呂彥瑋 王麗娟 黃仁前 林曦 韓超 胡良皞 李兆申

海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200433

進(jìn)展性胰腺纖維化為CP最主要的病理學(xué)特征。研究表明，胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cells, PSCs)活化是胰腺組織纖維化初始階段的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞[1]。胰腺急性損傷和炎癥發(fā)生后，靜息狀態(tài)的PSCs可被組織微環(huán)境中各種損傷相關(guān)刺激因子和促炎因子(如TGF-β、PDGF、TNF-α、IL-1β、IL-6等)激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞[2]，并分泌纖連蛋白(fibronectin, FN)及Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)成分，參與組織修復(fù)；若PSCs活化過度則可造成細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積，最終導(dǎo)致胰腺組織纖維化[3-4]。柚皮素為黃酮類化合物，在自然界中分布廣泛，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能[5]。對(duì)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1的體外研究表明，柚皮素可通過抑制NF-κB信號(hào)通路活性從而抑制多種促炎因子的產(chǎn)生[6]；在膽固醇誘導(dǎo)的大鼠肝炎模型中，使用柚皮素可顯著減輕大鼠肝臟炎癥反應(yīng)[7]。另有多項(xiàng)研究表明柚皮素在緩解多種組織器官的纖維化中也發(fā)揮重要作用。在四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中，柚皮素可通過抑制TGF-β/Smad3、JNK/Smad3等信號(hào)通路抑制肝星狀細(xì)胞活化，從而改善肝纖維化[8]；柚皮素與積雪草酸聯(lián)合應(yīng)用可通過抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路顯著改善腎纖維化[9]；此外，柚皮素對(duì)肺纖維化和肺癌轉(zhuǎn)移亦具有明顯抑制作用[10]。然而，目前尚無關(guān)于柚皮素在胰腺纖維化中作用的相關(guān)研究報(bào)道。本研究應(yīng)用CP小鼠和PSCs進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，旨在從體內(nèi)和體外兩個(gè)方面綜合探討柚皮素在胰腺纖維化中可能發(fā)揮的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

18只SPF級(jí)6周齡雄性C57BL/6小鼠購(gòu)于上海靈暢生物科技有限公司，將其按數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、CP組和柚皮素干預(yù)組(柚皮素組)，每組6只。采用腹腔注射雨蛙素的方法構(gòu)建CP模型，劑量為50 μg/kg，每天6次(兩次給藥間隔1 h)，每周一、三、五給藥，共6周；柚皮素組于造模后第4周的第1天開始予柚皮素灌胃。柚皮素用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶解，劑量為200 mg/kg，每天1次，直至處死小鼠的前一天；對(duì)照組和CP組予等容積CMC-Na灌胃。造模期間行最后一次雨蛙素注射5 d后使用水合氯醛注射麻醉小鼠，頸椎脫臼法處死，常規(guī)剖腹取胰腺組織，置于4%多聚甲醛中固定。

二、胰腺組織病理學(xué)檢查及膠原纖維沉積度檢測(cè)

取各組小鼠多聚甲醛固定的胰腺組織，石蠟包埋、切片，分別行蘇木精-伊紅染色及針對(duì)膠原纖維的天狼星紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺組織的病理學(xué)變化，并參照改良Schmidt評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[11]進(jìn)行胰腺組織病理評(píng)分：(1)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為0分，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)<5%、5%～<10%、10%～<50%、≥50%分別計(jì)1、2、3、4分)；(2)腺泡萎縮程度(無腺泡萎縮為0分，少量、中等量、大量或嚴(yán)重腺泡萎縮分別計(jì)1、2、3分)；(3)膠原纖維化程度(無纖維化為0分，局限性纖維化為2分，彌漫性纖維化為4分)。三項(xiàng)之和即為總分。膠原纖維沉積程度以膠原纖維陽性區(qū)域占單個(gè)視野全部區(qū)域的百分比來表示。所有數(shù)據(jù)均由隨機(jī)選擇各小鼠5張胰腺切片，每張胰腺切片隨機(jī)選擇6個(gè)視野進(jìn)行觀察、計(jì)算得到。

三、PSCs培養(yǎng)及存活率檢測(cè)

人源性PSCs由美國(guó)德克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心Craig D Logsdon教授贈(zèng)予，使用含10%胎牛血清、1%雙抗和1∶20 000 De-plasma的高糖型DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

利用高敏CCK-8法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物公司)檢測(cè)細(xì)胞活性。于96孔板中加入PSCs(1×104個(gè)細(xì)胞/孔，100 μl培養(yǎng)液)，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加不同濃度(0、5、10、20、50、100、150、200 μmol/L)柚皮素進(jìn)行干預(yù)，以單加DMSO的PSCs作為對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再加入CCK-8試劑，10 μl/孔，分別避光繼續(xù)孵育1、2、3、4 h，上酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度值(A450值)，計(jì)算不同濃度柚皮素干預(yù)的細(xì)胞存活率。

