枸杞粉及其多糖對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠免疫及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

羅 青，祿 璐,*，閆亞美，米 佳，李曉鶯，曹有龍，曾曉雄*

（1.國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750002；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210018）

枸杞（L.）系茄科枸杞屬落葉灌木，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用資源，富含多糖、類(lèi)胡蘿卜素、酚胺類(lèi)物質(zhì)及多種微量元素，在抗氧化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、提高免疫力、預(yù)防神經(jīng)損傷等方面均有較好效果。目前研究表明，枸杞在調(diào)節(jié)腸道菌群方面也具有積極作用。枸杞子粉對(duì)雙歧桿菌和乳酸桿菌等益生菌株有促進(jìn)作用，且益生元效應(yīng)與枸杞多糖（L.polysaccharides，LBP）、多酚含量密切相關(guān)。LBP能夠促進(jìn)細(xì)胞因子上調(diào)，修護(hù)肝損傷，同時(shí)促進(jìn)小鼠與免疫相關(guān)的有益菌群相對(duì)豐度增加，從而調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群。

近年來(lái)，腸道菌群對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的重要貢獻(xiàn)已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。腸道菌群失衡與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，并通過(guò)刺激免疫反應(yīng)和保持上皮屏障來(lái)維持體內(nèi)平衡，因此，腸道菌群穩(wěn)態(tài)對(duì)免疫系統(tǒng)和腸道的發(fā)育和維持有重要作用。植物多糖可改善B和T巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的增殖功能，提高白細(xì)胞吞噬能力，抑制脾組織細(xì)胞凋亡，促進(jìn)脾組織白細(xì)胞介素（interleukin-1β，IL-1β）基因表達(dá)，從而增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能，同時(shí)促進(jìn)消化酶活性，調(diào)節(jié)腸道菌群組成、維護(hù)腸道微生態(tài)健康。但枸杞噴霧干燥粉作為普通食品單一食用或與LBP復(fù)配作為功能性食品對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用研究鮮有報(bào)道。

環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）作為目前世界范圍內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的抗腫瘤藥物及免疫抑制劑，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)破壞機(jī)體正常的免疫細(xì)胞，啟動(dòng)炎癥與抗炎反應(yīng)，同時(shí)常伴有胃腸道不良反應(yīng)。研究表明，CTX可以改變腸道菌群的組成，多糖則可調(diào)節(jié)被CTX影響的腸道菌群的組成，從而調(diào)節(jié)宿主免疫。

本研究以CTX致免疫低下的小鼠為模型，探尋枸杞粉（L.powder，LB）、LBP及其復(fù)配物對(duì)小鼠免疫力及腸道菌群穩(wěn)態(tài)的影響，為枸杞噴霧干燥粉、LBP及其復(fù)配物作為功能性食品等多用途的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為BALB/c雄性小鼠，4 周齡，體質(zhì)量（20.0f0.5）g，購(gòu)自南京青龍山動(dòng)物設(shè)施公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均符合南京動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的指導(dǎo)方針，小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)的動(dòng)物房?jī)?nèi)（溫度24～25℃、相對(duì)濕度70%～75%，照明方案為12 h/12 h光暗循環(huán)），由高壓滅菌處理的飲用水和飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。

LB由國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心自制（中國(guó)銀川），利用枸杞鮮果經(jīng)清洗、打漿、均質(zhì)、噴霧干燥獲得，經(jīng)檢測(cè)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.3%；LBP（食品級(jí)）購(gòu)自寧夏沃福百瑞枸杞產(chǎn)業(yè)股份有限公司，經(jīng)檢測(cè)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47.8%；根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)，LB與LBP復(fù)配按照2∶1（/）混合均勻，獲得復(fù)配物（LB＋LBP）。

鹽酸左旋咪唑（levamisole hydrochloride，LH）、CTX 上海瑞恩生物技術(shù)有限公司；血清中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）ELISA試劑盒、免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）ELISA試劑盒 深圳欣博盛科技有限公司；TIANamp Stool DNA提取試劑盒 北京天根生物科技有限公司；MiniBEST universal RNA提取試劑盒、PrimeScript RT master mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒 TaKaRa生物工程有限公司；其他分析純?cè)噭┵?gòu)自上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6890N氣相色譜儀、火焰離子化檢測(cè)器、HP-INNOWAX毛細(xì)管柱（30 mh0.25 mmh0.25 μm） 美國(guó)Agilent公司；QuantStudio 6熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠處理與分組

