馬若夢 李定祥 彭珣 李鈺佳 陽晶晶 鄧奕輝

〔摘要〕 目的 研究缺血性中風(fēng)瘀毒互結(jié)模型（簡稱“IS-YD”）大鼠在不同缺血時相、不同腦區(qū)凝血酶（Thrombin）與微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（light chain 3， LC3）的動態(tài)性變化及二者的相關(guān)性。方法 將128只SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、IS-YD（2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h）組，每組16只。分別于術(shù)后2、4、8、12、24、48、72 h取材前進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，隨即處死大鼠取出腦組織并分出大腦皮質(zhì)與海馬，2，3，5-三苯基氯化四氮唑染色觀察并計(jì)算每組大鼠的腦梗死體積，Western blot法檢測大腦皮質(zhì)與海馬的Thrombin、LC3Ⅱ/Ⅰ比值的表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，IS-YD 12 h、24 h、48 h組神經(jīng)功能缺損評分升高（P<0.05）。與假手術(shù)組及IS-YD 2 h、4 h組相比，IS-YD 8 h、12 h、24 h、48 h、72 h組腦梗死體積顯著增大（P<0.01）;與IS-YD 8 h組相比，IS-YD 12 h、24 h、

48 h、72 h組腦梗死體積顯著增大（P<0.01）;與IS-YD 12 h組相比，IS-YD 48 h、72 h組腦梗死體積顯著增大（P<0.01）;與IS-YD 24 h組相比，IS-YD 48 h、72 h組腦梗死體積顯著增大（P<0.01）;與IS-YD 48 h組相比，IS-YD 72 h組腦梗死體積顯著增大（P<0.01）。與假手術(shù)組相比，IS-YD 12 h、24 h組皮質(zhì)和海馬Thrombin、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)顯著增強(qiáng)（P<0.05）;與IS-YD 2 h、4 h組相比，IS-YD 12 h、24 h組皮質(zhì)和海馬Thrombin、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)顯著增強(qiáng)（P<0.05）;與IS-YD 8 h組相比，IS-YD 12 h、24 h組皮質(zhì)LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)顯著增強(qiáng)（P<0.01）;與IS-YD 12 h組相比，IS-YD 48 h、72 h組皮質(zhì)Thrombin、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)顯著降低（P<0.05），海馬LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)顯著降低（P<0.05）;與IS-YD 24 h組相比，IS-YD 48 h、72 h組皮質(zhì)和海馬Thrombin、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)顯著降低（P<0.05）。兩種蛋白呈現(xiàn)直線相關(guān)性，且皮質(zhì)Thrombin與LC3Ⅱ/Ⅰ的密切程度為56.7%，海馬Thrombin、LC3Ⅱ/Ⅰ的密切程度為53.3%。結(jié)論 腦損傷后Thrombin與自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ在7個不同缺血時間點(diǎn)動態(tài)表達(dá)規(guī)律相似，并且具有高度相關(guān)性，同時明確了自噬變化最明顯的兩個時間點(diǎn)，也為進(jìn)一步研究治療腦梗死篩選了最佳藥物反應(yīng)時間點(diǎn)。

〔關(guān)鍵詞〕 凝血酶;自噬;缺血性中風(fēng);瘀毒互結(jié);化瘀解毒法;微管相關(guān)蛋白1輕鏈3;2，3，5-三苯基氯化四氮唑

〔中圖分類號〕R255.2 ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.06.005

Correlation of Thrombin and LC3Ⅱ/Ⅰ expression in different ischemic phases and

different brain regions in MCAO model rats

MA Ruomeng1，2， LI Dingxiang3， PENG Xun1，2， LI Yujia1，2， YANG Jingjing1，2， DENG Yihui3*

