基于IL-27/STAT1通路探討針刺肺俞穴糾正哮喘模型大鼠Th1/Th2免疫平衡的機制

雷俊 羅玲艷 孫藝 喬松

〔摘要〕 目的 從白細胞介素（interleukin， IL）-27/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1， STAT1）探究針刺肺俞穴改善哮喘大鼠輔助性T細胞（helper T cell， Th）1/Th2免疫平衡的可能機制。方法 取140只SD雄性大鼠，隨機分為正常組、模型組、IL-27預(yù)防組、IL-27治療組、針刺肺俞組、STAT1抑制劑組、針刺肺俞加STAT1抑制劑組，每組20只。除正常組外，其余各組均進行卵白蛋白反復(fù)致敏建立哮喘模型。肺功能儀檢測氣道高反應(yīng)性;ELISA法檢測血清及肺泡灌洗液中IL-4、干擾素γ（interferon γ， IFN-γ）、免疫球蛋白E（immunoglobulin， IgE）水平;流式細胞儀檢測脾臟Th1/Th2比例;HE染色觀察肺組織病理變化;免疫組化法檢測IL-4、IFN-γ、磷酸化STAT1（p-STAT1）陽性表達;Western blot法檢測IL-27、STAT1、IL-4、IFN-γ、T-bet及GATA3蛋白表達。結(jié)果 與正常組相比，模型組大鼠氣道高反應(yīng)性升高，脾臟Th1/Th2比例降低，血清及肺泡灌洗液中IL-4水平升高而IFN-γ水平降低，肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞比例升高，肺組織支氣管黏膜水腫及炎性細胞浸潤等病理損傷加重，促Th1/Th2比例平衡相關(guān)通路IL-27/STAT1處于抑制狀態(tài)（P<0.05）。與模型組相比，IL-27預(yù)防組、IL-27治療組及針刺肺俞組均可緩解大鼠肺組織損傷，促進IL-27/STAT1活化，糾正Th1/Th2平衡，改善哮喘大鼠氣道高反應(yīng)性（P<0.05）;其中，IL-27預(yù)防組對哮喘大鼠的上述改善作用均優(yōu)于針刺肺俞組（P<0.05）。此外，STAT1抑制劑可加重哮喘大鼠肺組織損傷，促進氣道高反應(yīng)及Th1/Th2免疫平衡紊亂，并削弱針刺肺俞穴發(fā)揮的促IL-27/STAT1活化、糾正Th1/Th2免疫平衡等作用（P<0.05）。結(jié)論 針刺肺俞穴治療哮喘大鼠的作用機制，可能與促進IL-27/STAT1通路活化，糾正Th1/Th2免疫平衡有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 哮喘;白細胞介素-27;信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1;免疫平衡;針刺;肺俞穴

〔中圖分類號〕R256.12 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.06.018

Mechanism of acupuncture at "Feishu" （BL13） to correct Th1/Th2 immune

balance in asthma model rats based on IL-27/STAT1 pathway

LEI Jun1*， LUO Lingyan2， SUN Yi3， QIAO Song1

（1. Department of Pulmonary Diseases， Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medicine， Wuhan， Hubei 430000， China;

