大花獨(dú)蒜蘭提取物對(duì)植物病原真菌的抑菌活性

黃達(dá)龍

(福建省南安市林業(yè)科技推廣站， 福建南安 362300)

大花獨(dú)蒜蘭(Pleione grandiflora)是蘭科(Orchidaceae)獨(dú)蒜蘭屬(Pleione)多年生草本植物，自然分布中心為中國(guó)云南(Chenet al，2009)。 獨(dú)蒜蘭屬兼具觀賞和藥用價(jià)值，中國(guó)藥典記錄獨(dú)蒜蘭(P. bulbocodioides)和云南獨(dú)蒜蘭(P. yunnanensis)干燥的假鱗莖入藥具有清熱解毒，化痰散結(jié)的功效(國(guó)家藥典委員會(huì)，2015)。 原產(chǎn)于中國(guó)西南部的獨(dú)蒜蘭屬植物，早在20 世紀(jì)初就被引種到西方植物園(Cribbet al，1999)。 在歐洲、日本等地及中國(guó)臺(tái)灣均有廣泛栽培應(yīng)用，是具有經(jīng)濟(jì)與生態(tài)價(jià)值的重要植物資源(沈立明等，2021；吳沙沙等，2020)。 目前，關(guān)于獨(dú)蒜蘭屬的研究報(bào)道主要集中在觀賞和藥用領(lǐng)域，其抗病原菌活性鮮有報(bào)道。

炭疽病是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的常見病害，由炭疽病菌感染寄主植物的靶細(xì)胞引起的(沈量等，2020；Chudasamaet al，2021)。 染病作物葉片及果實(shí)上形成圓形病斑，嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)(Sharmaet al，2017)。 目前對(duì)作物炭疽病的防治仍以化學(xué)手段為主(賢小勇等，2021)，但傳統(tǒng)的化學(xué)防治手段易造成環(huán)境污染、病原菌產(chǎn)生耐藥性等問(wèn)題。 因此，環(huán)境友好型的植物源殺菌劑成為近年來(lái)新型農(nóng)藥研發(fā)的熱點(diǎn)(于忻瀅等，2021；Huanget al，2010)。

本研究擬采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定大花獨(dú)蒜蘭假鱗莖提取物對(duì)11 種常見植物病原真菌的抑制活性，旨在篩選出高效的抑制菌種，為新型植物源殺菌劑的研究提供依據(jù)，為其種質(zhì)資源的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大花獨(dú)蒜蘭假鱗莖采集于云南省怒江傈僳族自治州，保存于福建農(nóng)林大學(xué)蘭科植物保護(hù)與利用國(guó)家林業(yè)與草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

11 種植物病原真菌菌種由福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供(表1)。

表1 供試植物病原真菌Table 1 Plant pathogens investigated in this study

用去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水定容至1 000 mL，配制PDA 培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大花獨(dú)蒜蘭假鱗莖提取 取大花獨(dú)蒜蘭假鱗莖切碎，于50 ℃烘干，將干燥后的樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎至粉末狀，共得樣品7 kg。 將粉末過(guò)40 mm 篩，用75%甲醇于80 ℃水浴鍋中進(jìn)行冷凝回流，料液比按照第一次1 ∶8、第二次1 ∶6 各回流2 次，每次2 h，過(guò)濾且合并2 次濾液，減壓濃縮得浸膏共2.45 kg，得率35%。

將浸膏溶于24 L 純水，選用大孔吸附樹脂D101(預(yù)先用92%乙醇活化處理)洗脫，洗脫溶劑和洗脫體積分別為蒸餾水11 BV(BV 為柱體積，1 BV＝9 L)、30%乙醇3 BV、60%乙醇3 BV、90%乙醇1 BV，收集各自的流份，減壓濃縮得各組分浸膏。 本試驗(yàn)取活性試驗(yàn)成分相對(duì)富集的中等極性組分，60%乙醇部位浸膏。 用2 mL 色譜甲醇溶解200 mg 的浸膏，配制成濃度為100 mg·mL-1的 2 mL 供試樣品。

1.2.2 大花獨(dú)蒜蘭提取物對(duì)11 種植物病原真菌的抑菌活性分析 采用菌絲生長(zhǎng)速率法(劉星星等， 2019)，挑取培養(yǎng)5 d 菌落邊緣的菌絲塊(直徑 5 mm)，轉(zhuǎn)接至含濃度為2 mg·mL-1大花獨(dú)蒜蘭假鱗莖提取物的PDA 培養(yǎng)基中央。 并以空白PDA 培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。 于(28±5) ℃條件下培養(yǎng)，每24 h 觀察一次。 采用十字交叉法，分別測(cè)量并記錄各組菌落生長(zhǎng)直徑，不規(guī)則菌落取其最大值。 計(jì)算方式如下。