（1. College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha，

Hunan 410208， China; 2. Key Laboratory of Hunan Province for Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Prevention and Treatment of Cardio-Cerebral Diseases， Changsha， Hunan 410208， China; 3. College of Traditional Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To study the dynamic changes of Thrombin and microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC3） in different ischemic phases and different brain regions in ischemic stroke with blood stasis and toxin interaction model （"IS-YD"） and their correlation. Methods A total of 128 SD male rats were randomly divided into sham operation group and IS-YD （2 h， 4 h， 8 h， 12 h， 24 h， 48 h， 72 h） groups， with 16 rats in each group. Neurological deficits were scored at 2， 4， 8， 12， 24， 48， and 72 hours after the operation， respectively， and then the rats were sacrificed to remove the brain tissue， and the cerebral cortex and hippocampus were separated. The volume of cerebral infarction in each group was observed and calculated by 2，3，5-triphenyltetrazole chloride staining， and the expression of Thrombin and LC3Ⅱ/Ⅰ ratio in cerebral cortex and hippocampus was detected by Western blot method. Results Compared with the sham operation group， the IS-YD 12 h， 24 h and 48 h groups had higher neurological deficit scores （P<0.05）. Compared with the sham operation group and the IS-YD 2 h， 4 h groups， the cerebral infarction volume in the IS-YD 8 h， 12 h， 24 h， 48 h， and 72 h groups was significantly increased （P<0.01）; compared with the IS-YD 8 h group， the volume of cerebral infarction in the IS-YD 12 h， 24 h， 48 h， and 72 h groups increased significantly （P<0.01）; compared with IS-YD 24 h group， the cerebral infarction volume of IS-YD 48 h and 72 h groups increased significantly （P<0.01）; compared with the 48 h group， the volume of cerebral infarction in the IS-YD 72 h group was significantly increased （P<0.01）. Compared with the sham operation group， the expression levels of Thrombin and LC3II/I in the cortex and hippocampus of the IS-YD 12 h and 24 h groups were significantly enhanced （P<0.05）; compared with the IS-YD 2 h and 4 h groups， the expression levels of Thrombin and LC3Ⅱ/Ⅰ in the cortex and hippocampus of the IS-YD 12 h and 24 h groups were significantly enhanced （P<0.05）; compared with IS-YD 8 h group， the expression of LC3Ⅱ/Ⅰ in the cortex of the IS-YD 12 h and 24 h groups was significantly enhanced （P<0.01）; compared with IS-YD 12 h group， the expression levels of Thrombin and LC3II/I in the cortex of the IS-YD 48 h， 72 h groups were significantly decreased （P<0.05）， and the expression of LC3II/I in the hippocampus was significantly decreased （P<0.05）; compared with IS-YD 24 h group， the expression levels of Thrombin and LC3Ⅱ/Ⅰ in the cortex and hippocampus were significantly decreased （P<0.05）. The two proteins showed a linear correlation， and the correlation between Thrombin and LC3Ⅱ/Ⅰ was 56.7% in the cortex and 53.3% in the hippoc?ampus. Conclusion After brain injury， Thrombin and autophagy-related protein LC3Ⅱ/Ⅰ have similar dynamic expression patterns at seven different ischemia time points， and are highly correlated. At the same time， the two time points with the most obvious changes in autophagy are identified， and the optimal time points of drug reaction are screened for further study on the treatment of cerebral infarction.CBA2E9D1-1A87-476B-BD87-B1A5CC4A17F9

〔Keywords〕 Thrombin; autophagy; ischemic stroke; blood stasis and toxin interaction; removing blood stasis and detoxification method; microtubule-associated protein 1 light chain 3; 2，3，5-triphenyltetrazole chloride

急性缺血性腦卒中有缺血性卒中與出血性卒中之分，其中缺血性卒中發(fā)病率高達(dá)85%，是一種由各種致病因素導(dǎo)致局部腦血流供應(yīng)出現(xiàn)障礙，從而造成相應(yīng)腦部組織損傷以及神經(jīng)功能缺失的一種疾病[1]。其治療策略主要集中在腦缺血急性期的早期血運(yùn)重建、緊急介入治療和應(yīng)用重組組織型纖溶酶原激活物等血管內(nèi)治療，且研究證明，缺血后12～48 h存在神經(jīng)保護(hù)的時間窗[2-3]。溶栓治療是臨床上有效的治療方法，但受限于其狹窄的時間窗和較高的腦出血風(fēng)險，故迫切需要尋求新的有效方法控制卒中。中醫(yī)稱該病為“中風(fēng)”，自秦漢以來，認(rèn)為其病機(jī)無外乎“風(fēng)火痰瘀虛”五端[4]。隨著時代的變遷和歷代醫(yī)家研究的愈發(fā)深入，“瘀毒致風(fēng)”理論逐漸成為該病新的病機(jī)學(xué)說，瘀毒損傷腦絡(luò)，使絡(luò)損神傷，絡(luò)虛邪氣留滯，病理產(chǎn)物不能排出體外，進(jìn)一步加重原有病情，且致病能力比原病邪有過之而無不及。闡明缺血性卒中疾病的現(xiàn)代生物學(xué)實(shí)質(zhì)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[5]。