2. Medical Department of Yangtze University， Jinzhou， Hubei 433200， China; 3. Oncology Department， Shanghai

Gongli Hospital of Pudong District， Shanghai 200135）

〔Abstract〕 Objective To explore the potential mechanism of acupuncture at "Feishu" （BL13） to improve the immune balance of helper T cell （Th）1/Th2 in asthma rats based on interleukin （IL）-27/signal transducer and activator of transcription 1 （STAT1）. Methods A total of 140 male SD rats were randomly divided into normal group， model group， IL-27 prevention group， IL-27 treatment group， acupuncture Feishu group， STAT1 inhibitor group and acupuncture Feishu plus STAT1 inhibitor group， with 20 rats in each group. Except the normal group， the other groups were repeatedly sensitized with ovalbumin to establish asthma model. Airway hyperresponsiveness was measured by pulmonary function instrument; the levels of interleukin （IL）-4， interferon γ （IFN-γ） and immunoglobulin E （IGE） in serum and alveolar lavage fluid were detected by ELISA; the ratio of Th1/Th2 in spleen was detected by flow cytometry; HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissue; positive expression of IL-4， IFN-γ and phosphorylated STAT1 （p-STAT1） were detected by immunohistochemistry; protein expression levels of IL-27， STAT1， IL-4， IFN-γ， T-bet and GATA3 were detected by Western blot. Results Compared with the normal group， the airway hyperresponsiveness of model group increased， the ratio of spleen Th1/Th2 decreased， the levels of IL-4 in serum and alveolar lavage fluid increased， and the level of IFN-γ decreased， the proportion of eosinophils in alveolar lavage fluid increased， the pathological damage such as bronchial mucosal edema and inflammatory cell infiltration in lung tissue aggravated， and the related pathway of promoting Th1/Th2 ratio balance IL-27/STAT1 was inhibited （P<0.05）. Compared with the model group， IL-27 prevention group， IL-27 treatment group and acupuncture Feishu group can alleviate lung tissue injury， promote IL-27/STAT1 activation， correct Th1/Th2 balance and improve airway hyperresponsiveness in asthma rats （P<0.05）; among them， the above improvement effects of IL-27 prevention group on asthma rats were better than that of acupuncture Feishu group （P<0.05）. In addition， STAT1 inhibitor can aggravate lung tissue injury， promote airway hyperresponsiveness and Th1/Th2 immune balance disorder in asthma rats， and weaken the effects of acupuncture at "Feishu" （BL13） on promoting IL-27/STAT1 activation and correcting Th1/Th2 immune balance （P<0.05）. Conclusion The mechanism of acupuncture at "Feishu" （BL13） in the treatment of asthma rats may be related to promoting IL-27/STAT1 pathway activation and correcting Th1/Th2 immune balance.

〔Keywords〕 asthma; interleukin-27; signal transducer and activator of transcription 1; immune balance; acupuncture; "Feishu" （BL13）

哮喘是一種嚴重的慢性疾病，若治療不及時、不規(guī)范，可危及生命[1]。目前研究認為，哮喘是一種以輔助性T細胞（helper T cell，Th）1/Th2免疫平衡失調(diào)介導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)性疾病[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)，白細胞介素（interleukin， IL）-27可刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1， STAT1）磷酸化活化，來促進Th1分化、抑制Th2分化，維持機體Th1/Th2免疫平衡，發(fā)揮哮喘保護作用[3]，提示調(diào)控IL-27/STAT1通路可能是哮喘治療的新通路及靶點。

中醫(yī)治療哮喘具有豐富的臨床經(jīng)驗，并取得了較大進展[4]，其中以針灸治療哮喘的療效較為突出[5]。已有研究顯示，針刺治療可顯著改善急性發(fā)作期哮喘患者的肺功能及炎癥癥狀[6]。肺俞穴位于足太陽膀胱經(jīng)，是治療肺疾的重要腧穴，有調(diào)理肺臟、止咳平喘之功。王執(zhí)中《針灸資生經(jīng)》曰“因與人治哮喘，只謬肺俞，不謬他穴”[7]，提示肺俞穴在治療哮喘疾病中起到重要作用。故對肺俞、脾俞、腎俞等穴位進行針灸可抑制Th17、Th2生成，改善Th1/Th2免疫平衡，推測肺俞穴可通過調(diào)控Th1/Th2免疫平衡，改善哮喘疾病[8]。目前，針刺肺俞穴治療哮喘的具體機制還不甚明確，這不利于我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的發(fā)展及推廣應(yīng)用。因此，本研究建立大鼠哮喘模型，從IL-27/STAT1通路探究針刺肺俞穴對哮喘Th1/Th2免疫平衡及氣道炎癥反應(yīng)的影響，以期闡明針刺肺俞穴治療哮喘的分子機制，并為其臨床應(yīng)用提供客觀實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 ?實驗材料