將60只小鼠隨機(jī)分為6 組（＝10），自由飲水飲食適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。除了正常對(duì)照（NC）組的10只小鼠不作處理，其他組小鼠在第8、9、10天腹腔內(nèi)注射80 mg/（kggd）的CTX，建立CTX誘導(dǎo)的免疫抑制模型，枸杞噴霧干燥粉組（LB）、LBP組、LB與LBP復(fù)配（LB＋LBP）組及LH組（作為陽(yáng)性對(duì)照）第11～20天按表1每日進(jìn)行灌胃處理。實(shí)驗(yàn)期間每日觀察干預(yù)后小鼠的神志、精神、食欲、活動(dòng)等體征，每2 d測(cè)定一次體質(zhì)量以及食物消耗量（即采食量），計(jì)算體質(zhì)量增長(zhǎng)比和采食量，并于第21天早上股動(dòng)脈采血，收集血樣后，用頸椎脫位法處死小鼠，血液經(jīng)3 000 r/min離心15 min（4 ℃）后收集血清于4 ℃冰箱存放。收集肝臟、盲腸內(nèi)容物、結(jié)腸和糞便在無(wú)菌離心管中，并在－80 ℃下保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)期間小鼠飼養(yǎng)采取自由攝食、飲水的原則，并保持自然光照和籠內(nèi)衛(wèi)生清潔。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及灌胃處理Table 1 Experimental grouping and intragastrical administration

1.3.2 體質(zhì)量增長(zhǎng)比的測(cè)定

體質(zhì)量增長(zhǎng)比通過(guò)式（1）計(jì)算。

式中：為上次體質(zhì)量/g；為本次所測(cè)體質(zhì)量/g。

1.3.3 臟器指數(shù)的測(cè)定

胸腺和脾臟采集后稱(chēng)質(zhì)量，按以下公式（2）～（3）計(jì)算小鼠脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)。

1.3.4 血清細(xì)胞因子質(zhì)量濃度測(cè)定

股動(dòng)脈采血，3 000 r/min離心15 min（4 ℃）制備血清，即獲得淋巴細(xì)胞懸液，每孔加7.5h10個(gè)/mL的淋巴細(xì)胞懸液1 mL和刺激原質(zhì)量濃度4 μg/mL刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）稀釋液1 mL，置于37 ℃、5% CO細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h，2 500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞上清液（血清）。按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用ELISA法測(cè)定小鼠血清IL-1β、TNF-α、IFN-γ及IgA質(zhì)量濃度。

1.3.5 結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)分析

將結(jié)腸用10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋。石蠟切片（厚度5 μm）用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。結(jié)腸組織經(jīng)脫水、包埋、切片及HE染色處理后，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理情況，并采集圖像。

1.3.6 結(jié)腸組織RNA提取及實(shí)時(shí)定量PCR分析

采用MiniBEST universal RNA提取試劑盒，從20 mg結(jié)腸樣本中提取總RNA，檢測(cè)RNA的濃度和純度。隨后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑將500 ng的RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（37 ℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15 min后，85 ℃反應(yīng)5 s使反轉(zhuǎn)錄酶失活），－80 ℃儲(chǔ)存。準(zhǔn)備10 μL的反應(yīng)體系（1 μL引物、4 μL的cDNA和5 μL的SYBR Green Fast Mix試劑），使用QuantStudio 6熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因作為內(nèi)參，目標(biāo)基因（、、、、、、、和）的相對(duì)表達(dá)量采用2計(jì)算。

1.3.7 盲腸內(nèi)容物和糞便中短鏈脂肪酸含量的測(cè)定

取50 mg盲腸內(nèi)容物或糞便與250 μL去離子水混合，以0.2 mol/L鹽酸配制濃度為25 mmol/L的2-乙基丁酸溶液作為內(nèi)標(biāo)，將150 μL的盲腸內(nèi)容物漿液與150 μL的內(nèi)標(biāo)溶液混合后，8 000 r/min離心5 min，取上清過(guò)膜備用。參照Ding Yu等方法，利用氣相色譜法測(cè)定短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）的含量。