自噬即細(xì)胞自我吞噬的過程，是大多數(shù)真核生物古老的進(jìn)化機(jī)制[6]。越來越多的證據(jù)顯示，靶向與自噬相關(guān)的信號通路可能是治療腦缺血的一個有效途徑[7-8]。自噬可能是治療缺血性卒中的新靶點(diǎn)，在缺血性腦損傷期間被激活并且參與神經(jīng)元死亡的調(diào)節(jié)[9]。自噬的機(jī)制復(fù)雜，自噬活性的增強(qiáng)在腦缺血過程中起有益作用還是有害作用尚未有定論且存在著爭議[10]。營養(yǎng)因子缺乏、生長因子撤離、高溫、缺氧、激素刺激，均可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶（Thrombin）也可誘導(dǎo)腦內(nèi)自噬的發(fā)生，從而加重腦損傷[11-12]。然而缺血性卒中中自噬的時間依賴性變化尚是未知的，且關(guān)于通過Thrombin誘導(dǎo)自噬的研究尚少。本文將從Thrombin誘導(dǎo)自噬從而介導(dǎo)腦損傷的角度討論Thrombin與微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（light chain 3， LC3）之間的相關(guān)性，從而為關(guān)于誘導(dǎo)自噬的研究提供一個新的思路。

1 材料與方法

1.1 ?動物

健康SPF級雄性大鼠128只，體質(zhì)量220～240 g，由湖南斯萊克景達(dá)動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號：SYXK（湘）2019-0009。在湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物中心飼養(yǎng)，其實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境設(shè)施合格證號：SYXK（湘）2015-0003，動物飼養(yǎng)及手術(shù)環(huán)境溫度控制在20～25 ℃，相對濕度50%～70%。

1.2 ?主要試劑

Thrombin抗體（美國Abcam公司，批號：ab92621）;LC3B抗體、β-actin、HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠抗體（美國Proteintech公司，批號：14600-1-AP、66009-1-IG、SA00001-2、SA00001-1）;2，3，5-三苯基氯化四氮唑（美國Sigma公司，批號：T8877-25G）;RIPA裂解液（上海碧云天公司，批號：P0013B）;蛋白酶抑制劑（北京金泰宏達(dá)公司，批號：583794）。

1.3 ?主要儀器

搖床、漩渦混合器（江蘇其林貝爾公司，型號：TS-1、GL-88B）;臺式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀公司，型號：H1650R）;電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-6C、DYCZ-24DN、DYCZ-40D）;生物樣品勻漿機(jī)（杭州奧盛儀器有限公司，型號：BioPrep-24）。

1.4 ?實(shí)驗(yàn)分組和造模方法

1.4.1 ?實(shí)驗(yàn)分組 ?先將大鼠在動物中心屏障系統(tǒng)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，按照隨機(jī)數(shù)字表法將128只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血性中風(fēng)瘀毒互結(jié)模型（簡稱“IS-YD”）組，按不同的缺血時相將IS-YD組分為IS-YD（2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h）組，每組16只。

