薛永常，麻新妍

（大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧，大連 116034）

黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）是唇形科多年生藥用植物，其藥用組分為黃酮。查爾酮異構酶（Chalcone isomerase，CHI）是黃酮類化合物合成途徑的關鍵調(diào)控酶［1］，可催化查爾酮為柚皮素，控制著其下游黃酮及異黃酮等次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量［2］，對查爾酮異構酶的研究具有重要意義。研究表明chi超量表達可以提高甘草發(fā)根黃酮化合物的含量［3］及紅掌花青素的合成［4］；chi下降調(diào)節(jié)可降低冬棗花色苷和槲皮素含量，延緩冬棗變紅［5］。而CHI 既可提高啤酒花中黃腐醇和脫甲基黃腐醇活性，從而影響啤酒風味和品質(zhì)［6］，又能增加銀杏雙黃酮的生成，抑制乳腺癌細胞體外增殖，已成為乳腺癌治療的一種新手段［7］；同時CHI 還能促進?；S酮醇苷前體楊梅素生物合成，使?；S酮醇苷大增［8-9］，成為治療II型糖尿病的潛在新藥。在傳統(tǒng)中藥中黃芩多以根部入藥，無序采集嚴重破壞了野生黃芩的生境，因此保護黃芩自然資源，探究黃芩整株植物不同器官在中草藥的利用十分必要。Park 等［10］及郭雙雙等［11］分別從黃芩毛狀根及愈傷組織中克隆chi，證明超表達chi可提高黃芩毛狀根黃酮化合物的含量。本研究擬從黃芩葉mRNA中反轉(zhuǎn)錄獲得chi全長cDNA，對其進行生物信息學分析，為野生黃芩資源的可持續(xù)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）采自河北省承德市霧靈山國家自然保護區(qū)。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α及BL21（DE3），由本實驗室保存。

1.2 主要試劑及儀器

TransZol UP 試劑盒（北京全式金生物有限公司）、PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2、pMDTM19-T Vector cloning kit、QuickCutTMEcoRI、Quick-CutTMHindIII、Taq DNA polymerase（5 U/μL）、DNA Marker（寶生物工程（大連）有限公司）、Fast Pure 質(zhì)粒提取試劑盒（南京諾維贊生物科技有限公司）；

Thermal Cycle Dice TP610（日本TaKaRa 公司）、Himac CR-21G高速冷凍離心機（日本日立公司）。

1.3 方法

1.3.1 引物的設計

參考NCBI 數(shù)據(jù)庫中登錄號為HQ153041.1、KT963462.1、KP064512.1 的黃芩查爾酮異構酶基因mRNA 序列，通過比對，利用Primer Premier 5.0 設計用于擴增chi全長cDNA的特異性引物：

M-CHI-S：ATGTCTGCTTCGCCATCCG

M-CHI-A：TTAAAACAACTCCGATAGTCTT GCC

1.3.2 黃芩chi基因克隆、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及鑒定

選取盛花期黃芩葉片，TransZol UP 法提取其總RNA，使用PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2，以M-CHI-S 和M-CHI-A 為特異引物擴增chicDNA。目的擴增產(chǎn)物與pMDTM19-T 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞。重組質(zhì)粒經(jīng)鑒定后進行測序，NCBI在線分析目的基因序列。

1.3.3chi基因的原核表達

EcoRI 及HindIII 對pET-32a（+）及pMDTM19-Tchi雙酶切，回收目的DNA 片段并連接，構建其表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞。

加入適當濃度的IPTG 于pET-32a（+）-chi培養(yǎng)液，以誘導目的蛋白表達。培養(yǎng)液在4℃，13 000 g離心10 min，2 × SDS 上樣緩沖液懸浮沉淀；煮沸5 min 后置冰上3 min；13 000 g 離心1 min，取10 μL上清液進行SDS-PAGE［12］。

2 結果與分析

2.1 目的基因chi的反轉(zhuǎn)錄擴增

以黃芩葉總RNA 為模板進行chi的RT-PCR。電泳圖譜顯示在500～750 bp 呈現(xiàn)一條清晰擴增條帶，與預期的chi基本一致（如圖1）。

圖1 chi基因擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of chi gene fragment

2.2 目的基因的鑒定

2.2.1 重組質(zhì)粒的提取及鑒定

挑選白色陽性單克隆菌落提取質(zhì)粒DNA，電泳圖譜呈現(xiàn)一條約3 kb 的清晰的條帶，與目的質(zhì)粒大小基本一致（圖2）。

圖2 重組質(zhì)粒DNA電泳圖Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmid DNA

對質(zhì)粒DNA 進行特異引物PCR，能夠從重組質(zhì)粒中擴增出一條約700 bp 清晰條帶（圖3），與chi大小基本一致，質(zhì)粒構建正確。

圖3 質(zhì)粒DNA中擴增chi基因電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of chi gene from recombinant plasmid DNA

對重組質(zhì)粒雙酶切結果顯示，在約2 800 bp 和700 bp 各出現(xiàn)一條清晰的條帶，與pMDTM19-T 載體及擴增片段一致（圖4），說明重組質(zhì)粒構建正確。

圖4 重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖Fig.4 Recombinant plasmid cut by two endonucleases