SD大鼠140只，6～8周齡，體質(zhì)量180～200 g，清潔級，雄性，購自河北省實驗動物中心[河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，SCXK（冀）2021-002]。試驗符合3R原則，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準[IACUC-01（202100013）]。

卵白蛋白（批號：2021032，上海一研生物科技有限公司）;IL-4 ELISA試劑盒（批號：2021839，滁州仕諾達生物科技有限公司）;干擾素γ（interferon γ，IFN-γ）ELISA試劑盒（批號：cyy202173，武漢菲恩生物科技有限公司）;免疫球蛋白E（immunoglobulin，IgE）ELISA試劑盒（批號：20216381，上海木欒科技有限公司）;HE染色液（批號：20217392，北京伊塔生物科技有限公司）;兔抗大鼠抗體：IL-4（批號：877133）、IFN-γ（批號：732193）、STAT1（批號：381036）、磷酸化STAT1（p-STAT1）（批號：381749）、T-bet（批號：746173）、GATA3（批號：184629）均購自美國Abcam公司。

1.2 ?模型建立及分組干預(yù)

取140只SD雄性大鼠，隨機分為：正常組、模型組、IL-27預(yù)防組、IL-27治療組、STAT1抑制劑組、針刺肺俞組、針刺肺俞+STAT1抑制劑組，每組20只。除正常組外，其余各組均參照文獻[9]于試驗第1天及第7天經(jīng)腹腔注射含100 mg卵白蛋白及100 mg氫氧化鋁的混合溶液進行致敏，第8天至第15天每天用50 μL的1%卵蛋白（10 mg卵白蛋白溶于1 mL生理鹽水中）滴鼻激發(fā)致敏，建立哮喘模型。

正常組于相同時間給予生理鹽水處理，作為正常對照。IL-27預(yù)防組在造模試驗前1～7 d，經(jīng)鼻腔滴入50 ng的IL-27溶液（50 ng的IL-27溶于50 μL磷酸緩沖溶液中，劑量設(shè)置及給藥方式參照文獻[9]進行），2次/d，50 μL/次，連續(xù)7 d。IL-27治療組于模型造模的第15天開始連續(xù)7 d經(jīng)鼻滴注IL-27溶液進行干預(yù)治療，滴注劑量及給藥次數(shù)同IL-27預(yù)防組。針刺肺俞組參照文獻[10]于造模的第15 天開始，用0.30 mm×13 mm的一次性毫針，取大鼠脊柱兩側(cè)肺俞穴（第3胸椎下旁開1.5寸）直刺6 mm（平補平瀉法，每次留針20 min，每10 min行針1次）進行治療，1次/d，連續(xù)7 d。STAT1抑制劑組于造模的第15天開始參照文獻[11]腹腔注射80 mg/kg的STAT1抑制劑氟達拉濱（8 mg溶于1 mL磷酸緩沖溶液中，10 mL/kg體積腹腔注射）1次/d，連續(xù)7 d。針刺肺俞+STAT1抑制劑組大鼠針刺肺俞穴治療的同時，腹腔注射STAT1抑制劑氟達拉濱進行干預(yù)治療。正常組及模型組大鼠腹腔注射給予10 mL/kg磷酸緩沖溶液進行干預(yù)。

1.3 ?觀察指標

1.3.1 ?大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-4及IFN-γ水平、灌洗液中嗜酸性粒細胞比例檢測 ?各組大鼠給藥結(jié)束后，隨機取6只，取腹主動脈血3 mL，于3000 r/min、離心半徑25 cm的條件下離心10 min后，用ELISA法檢測血清IL-4、IFN-γ、IgE水平，處死大鼠，取左右兩肺臟，各用生理鹽水2 mL灌洗后，收集灌洗液，用ELISA法檢測IL-4、IFN-γ水平;取肺泡灌洗液，于4 ℃、1500 r/min、離心半徑25 cm的條件下離心5 min后收集上清液，用瑞氏染色后，于流式細胞儀上檢測嗜酸性粒細胞比例。