1.4.2 ?缺血性中風(fēng)瘀毒互結(jié)病證結(jié)合模型制備 ?首先參考蔣成婷等[13]建立的方法改良制作，即先將大鼠于動物中心屏障系統(tǒng)內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，于第8天腹腔注射1%角叉菜膠50 mg/kg，每天1次，連續(xù)3 d，再于第11天皮下注射干酵母混懸液10 mL/kg。24 h后采用可逆性大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occulation model， MCAO）線栓法[14]制備缺血性中風(fēng)模型，即術(shù)前用10%水合氯醛0.003 5 mL/g腹腔注射進(jìn)行麻醉，取仰臥位固定大鼠，在其頸部備皮并用聚維酮碘消毒，于頸部正中稍右側(cè)作切口，鈍性分離皮下組織，在靠近氣管肌旁，用黑色縫合線分離出與迷走神經(jīng)并行的右頸總動脈，順著頸總動脈往上找到三叉口，以此繼續(xù)分離出頸內(nèi)動脈與頸外動脈，將主動脈夾夾住頸外動脈，于頸總動脈近心端插入頭端用石蠟包被的單絲尼龍魚線，栓線長度自頸總動脈分叉處18～20 mm，再將多余的尼龍線尾部與頸總動脈結(jié)扎，隨即在切口處撒上阿莫西林粉末，進(jìn)行縫合處理。假手術(shù)組除了不插入栓線，其余操作同IS-YD組。術(shù)中記錄插入栓線的時間，以此來確定缺血時相和取材時間。術(shù)后將大鼠置于飼養(yǎng)籠里，自由進(jìn)食和飲水。以大鼠手術(shù)后出現(xiàn)左側(cè)肢體癱瘓，站立不穩(wěn)，提尾時向一側(cè)轉(zhuǎn)圈為模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)[14]。

1.4.3 ?神經(jīng)功能缺損評分 ?待動物清醒后，參照Zea Longa評分標(biāo)準(zhǔn)[14]檢測動物神經(jīng)功能缺損評分。0分：無神經(jīng)功能缺損;1分：不能完全伸展左側(cè)前爪;2分：向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分：向左側(cè)傾倒;4分：不能自發(fā)行走且意識水平低下。1～3分為造模成功，否則棄之不用。CBA2E9D1-1A87-476B-BD87-B1A5CC4A17F9

1.5 ?標(biāo)本采集

1.5.1 ?皮質(zhì)和海馬分離 ?將術(shù)后蘇醒的64只大鼠逐個進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分并記錄，根據(jù)插入栓線時間推算每組缺血各時相的取材時間，分別于缺血后2、4、8、12、24、48、72 h，用10%水合氯醛按0.003 5 mL/g的劑量麻醉大鼠后，在冰盒上快速斷頭取腦，并且分離出大腦皮質(zhì)和海馬置于凍存盒，存放在-80 ℃冰箱里備用。

1.5.2 ?斷頭取腦 ?與上述操作相同，將另外一批64只大鼠快速斷頭取腦。

1.6 ?指標(biāo)檢測

1.6.1 ?2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride， TTC）染色測定腦梗死體積 ?從

-20 ℃冰箱里取出冰凍鼠腦，放置于腦槽為2 mm的腦切片模具內(nèi)，在額極與枕極處放置兩片刀片以固定大腦便于均勻切片，從視交叉處額極到枕極處連續(xù)切5片，厚度均為2 mm，將其置于錫箔紙覆蓋的2% TTC溶液中染色，染色后梗死區(qū)變?yōu)榘咨?，非梗死區(qū)呈現(xiàn)紅色，為使每片腦片染色均勻，37 ℃水浴鍋中孵育15 min，且每5 min翻面，之后轉(zhuǎn)移到放有多聚甲醛的6孔板中進(jìn)行固定，24 h后進(jìn)行拍照，拍照注意采用統(tǒng)一角度、高度，盡量保證統(tǒng)一光線。最后使用Image Pro Plus 6.0軟件分析計(jì)算腦梗死體積所占百分比。

1.6.2 ?Western blot法檢測Thrombin和LC3蛋白的表達(dá)水平 ?分別剪取50 mg的皮質(zhì)和海馬組織，加入500 μL裂解液（RIPA∶蛋白酶抑制劑=50∶1），于4 ℃冰箱預(yù)冷的生物樣品勻漿機(jī)中反復(fù)研磨充分裂解，之后4 ℃，12 000 r/min，離心半徑為17.8 cm，離心10 min，得到上清液。取100 μL蛋白原液，加入25 μL