1.2.3 大花獨(dú)蒜蘭提取物對(duì)植物病原真菌的毒力測(cè)定 經(jīng)初篩，得到抑制效果明顯的供試菌。 進(jìn)一步探究供試樣品對(duì)這些供試菌的致死中濃度EC50。 根據(jù)所得數(shù)據(jù)，以提取物濃度為橫坐標(biāo)，通過(guò)生物統(tǒng)計(jì)機(jī)率值換算，以抑制率對(duì)應(yīng)的幾率值作為縱坐標(biāo)，利用origin 軟件得出回歸方程和相關(guān)系數(shù)r，抑制率為50%時(shí)，計(jì)算EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性研究

結(jié)果表明，在大花獨(dú)蒜蘭假鱗莖提取物濃度為2 mg·mL-1的條件下，對(duì)11 種植物病原菌均有不同程度的抑制作用，尤其對(duì)白菜炭疽病菌、芭樂(lè)炭疽病菌、鏈孢粘帚霉病菌的抑制作用 強(qiáng)， 抑 制 率 分 別 達(dá) 100.00%、93.88%、60.51%(圖 1)。 故選取上述3 種供試菌，進(jìn)一步測(cè)定大花獨(dú)蒜蘭提取物對(duì)其毒力回歸方程及致死中濃度EC50。

圖1 大花獨(dú)蒜蘭提取物對(duì)11 種真菌的抑菌活性Figure 1 Anti-phytopathogenic activity of Pleione grandiflora extracts against eleven plant fungi

2.2 不同濃度的大花獨(dú)蒜蘭提取物對(duì)3 種植物病原真菌的抑制率

選取3 種抑制效果明顯的供試菌，分別測(cè)定不同濃度的大花獨(dú)蒜蘭提取物對(duì)這些病原真菌的抑制率(圖2)。 結(jié)果顯示，0.05、0.10、0.20 mg·mL-1大花獨(dú)蒜蘭提取物對(duì)白菜炭疽病菌的抑制率分別為10.19%、29.30%、66.88%。 0.50、1.00、2.00 mg·mL-1大花獨(dú)蒜蘭提取物對(duì)芭樂(lè)炭疽病菌的抑制率分別為12.43%、49.7%、93.88%。 1.00、1.50、2.00 mg·mL-1大花獨(dú)蒜蘭提取物對(duì)鏈孢粘帚霉病菌的抑制率分別為29.14%、46.36%、60.93%。

圖2 大花獨(dú)蒜蘭提取物對(duì)3 種真菌的抑制率Figure 2 Inhibition rates of Pleione grandiflora extracts against three plant fungi

2.3 3 種植物病原真菌的致死中濃度測(cè)定

根據(jù)表2，采用最小二乘法計(jì)算，大花獨(dú)蒜蘭提取物對(duì)白菜炭疽病菌毒力方程為y＝7.377 0＋2.836 2lgx(r＝0.996 3)，當(dāng)抑制率為 50%時(shí)，EC50＝0.145 2 mg·mL-1。 對(duì)芭樂(lè)炭疽病菌毒力方程為y＝5.127 9＋4.487 7lgx(r＝0.995 6)，當(dāng)抑制率為 50%時(shí)，EC50＝0.936 5 mg·mL-1。 對(duì)鏈孢粘帚霉病菌毒力方程為y＝4.443 0＋2.739 3lgx(r＝0.999 5)，當(dāng)抑制率為50%時(shí)，EC50＝1.597 0 mg·mL-1。

表2 大花獨(dú)蒜蘭提取物對(duì)3 種真菌的毒力測(cè)定Table 2 Virulence of Pleione grandiflora extracts against three plant fungi

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定大花獨(dú)蒜蘭假鱗莖乙醇提取物對(duì)11 種植物病原真菌的抑菌活性。 試驗(yàn)結(jié)果表明該提取物對(duì)白菜炭疽菌、芭樂(lè)炭疽病菌、鏈孢粘帚霉病菌具有顯著的抑制作用，且抑制活性優(yōu)于目前大量使用的環(huán)境友好型植物源農(nóng)藥乙蒜素(吳沙沙et al，2021)。 結(jié)合回歸分析數(shù)據(jù)，大花獨(dú)蒜蘭提取物對(duì)白菜炭疽病菌的抑菌活性最好，EC50值為0.145 2 mg·mL-1，可作為一種新型植物源農(nóng)藥進(jìn)一步研究，同時(shí)對(duì)大花獨(dú)蒜蘭野生種植資源的科學(xué)利用有一定參考價(jià)值。