1.3.2 ?大鼠氣道高反應(yīng)性檢測 ?在各組大鼠中，隨機取6只大鼠，參照文獻[12]的方法，給予大鼠琥珀膽堿（0、12.5、25、50、100 μg/mL）激發(fā)后，用肺功能檢測儀檢測大鼠氣道反應(yīng)情況。

1.3.3 ?流式細胞儀檢測大鼠脾臟Th1/Th2細胞比例 ? 剩余8只大鼠，斷頭處死后取左右兩肺，左肺置于-80 ℃保存，右肺置于4%多聚甲醛中固定24 h后，制成厚為5 μm的石蠟切片備用。迅速摘取大鼠脾臟，剪取1 g脾臟組織，加入淋巴細胞分離液充分研磨至無塊狀物后，用尼龍網(wǎng)過濾，20 ℃、800 r/min（離心半徑25 cm）離心10 min后取單核細胞層，1640培養(yǎng)基洗滌及培養(yǎng)16 h后，取100 μL細胞懸液（約1×107個）放入流式管中，加入CD4-APC單克隆抗體，4 ℃避光孵育30 min后，加入Icfixation Buffer室溫孵育30 min，流式緩沖液洗滌后，進行固定/破膜處理后，加入Permeabilization Buffer室溫孵育15 min，依次加入anti-rat-IL-4-PE、anti-rat-IFN-γ-FITC，在4 ℃條件下避光孵育30 min，1 mL流式細胞緩沖液重懸后，進行上機檢測，F(xiàn)lowjo 7.61軟件分析IFN-γ-FITC、IL-4-PE比例，以二者比例代表Th1/Th2細胞比例。

1.3.4 ?肺組織病理損傷觀察 ?取肺組織石蠟切片，烤片、脫蠟、脫水及抗原修復(fù)處理后進行HE染色，光鏡下觀察支氣管肺組織病理變化。

1.3.5 ?肺組織IL-4、IFN-γ、p-STAT1免疫組化染色檢測 ?取肺組織石蠟切片，烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)及山羊血清封閉30 min后，滴加IL-4、IFN-γ、p-STAT1一抗（1∶200）于4 ℃濕盒中孵育過夜，滴加生物素標記的IgG二抗室溫孵育20 min，DAB顯色及蘇木素復(fù)染后，光鏡下觀察拍照，Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)檢測陽性染色區(qū)域的平均光密度值。

1.3.6 ?Western blot法檢測肺組織蛋白表達 取冰凍肺組織，4 ℃解凍，經(jīng)機械粉碎后勻漿提取蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，制備分離膠及濃縮膠，取60 μg蛋白行電泳及轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，滴加1∶500的IL-27、STAT1、p-STAT1、IL-4、IFN-γ、T-bet、GATA3一抗及1∶800的β-actin內(nèi)參抗體于4 ℃濕盒孵育過夜，次日多次清洗之后使用1∶1000的HRP山羊抗兔二抗室溫孵育25 min，取出PVDF膜于增強化學(xué)發(fā)光液中孵育3 min后，用曝光照相機拍照，ImageJ軟件分析計算條帶相對灰度值。

1.4 ?統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)用“x±s”表示。兩組獨立樣本間用t檢驗進行檢測，3組及以上樣本用單因素方差分析及snk-q檢驗進行檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義用P<0.05表示。

2 結(jié)果

2.1 ?針刺肺俞穴對大鼠氣道反應(yīng)性的影響

與正常組相比，模型組大鼠琥珀膽堿激發(fā)濃度為12.5、25、50、100 μg/mL時，氣道高反應(yīng)值升高（P<0.05）。與模型組相比，針刺肺俞組、IL-27預(yù)防組及IL-27治療組氣道高反應(yīng)值降低（P<0.05）;STAT1抑制劑組大鼠氣道高反應(yīng)值在原基礎(chǔ)上進一步升高（P<0.05）。IL-27預(yù)防組琥珀膽堿激發(fā)濃度為50.0、100.0 μg/mL時，氣道高反應(yīng)值較針刺肺俞組降低（P<0.05）。針刺肺俞+STAT1抑制劑組大鼠琥珀膽堿濃度為12.5、25、50、100 μg/mL時，氣道高反應(yīng)值較針刺肺俞組升高（P<0.05）。詳見表1。