5×loading buffer混勻，沸水煮15 min。點(diǎn)樣、電泳、轉(zhuǎn)膜封閉后進(jìn)行抗體孵育[LC3B兔抗（1∶2000）、Thrombin兔抗（1∶1000）、β-actin鼠抗（1∶5000）]，將膜與一抗一起孵育，4 ℃過夜，HRP標(biāo)記的二抗（1∶8000）次日孵育。

1.7 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析原始數(shù)據(jù)，以“x±s”表示計(jì)量資料，組間比較采用單因素方差分析。方差齊者，組間兩兩比較采用LSD或SNK法，方差不齊者，則選用Games-Howell方法比較;若不符合正態(tài)性分布，則采用多樣本秩和檢驗(yàn)，即Kruskal-Wallis單因素ANOVA分析，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能缺損評分為0分。與假手術(shù)組比較，IS-YD 48 h組（P<0.05）和IS-YD 12 h、24 h組（P<0.01）神經(jīng)功能缺損評分顯著升高。詳見表1。

2.2 ?各組大鼠腦組織梗死體積比較

假手術(shù)組及IS-YD 2 h、4 h組未發(fā)生腦梗死，即腦梗死面積為零。與假手術(shù)組及IS-YD 2 h、4 h組相比，IS-YD 8 h、12 h、24 h、48 h、72 h組腦梗死體積顯著增大（P<0.01）;與IS-YD 8 h組相比，IS-YD 12 h、24 h、48 h、72 h組腦梗死體積顯著增大（P<0.01）;與IS-YD 12 h、24 h組相比，IS-YD 48 h、72 h組腦梗死體積顯著增大（P<0.01）;與IS-YD 48 h組相比，IS-YD 72 h組腦梗死體積顯著增大（P<0.01）。詳見表2、圖1。

2.3 ?各組大鼠Thrombin和 LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)水平比較

與假手術(shù)組相比，IS-YD 12 h、24 h組海馬及皮質(zhì)Thrombin、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)顯著增強(qiáng)（P<0.05，P<0.01）;與IS-YD 2 h組相比，IS-YD 12 h、24 h組皮質(zhì)、海馬及IS-YD 48 h組海馬Thrombin、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)顯著增強(qiáng)（P<0.05，P<0.01）;與IS-YD 4 h組相比，IS-YD 12 h、24 h組皮質(zhì)、海馬及IS-YD 48 h組皮質(zhì)Thrombin、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)顯著增強(qiáng)（P<0.05）;與IS-YD 8 h組相比，IS-YD 12 h、24 h組皮質(zhì)LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)顯著增強(qiáng)（P<0.01）;與IS-YD 12 h、24 h組相比，IS-YD 48 h、72 h組皮質(zhì)及海馬Thrombin、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)顯著降低（P<0.05）。詳見圖2、表3。

2.4 ?Thrombin與LC3Ⅱ/Ⅰ相關(guān)性分析

使用SPSS 25.0軟件對大腦皮質(zhì)、海馬Thrombin與LC3Ⅱ/Ⅰ的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行直線相關(guān)分析、建立回歸方程。可看出散點(diǎn)圖均有一定的直線趨勢，且Thrombin與LC3Ⅱ/Ⅰ兩個變量均符合正態(tài)性分布，故選擇Pearson相關(guān)分析，分別得出Pearson積差相關(guān)系數(shù)r皮質(zhì)為0.753>0.70，P皮質(zhì)=0.000<0.05;r海馬為0.73>0.70，P海馬=0.000<0.05，因此二者有直線相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步作直線回歸方程，分別得出樣本回歸方程的決定系數(shù)R2皮質(zhì)=0.567，R2海馬=0.533。說明大腦皮質(zhì)、海馬的Thrombin與LC3Ⅱ/Ⅰ呈正相關(guān)關(guān)系，皮質(zhì)Thrombin與LC3Ⅱ/Ⅰ的密切程度有56.7%，海馬二者的密切程度有53.3%。詳見圖3-4。CBA2E9D1-1A87-476B-BD87-B1A5CC4A17F9