四、PSCs活化、增殖與凋亡蛋白表達(dá)的檢測(cè)

使用直徑10 cm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)PSCs，每個(gè)培養(yǎng)皿10 ml培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到50%～70%時(shí)，用外源重組蛋白TGF-β1(2 ng/ml)單純刺激PSCs(TGF-β1刺激組)，以及TGF-β1(2 ng/ml)刺激1 h后分別加低(50 μmol/L)、中(100 μmol/L)、高濃度(150 μmol/L)柚皮素干預(yù)PSCs，以單加DMSO的PSCs作為對(duì)照組。干預(yù)培養(yǎng)36 h后，離心收集細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液，低溫下20 min內(nèi)振蕩3～4次，充分裂解細(xì)胞，13 200 r/min離心15 min(離心半徑10 cm)，取上清。采用BCA定量試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)測(cè)定總蛋白濃度。常規(guī)行蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)PSCs活化標(biāo)志蛋白FN和Ⅰ型膠原蛋白α1鏈(collagen type Ⅰ alpla 1, COL1A1)、細(xì)胞增殖標(biāo)志物p21以及抗凋亡蛋白Bcl-xL和促凋亡蛋白Bax、Bid的表達(dá)，以GAPDH或β-actin作為內(nèi)參?？功?actin、GAPDH抗體購(gòu)自武漢Engibody Biotechnology公司；Anti-FN抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；抗COL1A1、p21、Bcl-xL、Bax、Bid抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signal Technology公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自上海雅酶生物公司。最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。應(yīng)用Image J軟件分析掃描圖像，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組小鼠胰腺病理學(xué)改變和膠原纖維沉積程度比較

對(duì)照組小鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)完整，腺泡排列緊致，未見腺泡萎縮、腺泡導(dǎo)管組織轉(zhuǎn)化；CP組小鼠胰腺組織出現(xiàn)明顯腺泡萎縮、腺泡導(dǎo)管組織轉(zhuǎn)化和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等CP特征性病理學(xué)改變；柚皮素組小鼠胰腺組織病理改變較CP組明顯改善，腺泡形態(tài)恢復(fù)至較完整狀態(tài)，腺泡排列更為緊致(圖1)。對(duì)照組、CP組、柚皮素組小鼠胰腺組織病理評(píng)分分別為0、(7.33±1.15)、(4.67±1.15)分，CP組顯著高于對(duì)照組，柚皮素組顯著低于CP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，提示CP模型誘導(dǎo)成功，而柚皮素可顯著緩解CP小鼠的胰腺組織病理損傷。

圖1 對(duì)照組(1A)、慢性胰腺炎組(1B)和柚皮素組(1C)小鼠胰腺組織病理改變(蘇木精-伊紅染色 ×100)

對(duì)照組小鼠胰腺組織未見膠原纖維沉積；CP組小鼠胰腺組織出現(xiàn)廣泛的膠原纖維沉積；而柚皮素組小鼠胰腺組織膠原纖維沉積顯著減少(圖2)。對(duì)照組、CP組、柚皮素組小鼠胰腺組織膠原纖維陽性區(qū)域占比分別為(4±2)%、(46±4)%、(28±2)%，CP組顯著高于對(duì)照組，柚皮素組顯著低于CP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，提示柚皮素可明顯改善CP小鼠胰腺組織的纖維化程度。

圖2 對(duì)照組(2A)、慢性胰腺炎組(2B)和柚皮素組(2C)小鼠胰腺組織膠原纖維沉積(天狼星紅染色 ×100 )

二、不同濃度柚皮素干預(yù)后PSCs細(xì)胞存活率的變化

與對(duì)照組比較，5、10、20、50、100、150、200 μmol/L柚皮素干預(yù)PSCs 24 h后，僅200 μmol/L柚皮素干預(yù)組PSCs存活率降為83.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值<0.05)，而其他濃度柚皮素干預(yù)不影響PSCs存活率，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇150 μmol/L作為柚皮素干預(yù)PSCs的最大藥物濃度。

三、各組PSCs活化相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

對(duì)照組，TGF-β1刺激組，TGF-β1刺激后低、中、高濃度柚皮素干預(yù)組PSCs的FN蛋白表達(dá)量分別為0.02、0.76、0.67、0.34、0.07，COL1A1蛋白表達(dá)量分別為0.51、1.71、1.34、0.84、0.11，TGF-β1刺激組顯著高于對(duì)照組，TGF-β1刺激后低、中、高濃度柚皮素干預(yù)組則呈濃度依賴性顯著低于TGF-β1刺激組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，圖3)，提示TGF-β1刺激可促進(jìn)FN及COL1A1蛋白表達(dá)，即促進(jìn)PSCs的活化，而柚皮素干預(yù)可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的FN及COL1A1蛋白表達(dá)，即抑制PSCs的活化。