1.3.8 腸道菌群分析

采用高通量測(cè)序技術(shù)分析LB及LBP對(duì)小鼠腸道菌群的影響。根據(jù)DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取小鼠糞便樣品的基因組DNA，所有DNA樣品干冰儲(chǔ)存并運(yùn)送到杭州聯(lián)川生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序工作。使用的引物擴(kuò)增引物序列為Primer F：341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）及Primer R：805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’），對(duì)16S rDNA（V3＋V4）可變區(qū)進(jìn)行PCR。根據(jù)雙端序列的重疊區(qū)，將R1、R2序列拼接成長(zhǎng)的標(biāo)簽序列，并使用cutadapter軟件去除小段序列以及引物序列。然后過(guò)濾低質(zhì)量序列，采用Vsearch（v2.3.4）軟件過(guò)濾嵌合體。使用DADA2算法進(jìn)行降噪后，得到特征表和特征序列，分析腸道菌群多樣性、多樣性及組成。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用IBM SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析（ANOVA）和鄧肯檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析，＜0.05表示差異顯著。在腸道菌群分析中，多樣性和多樣性通過(guò)抽平（將所有樣本的序列數(shù)抽取至最少序列樣本的序列數(shù)）的方式來(lái)進(jìn)行歸一化，物種注釋使用相對(duì)豐度來(lái)進(jìn)行歸一化處理，由R（v3.5.2）軟件包繪制圖形。物種注釋采用QIIME2ruNJINO的插件featureclassifier進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)為SILVA和NT-16S數(shù)據(jù)庫(kù)，以SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果為準(zhǔn)。采用Tukey HSD檢驗(yàn)計(jì)算兩組間相對(duì)豐度的差異（＜0.05）。利用PICRUSt軟件分析來(lái)解釋京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）代謝通路，采用STAMP（v2.1.3）軟件通過(guò)Welsh’s檢驗(yàn)（＜0.05）對(duì)差異KEGG代謝通路進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)小鼠體質(zhì)量和采食量的影響

如圖1所示，MC組小鼠在用CTX處理后，體質(zhì)量和日采食量均明顯下降，說(shuō)明造模成功。第9天后，MC組的小鼠體質(zhì)量和日采食量呈現(xiàn)逐漸恢復(fù)的趨勢(shì)，但增長(zhǎng)緩慢，而LB、LBP及LB＋LBP組，小鼠體質(zhì)量和采食量逐漸趨于NC組和LH組，說(shuō)明LB、LBP及復(fù)配物均可較好地恢復(fù)小鼠體質(zhì)量和采食量，LBP和LB＋LBP干預(yù)，比LB干預(yù)更能有效地恢復(fù)小鼠的體質(zhì)量。Xia Hui等研究表明服用LBP對(duì)健康成年男性的體質(zhì)量及體質(zhì)量指數(shù)并無(wú)顯著影響，但可顯著降低血清甘油三酯和高密度脂蛋白指數(shù)。因此，推測(cè)可能是通過(guò)LBP提高機(jī)體免疫力從而恢復(fù)采食量和體質(zhì)量。

圖1 LB、LBP和LB+LBP處理對(duì)小鼠體質(zhì)量（A）和日采食量（B）的影響Fig.1 Effects of LB, LBP and LB + LBP on body mass (A) and feed intake (B) of mice

2.2 不同處理對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

胸腺和脾臟是機(jī)體的主要免疫器官，其質(zhì)量的改變可以反映受試藥物對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激作用，因此，胸腺和脾臟指數(shù)被認(rèn)為是反映免疫功能的重要指標(biāo)。由圖2可知，與NC組相比，MC組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著下降（＜0.05），說(shuō)明CTX可以誘導(dǎo)小鼠免疫低下。與MC組比較，LB、LBP和LB＋LBP組的小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著升高（＜0.05），說(shuō)明LB、LBP和LB＋LBP混合干預(yù)均對(duì)CTX所致的小鼠脾臟、胸腺損傷有一定的改善作用。與LB干預(yù)相比，LBP和LB＋LBP混合干預(yù)能更有效地改善小鼠脾臟和胸腺損傷，且與NC組相比無(wú)顯著性差異（＞0.05）。其中LB＋LBP組對(duì)小鼠脾臟損傷的恢復(fù)效果比LBP組好，但對(duì)于胸腺指數(shù)，LB組和LB＋LBP組之間沒(méi)有顯著差異（＞0.05）。