2.2 ?針刺肺俞穴對大鼠血腫周圍組織病理損傷的影響

正常組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，周圍組織未見水腫;肺間隔及肺泡上皮細胞未見異常。模型組大鼠支氣管黏膜上皮水腫及變性嚴重，毛細管擴張、小支氣管和終末細支氣管黏液栓形成、肺泡腔融合擴大明顯，支氣管和血管周圍及管腔內(nèi)巨噬細胞、嗜酸性粒細胞及淋巴細胞等炎癥細胞浸潤及滲出嚴重。針刺肺俞組及IL-27治療組大鼠支氣管黏膜上皮細胞有少量水腫及變性，炎性細胞浸潤及滲出較模型減輕。IL-27預(yù)防組大鼠支氣管黏膜上皮細胞未見水腫、變性和脫落，支氣管周圍炎性細胞浸潤、嗜酸性粒細胞滲出較模型組減少。STAT1抑制劑組大鼠肺組織支氣管黏膜脫落、黏液栓形成、肺泡腔融合擴大及炎性細胞浸潤等病理損傷較模型組嚴重。針刺肺俞+STAT1抑制劑組大鼠肺組織病理損傷較針刺肺俞組嚴重。詳見圖1。

2.3 ?針刺肺俞穴對大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ水平的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-4升高（P<0.05），IFN-γ水平降低（P<0.05）。與模型組相比，針刺肺俞組、IL-27預(yù)防組、IL-27治療組血清及肺泡灌洗液中IL-4均降低（P<0.05），IFN-γ水平均升高（P<0.05）;STAT1抑制劑組大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-4升高（P<0.05），IFN-γ水平降低（P<0.05）。IL-27預(yù)防組血清及肺泡洗液中IL-4低于針刺肺俞組（P<0.05），IFN-γ水平高于針刺肺俞組（P<0.05）。與針刺肺俞組相比，針刺肺俞+STAT1抑制劑組血清及肺泡灌洗液中IL-4升高（P<0.05），IFN-γ水平降低（P<0.05）。詳見表2。

2.4 ?針刺肺俞穴對大鼠血清IgE水平及肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞水平的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清IgE及肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞比例升高（P<0.05）。與模型組相比，針刺肺俞組、IL-27預(yù)防組、IL-27治療組血清IgE及肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞比例降低（P<0.05）;STAT1抑制劑組大鼠血清IgE及肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞比例升高（P<0.05）。IL-27預(yù)防組血清IgE及肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞比例低于針刺肺俞組（P<0.05）。與針刺肺俞組相比，針刺肺俞+STAT1抑制劑組血清IgE及肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞比例升高（P<0.05）。詳見表3。

2.5 ?針刺肺俞穴對大鼠脾臟Th1、Th2比例及Th1/Th2的影響

與正常組相比，模型組大鼠Th1比例、Th1/Th2比例降低（P<0.05），Th2比例升高（P<0.05）。與模型組相比，針刺肺俞組、IL-27預(yù)防組及IL-27治療組Th1比例、Th1/Th2升高（P<0.05），Th2比例降低（P<0.05）;STAT1抑制劑組Th1比例、Th1/Th2降低（P<0.05），Th2比例升高（P<0.05）。IL-27預(yù)防組Th1比例、Th1/Th2高于針刺肺俞（P<0.05），Th2比例低于針刺肺俞組（P<0.05）。與針刺肺俞組相比，針刺肺俞+STAT1抑制劑組Th1比例、Th1/Th2降低（P<0.05），Th2比例升高（P<0.05）。詳見表4。