注：TGF-β1為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；PSCs為胰腺星狀細(xì)胞圖3 對(duì)照組(1)，TGF-β1刺激組(2)，TGF-β1刺激后低(3)、中(4)、高(5)濃度柚皮素干預(yù)組PSCs活化相關(guān)蛋白的表達(dá)

四、各組PSCs增殖標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平比較

對(duì)照組，TGF-β1刺激組，TGF-β1刺激后低、中、高濃度柚皮素干預(yù)組PSCs的p21蛋白表達(dá)量分別為0.87、1.18、1.27、1.22、1.00，TGF-β1刺激組顯著高于對(duì)照組，TGF-β1刺激后高濃度柚皮素干預(yù)組顯著低于TGF-β1刺激組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，圖4)，而TGF-β1刺激后低、中濃度柚皮素干預(yù)組與TGF-β1刺激組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示TGF-β1刺激可促進(jìn)PSCs增殖，而高濃度柚皮素可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PSCs增殖。

注：TGF-β1為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；PSCs為胰腺星狀細(xì)胞圖4 對(duì)照組(1)、TGF-β1刺激組(2)、TGF-β1刺激后低(3)、中(4)、高(5)濃度柚皮素干預(yù)組PSCs增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

五、各組PSCs凋亡標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平比較

對(duì)照組，TGF-β1刺激組，TGF-β1刺激后低、中、高濃度柚皮素干預(yù)組Bcl-xL蛋白表達(dá)量分別為2.09、2.21、2.38、2.50、2.12，Bax蛋白表達(dá)量分別為0.98、0.88、0.98、1.00、0.88，Bid蛋白表達(dá)量分別為1.15、1.09、1.14、1.18、1.18，各組之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05，圖5)，提示TGF-β1刺激和柚皮素干預(yù)對(duì)PSCs凋亡均無明顯影響。

注：TGF-β1為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；PSCs為胰腺星狀細(xì)胞圖5 對(duì)照組(1)、TGF-β1刺激組(2)、TGF-β1刺激后低(3)、中(4)、高(5)濃度柚皮素干預(yù)組PSCs凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

討 論

在各種因素導(dǎo)致的胰腺急性損傷和炎癥狀態(tài)下，PSCs由于各種因子的刺激而活化，可分泌大量促細(xì)胞增殖和促纖維化因子，改變胰腺微環(huán)境，并分泌多種膠原纖維類蛋白和金屬蛋白酶及其抑制劑等參與細(xì)胞外基質(zhì)降解與重構(gòu)，最終促進(jìn)胰腺纖維化進(jìn)程[12]。由此可見，PSCs的活化是胰腺纖維化的核心環(huán)節(jié)，因此抑制PSCs的活化是緩解胰腺纖維化的重要途徑。

TGF-β1作為組織纖維化的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子，可通過激活其下游Smad轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)PSCs活化、增殖，活化的PSCs分泌大量FN和Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原等重要細(xì)胞外基質(zhì)成分，參與多種組織器官纖維化進(jìn)程[13-15]，故本研究中使用TGF-β1刺激PSCs活化，模擬其在胰腺纖維化中的活性改變，隨后使用不同濃度的柚皮素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示，柚皮素可顯著改善CP小鼠胰腺組織的炎癥、萎縮和纖維化程度，緩解雨蛙素所致胰腺損傷；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重要成分FN和COL1A1及細(xì)胞增殖標(biāo)志物p21的蛋白表達(dá)，即可促進(jìn)PSCs的活化和增殖，而柚皮素可顯著抑制上述蛋白的表達(dá)，表明柚皮素對(duì)PSCs的活化和增殖具有抑制作用。此外，TGF-β1刺激和柚皮素處理均對(duì)PSCs的凋亡無明顯影響。

柚皮素是一種具有抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)脂肪代謝等多種生物學(xué)功能的黃酮類化合物[16]。已有體內(nèi)外研究表明，柚皮素可通過FKBP4/NR3C1/NRF2信號(hào)通路抑制人乳腺癌細(xì)胞的自噬和增殖過程[17]。本研究中柚皮素對(duì)PSCs的活化和增殖過程發(fā)揮抑制作用與上述研究結(jié)果一致。結(jié)合前文所述PSCs在炎癥反應(yīng)、組織創(chuàng)傷修復(fù)以及纖維化相關(guān)生理、病理過程中的重要調(diào)控作用，筆者推測(cè)柚皮素可通過抑制PSCs活化和增殖，減少FN和I型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)重要成分的表達(dá)，從而緩解胰腺組織纖維化，對(duì)CP的胰腺纖維化可能具有潛在的治療價(jià)值。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明呂彥瑋：實(shí)驗(yàn)操作、論文撰寫；黃仁前、林曦、韓超：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；王麗娟、胡良皞、李兆申：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持