圖2 LB、LBP和LBLBP處理對(duì)小鼠脾臟指數(shù)（A）和胸腺指數(shù)（B）的影響Fig.2 Effects of LB, LBP and LB + LBP on spleen index (A) and thymus index (B) of mice

2.3 不同處理對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子和IgA產(chǎn)生量的影響

細(xì)胞因子大多是一些小分子可溶性蛋白質(zhì)，通過(guò)刺激免疫細(xì)胞及某些非免疫細(xì)胞合成釋放，可以直接參與多種免疫功能。此外，研究表明巨噬細(xì)胞可通過(guò)各種受體與多糖或糖蛋白結(jié)合，從而分泌細(xì)胞因子如IL-1β和TNF-α以殺死腫瘤細(xì)胞。通常CTX的誘導(dǎo)可導(dǎo)致小鼠體內(nèi)白細(xì)胞比例失衡，增加中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞比例，減少淋巴細(xì)胞比例。如圖3所示，與NC組相比，MC組小鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ和免疫球蛋白IgA的質(zhì)量濃度顯著下降（＜0.05）；與MC組比較，LB、LBP、LB+LBP組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IgA質(zhì)量濃度均顯著上調(diào)（＜0.05），與Ding Yu等發(fā)現(xiàn)利用LBP可促進(jìn)免疫低下小鼠細(xì)胞因子分泌的結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LB、LBP及LB＋LBP均可促進(jìn)CTX致免疫抑制型小鼠分泌細(xì)胞因子，從而增強(qiáng)小鼠非特異性免疫應(yīng)答。還有學(xué)者通過(guò)將枸杞與脫脂乳均質(zhì)添加在小鼠的日常飲食中來(lái)促進(jìn)小鼠T細(xì)胞增殖，從而提高小鼠免疫應(yīng)答，降低流感感染率。

圖3 LB、LBP和LBLBP處理對(duì)血清中細(xì)胞因子TNF-α（A）、IFN-γ（B）、IL-1β（C）和IgA（D）質(zhì)量濃度的影響Fig.3 Effects of LB, LBP and LB + LBP on serum levels of TNF-α(A),IFN-γ (B), IL-1β (C) and IgA (D)

2.4 不同處理對(duì)小鼠結(jié)腸組織的影響

光學(xué)顯微鏡下小鼠結(jié)腸組織形態(tài)如圖4所示。NC組小鼠結(jié)腸組織具有完整的結(jié)腸黏膜、隱窩、皺褶，且結(jié)構(gòu)整齊，排列緊密。而MC組結(jié)腸黏膜損傷較嚴(yán)重，伴有隱窩增生、上皮細(xì)胞損傷和基底淋巴聚集現(xiàn)象。而通過(guò)LB、LBP、LB＋LBP和LH的干預(yù)，結(jié)腸組織形態(tài)恢復(fù)較好，幾乎接近NC組，且LBP和LB＋LBP組杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯增加，杯狀細(xì)胞可促進(jìn)分泌黏蛋白，形成黏膜屏障。因此，LB、LBP和LB＋LBP干預(yù)可明顯改善CTX誘導(dǎo)的結(jié)腸組織損傷，進(jìn)而改善腸道屏障功能。

圖4 LB、LBP和LBLBP處理組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察（×20）Fig.4 Histopathological observation of colon sections of mice treated with LB, LBP and LB + LBP (× 20)