2.6 ?針刺肺俞穴對大鼠肺組織IL-4、IFN-γ、p-STAT1陽性表達的影響

與正常組相比，模型組大鼠肺組織IFN-γ、p-STAT1陽性表達降低（P<0.05），IL-4陽性表達升高（P<0.05）。與模型組相比，針刺肺俞組、IL-27預(yù)防組及IL-27治療組肺組織IFN-γ、p-STAT1陽性表達升高（P<0.05），IL-4陽性表達降低（P<0.05）;STAT1抑制劑組大鼠肺組織IFN-γ、p-STAT1陽性表達降低（P<0.05），IL-4陽性表達升高（P<0.05）。IL-27預(yù)防組IFN-γ、p-STAT1陽性表達高于針刺肺俞組（P<0.05），IL-4陽性表達低于針刺肺俞組（P<0.05）。與針刺肺俞組相比，針刺肺俞+STAT1抑制劑組肺組織IFN-γ、p-STAT1陽性表達降低（P<0.05），IL-4陽性表達升高（P<0.05）。詳見圖2、表5。

2.7 ?針刺肺俞穴對大鼠肺組織IL-27/STAT1通路相關(guān)蛋白表達的影響

與正常組相比，模型組大鼠肺組織IL-27、p-STAT1/STAT1、IFN-γ、T-bet蛋白表達降低（P<0.05），GATA3、IL-4蛋白表達升高（P<0.05）。與模型組相比，針刺肺俞組、IL-27預(yù)防組及IL-27治療組肺組織IL-27、p-STAT1/STAT1、IFN-γ、T-bet蛋白表達升高（P<0.05），GATA3、IL-4蛋白表達降低（P<0.05）;STAT1抑制劑組大鼠肺組織IL-27、p-STAT1/STAT1、IFN-γ、T-bet蛋白表達降低（P<0.05），GATA3、IL-4蛋白表達升高（P<0.05）。IL-27預(yù)防組p-STAT1/STAT1、IFN-γ、T-bet蛋白表達高于針刺肺俞組（P<0.05），GATA3、IL-4蛋白表達低于針刺肺俞組（P<0.05）。與針刺肺俞組相比，針刺肺俞+STAT1抑制劑組肺組織IL-27、p-STAT1/STAT1、IFN-γ、T-bet蛋白表達降低（P<0.05），GATA3、IL-4蛋白表達升高（P<0.05）。詳見表6、圖3。

3 討論

目前，全球約3億人罹患哮喘，中國哮喘患者約3000萬人[13]。Th1/Th2細胞免疫失衡是哮喘氣道免疫炎癥反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵原因[14]。Th1抗炎及Th2促炎效應(yīng)既相互聯(lián)系又相互制約，而哮喘患者Th1抗炎效應(yīng)被抑制，Th2促炎效應(yīng)異常增強，導(dǎo)致Th1/Th2細胞免疫失衡，是引起哮喘患者發(fā)生速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和氣道炎癥反應(yīng)發(fā)生的重要原因[15]。IFN-γ由Th1免疫細胞分泌，可促進Th1細胞分化，IL-4由Th2免疫細胞分泌，即可誘導(dǎo)T細胞炎癥反應(yīng)的早期啟動，來增強黏附類、趨化類蛋白表達，來促進呼吸道內(nèi)炎性細胞聚集、活化，加重支氣管哮喘急性發(fā)作的次數(shù)和癥狀，又可維持Th2細胞增殖，抑制Th1細胞分化，誘發(fā)Th1/Th2平衡紊亂，IFN-γ、IL-4含量變化是評判哮喘病情的重要指標[15]。升高IFN-γ表達，降低IL-4分泌，促進Th1/Th2平衡是治療哮喘的重要思路[16]。本研究用卵蛋白血清[9]反復(fù)致敏后發(fā)現(xiàn)，大鼠氣道高反應(yīng)性升高，Th1細胞比例及其分泌的IFN-γ因子降低，Th2細胞比例及其分泌的IL-4因子升高，血清IgE水平及支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞數(shù)目升高，提示造模成功。病理學(xué)進一步觀察可見大鼠肺支氣管黏膜上皮水腫、脫落，毛細管充血擴張，支氣管黏液栓形成及肺泡腔擴大，炎性細胞浸潤明顯，進一步驗證了模型。

