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，使用DPS 7.05軟件進行方差分析，為了確定組樣本之間的顯著差異，置信區(qū)間選擇為95%(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 殼聚糖質(zhì)量濃度對包埋率的影響

由圖1可知，隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的增大，負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的包埋率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當殼聚糖溶液質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，帶正電荷的殼聚糖氨基基團通過離子凝膠法與帶負電荷的三聚磷酸鈉的磷酸基團相互作用最強，因此負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的包埋率較高。殼聚糖分子在酸性溶液中會電離出帶正電荷的氨基基團，隨著殼聚糖溶液濃度質(zhì)量增加，殼聚糖分子表面會帶更多的正電荷，熊果酸分子被包埋的機會增大。但殼聚糖溶液濃度過高，溶液體系黏度增大，會阻礙熊果酸分子在殼聚糖分子周圍運動，導致高殼聚糖質(zhì)量濃度時熊果酸的包埋率下降。

圖1 殼聚糖濃度對熊果酸包埋率的影響Fig.1 Effect of chitosan solution concentration on encapsulation efficiency of ursolic acid

2.1.2 殼聚糖與熊果酸的質(zhì)量比對包埋率的影響

芯材與壁材的質(zhì)量比例對殼聚糖納米顆粒的包埋率有直接影響[22]。芯壁比對負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒包埋率的影響見圖2。如圖2所示，包埋率隨著殼聚糖與熊果酸質(zhì)量比的增大而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在殼聚糖與熊果酸質(zhì)量比為3∶1時包埋率達到最佳。這是由于隨著芯壁比的增大，包裹在熊果酸周圍的壁材的量逐漸減少，導致殼聚糖納米顆粒的機械性能降低，囊壁的厚度逐漸變薄，熊果酸泄露，因此包埋率降低[23]。

圖2 殼聚糖與熊果酸的質(zhì)量比對熊果酸包埋率的影響Fig.2 Effect of mass ratio of chitosan to ursolic acid on encapsulation efficiency of ursolic acid

2.1.3 殼聚糖與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比對包埋率的影響

如圖3所示，隨著殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比的增加，負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的包埋率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比為5∶1時，溶液中殼聚糖分子帶的正電荷氨基基團與三聚磷酸鈉帶的負電荷磷酸基團之間充分交聯(lián)反應，負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒包埋率較高。殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比過高，即溶液中三聚磷酸鈉加入量過低，三聚磷酸鈉分子帶的負電荷磷酸基團不足以與殼聚糖帶的正電荷氨基基團交聯(lián)形成納米顆粒，因此當殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比高于5∶1，熊果酸的包埋率呈現(xiàn)下降的趨勢。

圖3 殼聚糖與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比對熊果酸包埋率的影響Fig.3 Effect of mass ratio of chitosan to sodium tripolyphosphate on encapsulation efficiency of ursolic acid

2.2 正交試驗結果分析

為篩選出制備負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的最佳條件，在單因素試驗結果的基礎上進行正交試驗，正交試驗結果及方差分析分別如表2和表3所示。根據(jù)極差分析可知,各因素對殼聚糖納米顆粒包埋率的影響順序為：殼聚糖與熊果酸質(zhì)量比>殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比>殼聚糖溶液質(zhì)量濃度，比較各因子的k值可知，獲得最大負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒包埋率的最優(yōu)組合為：A2B3C1。根據(jù)方差分析可知，殼聚糖與熊果酸質(zhì)量比對包埋率影響極顯著(P<0.01)，殼聚糖質(zhì)量濃度和殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比對包埋率影響顯著(P<0.05)。制備負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的最佳條件為殼聚糖與熊果酸質(zhì)量比為4∶1，殼聚糖溶液質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比為4∶1，此條件下熊果酸的包埋率為79.52%。

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal experimental

表3 試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of experimental

2.3 結構表征

為進一步表征熊果酸在殼聚糖納米顆粒最佳制備條件下的包埋形貌，通過掃描電鏡觀察該納米顆粒的外觀(圖4)。干燥后的負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒是球形，具有相對光滑的表面。顆粒分布相對均勻，表明離子凝膠法能有效地制備負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒。

圖4 負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron micrograph of ursolic acid loaded chitosan nanoparticles

負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的粒徑分布如圖5所示。由圖5可知，負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的粒徑在180 nm左右，與文獻報道的采用自組裝方法制備的粒徑在200～300 nm的靶向羧甲基殼聚糖-熊果酸納米藥物相近[24]。殼聚糖納米顆粒粒徑越小，包埋率越高且具有緩釋作用[5]。負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的多分散指數(shù)為0.476±0.03，其粒徑呈正態(tài)分布且分布較窄，說明殼聚糖納米顆粒分布相對均勻和集中。

圖5 負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒的粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of ursolic acid loaded chitosan nanoparticles

2.4 體外溶出度分析

熊果酸和負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒在模擬胃腸液中的溶出度如圖6所示。由圖6可知，熊果酸在模擬胃液和模擬腸液中的溶出度均低于10%，而負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒在模擬胃腸液中的溶出度分別為55.8%和16.9%，分別是熊果酸原藥的4.7倍和1.1倍。表明負載熊果酸殼聚糖納米顆粒的溶解速率顯著高于未包埋的熊果酸，殼聚糖納米顆粒包埋熊果酸可以顯著提高熊果酸的溶解度。

圖6 負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒在模擬 胃腸液中的溶出度Fig.6 Dissolution of ursolic acid loaded chitosan nanoparticles in simulated gastrointestinal fluid

3 結論

本文通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了離子凝膠法制備殼聚糖納米顆粒的工藝，得到最佳制備工藝參數(shù)為：殼聚糖溶液質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，殼聚糖與熊果酸質(zhì)量比為4∶1，殼聚糖與三聚磷酸鈉質(zhì)量比為4∶1，此時的熊果酸包埋率為79.52%。在最佳制備條件下，負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒呈表面光滑的球形，粒徑在180 nm左右，且分布較窄。負載熊果酸的殼聚糖納米顆粒在模擬胃腸液中的溶出度顯著提高。因此，利用正交試驗優(yōu)化的負載熊果酸殼聚糖納米顆粒的制備工藝可以有效提升熊果酸的溶出度。