2.5 不同處理對(duì)小鼠結(jié)腸相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖5所示，與NC組相比，CTX可顯著降低結(jié)腸中、、、、、、和的表達(dá)水平（＜0.05）。與MC組相比，LB干預(yù)顯著提高了結(jié)腸中細(xì)胞因子的表達(dá)量（＜0.05），LBP干預(yù)顯著提高了、及SCFAs受體的表達(dá)量（＜0.05）；LB＋LBP干預(yù)顯著提高了、、和的表達(dá)量；LH干預(yù)顯著提高了、、、、的表達(dá)量。緊密連接蛋白和表達(dá)水平的降低與屏障功能障礙和腸上皮細(xì)胞旁通透性的增加密切相關(guān)，對(duì)維持腸道屏障功能具有重要作用。MUC2是一種黏蛋白，由結(jié)腸杯狀細(xì)胞產(chǎn)生，在細(xì)菌攻擊時(shí)可保護(hù)宿主組織免于暴露。以上結(jié)果表明，LBP作為枸杞中的重要的活性成分比LB更有效提高結(jié)腸中上述基因的表達(dá)，且LB＋LBP混合干預(yù)對(duì)、、和的提高作用優(yōu)于單獨(dú)LBP干預(yù)，推測(cè)LB和LBP在提高結(jié)腸相關(guān)基因表達(dá)方面可能存在協(xié)同效應(yīng)。

圖5 LB、LBP和LBLBP處理對(duì)小鼠結(jié)腸中基因ZO-1（A）、Occludin（B）、Claudin-1（C）、MUC2（D）、GPR41（E）、GPR43（F）、TNF-α（G）、IFN-γ（H）和IL-6（I）相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of LB, LBP and LB + LBP on relative expression levels of ZO-1 (A), Occludin (B), Claudin-1 (C), MUC2 (D), GPR41 (E), GPR43 (F),TNF-α (G), IFN-γ (H) and IL-6 (I) in the colon of mice

2.6 不同處理對(duì)小鼠盲腸內(nèi)容物和糞便中SCFAs的影響

SCFAs是腸道菌群的主要代謝產(chǎn)物，在維持腸道正常功能和結(jié)腸上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能方面發(fā)揮著重要的作用。如表2所示，與NC組相比，MC組的盲腸內(nèi)容物和糞便中SCFAs的含量均明顯下降。與MC組相比，LB、LBP、LB＋LBP和LH干預(yù)后，小鼠盲腸內(nèi)容物和糞便中SCFAs含量得到了不同程度的提高。與MC組相比，LB干預(yù)整體上顯著提高了盲腸內(nèi)容物和糞便中各SCFAs和總SCFAs含量（＜0.05）；LBP干預(yù)顯著提高了盲腸內(nèi)容物中丙酸、正丁酸、正戊酸和異戊酸的含量以及糞便中乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、異戊酸和總SCFAs的含量（＜0.05）；LB＋LBP干預(yù)顯著提高了盲腸內(nèi)容物中丙酸、正丁酸、正戊酸和異戊酸的含量以及糞便中丙酸、正戊酸、異戊酸和總SCFAs的含量（＜0.05），因此，LB對(duì)促進(jìn)小鼠腸道菌群代謝具有顯著的積極作用。研究表明，SCFAs可以在各種細(xì)胞途徑中充當(dāng)信號(hào)分子，乙酸、丙酸和丁酸與SCFAs受體GPR41、GPR43和GPR109A密切相關(guān)，GPR41和GPR43可激活上皮細(xì)胞的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2和p38促分裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路，促進(jìn)趨化因子和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，LB、LBP、LB＋LBP可能通過(guò)激活免疫相關(guān)途徑從而促進(jìn)腸道菌群產(chǎn)生SCFAs。

表2 小鼠盲腸和糞便中SCFAs含量Table 2 Effects of LB, LBP and LB + LBP on contents of SCFAs in cecum and feces of mice

2.7 不同處理對(duì)CTX誘導(dǎo)小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用

2.7.1 腸道菌群多樣性分析

多樣性指數(shù)可評(píng)估腸道菌群的豐富性和多樣性。如圖6A～C所示，與NC組相比，MC組中Chao1指數(shù)顯著降低（＜0.05），而與MC組相比，除了LB組的Simpson指數(shù)不存在顯著差異外，LB、LBP組和LB＋LBP組的Chao1、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均顯著升高（＜0.05），說(shuō)明LB、LBP和LB＋LBP處理均可提高腸道菌群多樣性。多樣性可度量不同樣本間菌群組成的相似度。如圖6D、E所示，MC組腸道菌群組成與其他各組存在明顯差異，說(shuō)明CTX誘導(dǎo)免疫抑制小鼠，其腸道菌群組成發(fā)生了明顯變化，NC、LB、LBP、LB＋LBP和LH組樣本間的距離相近，表明通過(guò)LB、LBP和LB＋LBP干預(yù)可促進(jìn)免疫抑制小鼠腸道菌群恢復(fù)正常。