3 討論

急性腦梗死屬本虛標(biāo)實(shí)，是在氣血虧虛于內(nèi)的基礎(chǔ)上，合并情志失調(diào)、飲食不節(jié)、勞倦內(nèi)傷、年老體衰等誘因而發(fā)作，引起臟腑陰陽失調(diào)，氣血逆亂，上犯于腦，形成腦脈痹阻之缺血中風(fēng)或者血溢脈外之出血中風(fēng)。歷代醫(yī)家對中風(fēng)病的闡述，大多從風(fēng)、火、痰、氣、血、虛方面出發(fā)。《素問·至真要大論》云：“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”“諸暴強(qiáng)直，皆屬于風(fēng)”。基于中醫(yī)基礎(chǔ)理論，肝為風(fēng)木之臟，肝為剛臟，體陰而用陽，主生發(fā)生動，如若各種原因?qū)е戮岛?，肝陰不足，則致肝陽偏亢，升發(fā)太過，形成肝陽化風(fēng)之象，則為掉眩;嚴(yán)重者加上暴怒的情緒干擾，肝陽暴漲于上，血隨氣逆，蒙蔽清竅發(fā)為中風(fēng)?！端貑枴ふ{(diào)經(jīng)論》云“血之與氣，并走于上，則為大厥，厥則暴死，氣復(fù)反則生，不反則死”，說明中風(fēng)病的病機(jī)是由于氣血逆亂，并走于上，蒙蔽清竅，神明失守則猝然昏仆。王永炎院士[15]首次提出了“毒損腦絡(luò)”學(xué)說，認(rèn)為中風(fēng)病毒邪的產(chǎn)生無外乎兩個方面，一是病因積累，諸邪叢生;二是正衰積損，邪熾成毒。換言之，即在反復(fù)的外邪侵襲、情志失調(diào)及長期的飲食失度、勞倦過度、臟腑功能失常等多種病因的作用下，形成風(fēng)、火、痰、氣滯、血瘀，即產(chǎn)生了一種新的致病因素——毒邪。該毒邪仍具有原病邪的致病特點(diǎn)，但其致病作用比原病邪有過之而無不及，是風(fēng)、火、痰、瘀等邪的復(fù)合形式。毒邪致病力強(qiáng)，直接導(dǎo)致正衰積損，進(jìn)一步引起機(jī)體無力祛邪排毒，毒邪進(jìn)一步在體內(nèi)蓄積，形成惡性循環(huán)。中風(fēng)病中常見的毒邪有熱毒、痰毒、瘀毒、寒毒等，因此，“瘀毒致風(fēng)”理論逐漸成為中風(fēng)病新的病機(jī)學(xué)說[16]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，化瘀解毒方可抑制Thrombin的毒性和炎性，減輕腦組織中炎性因子的浸潤，明顯改善大鼠缺損的神經(jīng)功能。由此，也從以方測證的角度印證了瘀毒病機(jī)假說存在的科學(xué)性[17]。

Thrombin是一種被凝血酶原切割而成的絲氨酸蛋白酶，介導(dǎo)纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，是參與血栓形成的核心因素。事實(shí)上，Thrombin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的毒性作用已經(jīng)在各種缺血模型中顯示出來。低水平的Thrombin活性具有神經(jīng)保護(hù)作用，高水平的Thrombin活性是有害的，且缺血半球的Thrombin活性和梗死體積之間有顯著相關(guān)性[18]。Thrombin的活性衍生物為凝血酶原（Prothrombin），Prothrombin和Thrombin一起在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中局部表達(dá)。在中風(fēng)疾病中，高水平的Thrombin直接促進(jìn)細(xì)胞毒性、血管破裂、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，受損傷大腦半球內(nèi)的Thrombin活性與腦梗死體積之間也有直接相關(guān)性[19]。同時，Thrombin的血管內(nèi)效應(yīng)包括誘導(dǎo)血腦屏障破壞、腦水腫、神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元死亡，均是由PAR（PAR-1、PAR-3、PAR-4）及其多種腦細(xì)胞類型中的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)[20]。