近年來，中醫(yī)治療哮喘的案例逐漸增多，具有方法多樣、安全性高等優(yōu)勢，針灸配合穴位治療被證實可改善肺臟功能、調(diào)暢氣機、改善哮喘氣道阻塞及咳喘癥狀[17]。肺俞穴是治療肺疾、哮喘的重要穴位。有大量臨床實踐證實，針刺肺俞穴改善哮喘患者咳嗽、咳痰、咽癢、氣息急促等臨床癥狀的總有效率達92.98%，且其改善哮喘癥狀的作用機制可能與調(diào)節(jié)免疫、恢復(fù)Th1/Th2平衡有關(guān)[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，針刺肺俞穴治療哮喘大鼠后，大鼠氣道高反應(yīng)性降低，肺組織炎癥浸潤及支氣管水腫、脫落等病理損傷顯著緩解，血清及支氣管肺泡灌洗液IFN-γ升高，IL-4分泌降低，Th1/Th2比例逐漸恢復(fù)平衡，提示針刺肺俞穴治療哮喘與糾正Th1/Th2免疫平衡有關(guān)，但具體分子機制有待進一步探究。

IL-27/STAT1通路被證實可促進Th1/Th2免疫平衡。IL-27可促進Th1型細胞免疫反應(yīng)，抑制Th2細胞應(yīng)答，刺激自然殺傷細胞產(chǎn)生IFN-y，來抑制Th2型細胞及因子IL-4的生成，糾正Th2型細胞免疫的漂移，維持Th1/Th2比例平衡[20]。另外，IL-27還可與Th細胞表面的IL-27受體結(jié)合，促使p-STAT1轉(zhuǎn)入細胞核，來結(jié)合及轉(zhuǎn)錄Th細胞特定的轉(zhuǎn)錄因子T-bet而促進Th1細胞分化并分泌IFN-γ，上調(diào)IL-12Rβ2表達間接抑制Th2細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA3表達，抑制Th2細胞分化和分泌IL-4[21]。Lu等[22]研究發(fā)現(xiàn)哮喘動物模型機體內(nèi)存在STAT1磷酸化障礙，可抑制IL-27表達，影響Th1/Th2平衡，證實IL-27/STAT1通路參與調(diào)控Th1/Th2免疫平衡及哮喘癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，哮喘大鼠肺組織中IL-27、p-STAT1及下游促Th1細胞分化相關(guān)因子T-bet表達減弱，促Th2細胞分化相關(guān)因子GATA3表達均明顯升高，給予IL-27預(yù)防及IL-27滴鼻治療后，大鼠氣道高反應(yīng)性降低，IL-27、p-STAT1及下游T-bet表達均增強，Th1/Th2趨于平衡，肺組織損傷明顯緩解，而阻斷IL-27/STAT1通路活性后，大鼠氣道高反應(yīng)性、肺組織損傷、Th1/Th2比例失衡等哮喘病理癥狀加重，提示增強IL-27/STAT1通路活性是改善哮喘Th1/Th2免疫平衡紊亂的潛在機制。為證實針刺肺俞穴通過調(diào)控IL-27/STAT1通路發(fā)揮作用，在針刺肺俞穴的同時抑制STAT1，發(fā)現(xiàn)大鼠IL-27/STAT1通路被抑制，Th1/Th2平衡被破壞，提示針刺肺俞穴通過IL-27/STAT1通路發(fā)揮作用。

綜上所述，針刺肺俞穴治療哮喘作用，可能與促進IL-27/STAT1通路活化、糾正Th1/Th2免疫平衡有關(guān)。這為闡明針刺肺俞穴治療哮喘的分子機制提供一定依據(jù)，也為中醫(yī)藥的開發(fā)及推廣做出一定貢獻。但中醫(yī)學(xué)治療哮喘的靶點較多，針刺肺俞穴治療哮喘的其他機制，還需進一步探究。

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