圖6 小鼠腸道菌群α多樣性和β多樣性分析Fig.6 Alpha-diversity index and β-diversity index analysis of gut microbiota

2.7.2 小鼠腸道菌群組成分析

如圖7所示，所有組的小鼠腸道菌群主要由擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）組成，占菌落總數(shù)的90%以上，其次是-變形菌門(mén)（Epsilonbacteraeota）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）。與MC組相比，LB、LBP和LB＋LBP干預(yù)能夠顯著增加Bacteroidetes相對(duì)豐度（＜0.05），同時(shí)顯著減少Firmicutes、Epsilonbacteraeota和Proteobacteria的相對(duì)豐度（＜0.05），與Ding Yu、聶啟興、Tian Baoming、Huang Kaiyin等的研究結(jié)果一致，表明LB、LBP、LB＋LBP干預(yù)可顯著降低Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）比例。LBP可能是降低F/B比例的主要功效成分。

圖7 小鼠腸道菌群門(mén)水平上的相對(duì)豐度分布和主要門(mén)的相對(duì)豐度Fig.7 Relative abundance of gut microbiota at phylum level and relative abundance of major phyla

在科水平上，檢測(cè)出小鼠的腸道菌群主要由12個(gè)菌科組成，如圖8A所示，其中Muribaculaceae的相對(duì)豐度最高。與NC組相比，MC組小鼠腸道菌群中Muribaculaceae和Prevotellaceae的相對(duì)豐度顯著降低（＜0.05），Lachnospiraceae、Helicobacteraceae、Ruminococcaceae、Clostridiales_unclaasified、Desulfovibrionaceae、Deferribacteraceae的相對(duì)豐度顯著增加（＜0.05）。與MC組相比，LB、LBP、LB＋LBP及LH干預(yù)后可顯著增加Muribaculaceae的相對(duì)豐度（＜0.05），略增加Prevotellaceae的相對(duì)豐度，同時(shí)顯著抑制Lachnospiraceae、Helicobacteraceae、Ruminococcaceae、Clostridiales_unclaasified（除LBP組）、Desulfovibrionaceae、Deferribacteraceae相對(duì)豐度（＜0.05）（圖8B～I(xiàn)）。目前研究認(rèn)為，Prevotellaceae是腸道內(nèi)促SCFAs產(chǎn)生的菌屬，也是腸道微生物水解膳食纖維的關(guān)鍵成員，其相對(duì)豐度與TGF-β3有關(guān)，而TGF-β3是一種能調(diào)節(jié)腸道屏障功能的細(xì)胞因子，對(duì)于腸道菌群的健康恢復(fù)具有重要作用。Desulfovibrionaceae可產(chǎn)生細(xì)胞毒性化合物硫化氫，破壞腸上皮細(xì)胞并誘導(dǎo)黏膜啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。Huang Kaiyin等采用CTX誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎模型致使小鼠結(jié)腸內(nèi)Muribaculaceae、Saccharimonadaceae、Peptococcaceae相對(duì)豐度下調(diào)，而Rikenellaceae、Lactobacillaceae、Helicobacteraceae、Bacteroidaceae、Marinifilaceae、Deferribacteraceae、Tannerellaceae、Enterobacteriaceae、Streptococcaceae的相對(duì)豐度均上調(diào)；Ding Yu等通過(guò)LBP的干預(yù)也可顯著提高CTX誘導(dǎo)的小鼠腸道中Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Deferribacteraceae、Desulfovibrionaceae、Anaeroplasmataceae的相對(duì)豐度，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。

圖8 科水平上腸道微生物相對(duì)豐度與主要科水平的比較分析Fig.8 Relative abundance of gut microbiota at family level and comparative analysis of relative abundance of major families