新近研究發(fā)現(xiàn)，Thrombin可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生[11-12]。HU等[11]通過耳內(nèi)注射Thrombin特異性地提高了Beclin-1和LC3這兩種自噬標(biāo)記物在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，并促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)而非神經(jīng)元內(nèi)自噬空泡的形成。之后進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，在同側(cè)基底節(jié)中，耳內(nèi)注射Thrombin可增加LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化、組織蛋白酶D水平和自噬空泡的形成。WU等[21]的動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，腦出血患者血漿Thrombin-抗凝血酶復(fù)合物濃度與腦出血嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，且血腫周圍區(qū)域的神經(jīng)元存在自噬，Thrombin可能參與了這些神經(jīng)元自噬的激活。鄭佳駿等[22]所做的體內(nèi)和離體實(shí)驗(yàn)表明，Thrombin處理24 h后，星形細(xì)胞中自噬明顯激活;而將Thrombin注射到大鼠腦內(nèi)3 d后，自噬活性亦達(dá)到高峰，證明Thrombin以時間依賴的方式參與腦出血后的病理生理過程，且是腦出血后細(xì)胞自噬的重要誘因。亦有研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞中的炎癥因子分泌、氧化應(yīng)激和自噬均被Thrombin加重，而SPRED2基因敲除可抑制Thrombin，證明Thrombin通過激活SPRED2介導(dǎo)的自噬作用加重星形膠質(zhì)細(xì)胞的缺血再灌注損傷[23]。

檢測自噬有多種方法，LC3貫穿整個自噬過程，是目前公認(rèn)的自噬標(biāo)記物。在自噬成熟過程中，LC3-Ⅰ在C端有少量氨基酸被切割后轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，LC3和磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成自噬小體膜的一部分，LC3-PE促進(jìn)自噬體和溶酶體的相互作用，因此以自噬小體的數(shù)量來檢測自噬的活性與LC3-Ⅱ數(shù)量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值直接相關(guān)。由此，本實(shí)驗(yàn)通過檢測LC3Ⅱ/Ⅰ比值的表達(dá)來驗(yàn)證自噬的活性。

本實(shí)驗(yàn)研究探討了缺血性中風(fēng)進(jìn)展過程中Thrombin、自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ的動態(tài)變化，為缺血性腦損傷的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)缺血性中風(fēng)后Thrombin與自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)呈正相關(guān)，且均在缺血12 h、缺血24 h達(dá)到高值，由此證明了Thrombin、自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、缺血性腦損傷的變化三者均具有時間依賴性，且三者之間具備內(nèi)在聯(lián)系。同時為進(jìn)一步研究治療腦梗死篩選了最佳藥物反應(yīng)時間點(diǎn)，可指導(dǎo)下一階段對中成藥干預(yù)該病證結(jié)合模型的研究。其內(nèi)在機(jī)制可能是高水平的Thrombin通過上調(diào)相應(yīng)腦區(qū)的自噬水平，進(jìn)而加重對腦組織的損傷，具體過程不僅有Thrombin本身對血腦屏障的神經(jīng)毒性，更有自噬過度被激活對重要細(xì)胞器甚至是細(xì)胞核的吞噬降解，引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞死亡[6]。因此，該實(shí)驗(yàn)認(rèn)為高水平的Thrombin活性、過度發(fā)生的自噬會促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能缺損，加重腦梗死體積占比。除此之外，明確了自噬變化最明顯的兩個時間點(diǎn)，可用于指導(dǎo)下一階段用藥干預(yù)抑制自噬，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)仍存在著不足和需要改進(jìn)之處：第一，未來可從其他誘導(dǎo)自噬的因素角度挖掘與自噬相關(guān)性高的影響因素;第二，在缺血2～72 h時相內(nèi)，Thrombin、LC3Ⅱ/Ⅰ、腦梗死體積占比表現(xiàn)并非完全一致，其原因與內(nèi)在機(jī)制值得進(jìn)一步探索與思考;第三，未來可從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)入手進(jìn)一步驗(yàn)證Prothrombin與自噬之間的關(guān)系。CBA2E9D1-1A87-476B-BD87-B1A5CC4A17F9

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