2.2 目的基因序列的生物信息學分析

測序結果表明擴增的目的基因片段全長648 bp，為一個起始密碼子為ATG、終止密碼子為TAA的完整ORF。同源性分析表明，其與S. baicalensischalcone isomerase（ID：HQ153041.1）相 似 度 達 到100%，擬編碼215 個氨基酸，理論分子量為36.854 KDa。EXPASY protparam 預測其等電點為5.09，擬翻譯蛋白的分子式為C1040H1632N258O321S4，屬于穩(wěn)定性親水性蛋白。BLAST 比對表明，該蛋白中含有查爾酮酶核心區(qū)域及查爾酮異構酶催化特有結構域PLN02559 模塊，屬于查爾酮_3 超家族（圖5），其主要作用是將查爾酮異構化為柚皮素，從而進行花青素等黃酮類化合物的產(chǎn)生。因此，該目的基因序列為chi全長序列，并將該重組質(zhì)粒命名為pMDTM19-T-chi。

圖5 chi基因的結構域分析Fig. 5 The Analysis of chi gene domain

與來源不同科、屬的茶花、紫蘇、丹參、青棗、藿香、大花美人蕉chi的系統(tǒng)發(fā)育樹分析（圖6）表明，該序列與同為唇形科黃芩、鼠尾草屬丹參、紫蘇屬紫蘇親緣關系最近，同源性分別為100%、99%、95%；但與荊芥屬藿香親緣關系較遠，再次是鼠李科棗屬青棗、山茶科茶花及美人蕉科的大花美人蕉。說明chi在同科屬中是相對保守的，在不同科植物有一定的差異，這與CHI 在黃酮化合物生物合成途徑的地位及作用是相一致的。

圖6 chi系統(tǒng)發(fā)育樹構建Fig. 6 The phylogenetic tree of chi gene

同時對數(shù)據(jù)庫中來源黃芩不同組織/器官——毛狀根（HQ153041.1）、愈傷組織（KP064512.1）及本文葉片擴增的chi序列比對（圖7），發(fā)現(xiàn)chi在黃芩毛狀根、愈傷組織及葉片中各只有一個核苷酸的差異，序列高度保守，同源性接近100%，說明CHI在黃芩的不同部位及不同器官可能執(zhí)行同樣的功能，在進化中高度保守。

圖7 不同黃芩器官chi序列比對圖Fig.7 Multiple alignment of chi from different scutellariae organs

而從其擬表達蛋白的三級結構顯示，其α螺旋、無規(guī)則卷曲及延伸鏈占比分別為42.33%、26.89%及21.40%，說明該目的蛋白性質(zhì)穩(wěn)定（圖8），與同源性分析結果一致。

圖8 擬表達的CHI蛋白三級結構預測Fig.8 The tertiary structure prediction of pupative CHI

2.3 chi基因的原核表達與SDS-PAGE分析

培養(yǎng)含有pET-32a（+）及pET-32a（+）-chi的單克隆菌落至OD600為0.6。加入終濃度為0.5 mmol/L和1 mmol/L的IPTG以誘導目的蛋白的表達。

SDS-PAGE 圖譜（圖9）顯示，pET-32a（+）在整個誘導過程中均無特異蛋白表達。pET-32a（+）-chi菌株在0.5 mmol/L 和1 mmol/L IPTG 誘導10 h 后，均能表達出一30 kDa 的融合蛋白，與同源性分析的大小基本一致。同時從圖譜中看出，0.5 mmol/L 和1 mmol/L IPTG 誘導下pET-32a（+）-chi的蛋白表達差異不大，說明0.5 mmol/L IPTG 已足夠蛋白表達的誘導。隨著誘導時間的延長，其表達量在誘導16 h 時達到峰值。說明chi基因在大腸桿菌BL21（DE3）得以高效表達。

圖9 chi基因表達蛋白SDS-PAGE分析Fig.9 SDS-PAGE analysis of chi expressed product

3 結果與討論

本研究從黃芩葉mRNA 中反轉(zhuǎn)錄克隆出一個648 bp的全長chi基因序列，生物信息學分析表明其具有查爾酮異構酶催化特有結構域PLN02559，屬于查爾酮_3 超家族成員。構建的表達載體pET-32a（+）-chi在IPTG 誘導下在大腸桿菌中異源表達出一分子量約為30.0 kDa 的目的融合蛋白，為進一步研究CHI的生物學功能奠定了基礎。

在對苜蓿CHI 的研究發(fā)現(xiàn)，在結合不同底物時主要是保守的Thr48 和Tyr106 與2 個水分子及在Asn113 和Thr90 與黃酮的7-羥基之間的兩組氫鍵起催化作用［13-14］，且在相近物種中是高度保守的，并且與濕泥霉菌、真菌及變形桿菌等CHI 的保守序列區(qū)（CDD：174782）也存在較大相似度［15-17］，暗示著CHI作為黃酮類物質(zhì)生物合成途徑的一個關鍵調(diào)控點，從細菌到高等植物中普遍存在，它們可能具有非常古老的起源，且進化保守，預示著可能執(zhí)行著相似的功能［9，18］。而本研究的chi進化顯示chi在黃芩不同器官高度保守，與其它相近科屬的物種之間也有廣泛的同源性，在不同科屬植物中的代謝進化中執(zhí)行了相同/相似的功能，這與郭雙雙等［11］的結果是一致的。而從黃芩毛狀根、愈傷組織及葉片chi幾乎完全相同，預示著傳統(tǒng)中草藥實踐中可以通過組織培養(yǎng)毛狀根、愈傷組織或葉替代野生黃芩根用藥，對于保護野生黃芩資源具有重要的意義。本研究對黃芩chi的研究為進一步研究CHI 的生物學功能，提高黃芩不同器官中黃酮類化合物含量，為野生黃芩資源的可持續(xù)綜合利用提供理論依據(jù)。