如圖9所示，在由CTX誘導(dǎo)改變小鼠腸道菌群組成中，可被LB、LBP、LB＋LBP調(diào)節(jié)的菌屬包括11種_unclassified、7種、2種、1種、1種、2種_unclassified，其中18種菌屬相對(duì)豐度增加（_unclassified、），6種菌屬相對(duì)豐度減少（、、、_unclassified）。本實(shí)驗(yàn)從小鼠糞便中檢測(cè)出眾多可被LB、LBP、LB＋LBP調(diào)節(jié)的Muribaculaceae細(xì)菌群，研究表明，Muribaculaceae屬于擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes），在小鼠腸道菌群中占主導(dǎo)地位，由于它們的培養(yǎng)時(shí)間較晚，家族分類(lèi)還不明確，其相對(duì)豐度與丙酸含量有很強(qiáng)的相關(guān)性，是Spalax鼠長(zhǎng)壽相關(guān)的主要細(xì)菌類(lèi)群。此外，相較于LBP干預(yù)，LB、LB＋LBP干預(yù)能夠降低產(chǎn)毒素Clostridiales相對(duì)豐度，增加有益菌的相對(duì)豐度，LB＋LBP干預(yù)則可降低厭氧菌的相對(duì)豐度。Clostridiales的分布、表達(dá)與腹瀉型胃腸疾病患者的腸道菌組成、SCFAs水平密切相關(guān)，是腸易激綜合征潛在的生物標(biāo)志物。、在正常小鼠體內(nèi)碳水化合物代謝的表達(dá)較高，在高膳食膽固醇導(dǎo)致小鼠脂肪變性、脂肪性肝炎、肝纖維化的實(shí)驗(yàn)中，腸道、和在不同階段明顯聚集，且相對(duì)豐度依次增加。因此，LB、LB＋LBP還調(diào)節(jié)了與糖脂代謝相關(guān)菌群的相對(duì)豐度。

圖9 小鼠腸道菌群組成Fig.9 Composition of gut microbiota

采用PICRUSt軟件進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析，與NC組相比，MC組小鼠由于CTX誘導(dǎo)共有29 條通路（22 條富集，7 條缺失）發(fā)生改變。CTX處理導(dǎo)致富集的通路經(jīng)過(guò)LB、LBP、LB＋LBP干預(yù)后明顯減少，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、環(huán)境適應(yīng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄、異種生物降解和代謝等，CTX處理導(dǎo)致缺失的通路經(jīng)過(guò)LB、LBP、LB＋LBP干預(yù)后富集，如免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、能量代謝、氨基酸代謝等，此外，碳水化合物代謝和脂代謝也都富集。因此，通過(guò)LB、LBP、LB＋LBP干預(yù)不僅逆轉(zhuǎn)了由CTX處理改變的腸道菌群代謝功能異常，并使其趨于NC組，還調(diào)節(jié)了碳水化合物代謝和脂代謝，表明LB、LBP及LB＋LBP在調(diào)節(jié)糖脂代謝菌群具有潛在功效。

3 結(jié) 論

LB、LBP及其復(fù)配物（LB＋LBP）均可不同程度地恢復(fù)免疫抑制小鼠的體質(zhì)量和采食量，改善小鼠的脾臟和胸腺損傷，有效促進(jìn)免疫抑制小鼠細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IgA的分泌，調(diào)節(jié)結(jié)腸中免疫相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)SCFAs的產(chǎn)生，顯著調(diào)節(jié)_unclassified、、、、、等菌的相對(duì)豐度（＜0.05），逆轉(zhuǎn)腸道菌群代謝功能異常，并使其趨于正常。但相較于LBP，LB、LB＋LBP還可降低產(chǎn)毒素Clostridiales相對(duì)豐度，增加有益菌的相對(duì)豐度，LB＋LBP還可降低厭氧菌的相對(duì)豐度，是潛在益生元的良好來(lái)源。本研究結(jié)果將為開(kāi)拓多元化枸杞產(chǎn)品及研發(fā)功效針對(duì)性的枸杞健康產(chǎn)品和提供理論依據(jù)。