川青牛膽離體繁殖技術(shù)優(yōu)化研究

胡瑩瑩 唐 莉 羅 新 劉 帆 黃雪麗* 吳建國 朱福勇

（1雅安三九中藥材科技產(chǎn)業(yè)化有限公司，四川雅安 625099；2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川成都 611130）

青牛膽（Tinospora sagittata （Oliv.） Gagnep.）為防己科青牛膽屬多年生草質(zhì)藤本，又稱金果欖[1]，含金果欖苷、非洲防己堿、古倫賓等多種有效成分，以干燥塊根入藥[2-3]，具有治療咽喉腫痛、泄瀉痢疾、抗炎鎮(zhèn)痛[4-5]等功效，主產(chǎn)地為四川、湖南和廣西等[6]。全球范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的青牛膽屬植物有30多種，我國境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的有11種，其中6種具有藥用價值[7]。隨著醫(yī)藥業(yè)的發(fā)展，我國對青牛膽的需求迅速增加，導(dǎo)致人們?yōu)E采濫挖。20世紀(jì)末青牛膽曾一度瀕臨滅絕[8]。野生青牛膽主要生長在陰暗潮濕處[9]，且雌雄異株，自然環(huán)境下雄株數(shù)量遠(yuǎn)大于雌株，自然結(jié)實率低，加速了野生資源的減少。人工栽培是緩解青牛膽供需矛盾、拯救青牛膽野生自然資源的有效措施，而種苗則是人工栽培所面臨的首要問題，目前對青牛膽的研究主要集中于化學(xué)成分、藥理以及資源調(diào)查等方面，種苗繁育方面鮮有報道。

青牛膽組織培養(yǎng)可實現(xiàn)周年化生產(chǎn)，具有增殖系數(shù)較高、占用空間少、管理方便、培養(yǎng)條件可控性強、有效保存優(yōu)良性狀等優(yōu)點。當(dāng)前，僅有廣西青牛膽的離體快繁技術(shù)[10-12]有一定研究，四川青牛膽離體快繁未見報道。本研究利用四川地方優(yōu)質(zhì)青牛膽幼嫩枝條為外植體，優(yōu)化了快速繁殖培養(yǎng)基配方，對青牛膽離體繁殖技術(shù)體系進(jìn)行補充和優(yōu)化，可為青牛膽人工栽培提供大量優(yōu)質(zhì)種苗，以期為實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支撐，為建立優(yōu)質(zhì)、高效種苗規(guī)范化生產(chǎn)和新品系選育提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

四川雅安三九藥業(yè)有限公司提供的優(yōu)質(zhì)青牛膽幼嫩莖段。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用3因素3水平正交試驗設(shè)計，A是6-BA（6 芐基腺嘌呤）濃度，設(shè)置梯度為 1、2、4 mg/L；B 是NAA（萘乙酸）濃度，設(shè)置梯度為 0.1、0.2、0.4 mg/L；C 是 2，4-D（2，4-二氯苯酚）濃度，設(shè)置梯度為 0、0.1、0.2 mg/L（表1）。

表1 幼嫩莖段誘導(dǎo)因素水平 單位：（mg·L-1）

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗材料處理。選取新鮮健康的青牛膽幼嫩莖段，剪切為3～4 cm莖段，自來水沖洗30 min，在無菌條件下用75%乙醇浸泡20～30 s，再用0.1%氯化汞處理10 min，無菌水沖洗4次，備用。

1.3.2 啟動培養(yǎng)。向MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中附加不同濃度配比的植物生長調(diào)節(jié)劑（表1），附加30 g/L蔗糖和5.5 g/L瓊脂。將幼嫩莖段（1.5～2.0 cm）接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種6個外植體，每個處理接種5瓶，3次重復(fù)。接種后黑暗培養(yǎng)14 d，再移至光照強度2 000 lx、光照時數(shù) 12 h/d、溫度（23±2）℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。40 d后記錄不同培養(yǎng)基配方下幼嫩莖段誘導(dǎo)率及不定芽生長情況，并篩選出最佳幼嫩莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.3.3 增殖培養(yǎng)。將啟動培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出的不定芽剪切成1～2 cm莖段，轉(zhuǎn)接至表2增殖培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中附加30 g/L蔗糖和5.5 g/L瓊脂，每瓶6個外植體，每個處理接種5瓶，3次重復(fù)。在光照強度2 000 lx、光照時數(shù) 12 h/d、溫度（23±2）℃條件下培養(yǎng)，40 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)及其長勢。

表2 增殖培養(yǎng)植物生長調(diào)節(jié)劑配比單位：（mg·L-1）

1.3.4 生根培養(yǎng)。采用單因素設(shè)計，在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加不同濃度的NAA和IBA（表3）。將組培苗剪切至1～2 cm，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，每瓶接6株，每個處理5瓶，3次重復(fù)。接種后在光照強度2000lx、光照時數(shù) 12 h/d、溫度（23±2）℃條件下培養(yǎng)。 40 d后記錄生根率和新生根生長情況，篩選出最佳生根培養(yǎng)基。

1.3.5 煉苗移栽。生根苗煉苗后移栽，移栽15 d后統(tǒng)計成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對不定芽誘導(dǎo)的影響

由表4可知，除9號處理外，其他8個處理均可成功誘導(dǎo)出不定芽。從誘導(dǎo)率看，1號處理腋不定芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)90.0%；其次為4號、2號和3號培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率分別為86.7%、83.3%和80.0%。從分株數(shù)量分析，1號處理和4號處理分株數(shù)量最高，分別為4.1株和3.6株，遠(yuǎn)高于其他處理組合。從不定芽生長狀況分析，1號、2號、3號、4號處理，經(jīng)過15 d培養(yǎng)，基部葉子變黃，基部膨脹變大，隨著培養(yǎng)時間的延長，誘導(dǎo)不定芽的葉色綠，芽健壯，頂端有綠色葉子萌動跡象。但是，生長速率有所差異，其中，1號和4號處理生長速率均較快，芽的長度最長。5號和6號培養(yǎng)基誘導(dǎo)率分別為76.7%和43.3%，誘導(dǎo)芽較纖細(xì)，葉片均未舒展。7號、8號、9號培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果最差，誘導(dǎo)愈傷組織，且愈傷組織疏松，呈淺黃色，僅有少量的芽點，隨著培養(yǎng)時間的延長，基部變黑變大，基部附近培養(yǎng)基出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，原有的頂芽黃化，莖部萎縮，生長跡象逐漸消失，逐漸褐變死亡。綜上所述，最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1號培養(yǎng)基，即MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。

表4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對莖段的誘導(dǎo)情況

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對不定芽增殖的影響

將啟動培養(yǎng)獲得的健康幼苗轉(zhuǎn)接至表2培養(yǎng)基中，結(jié)果表明，1號增殖培養(yǎng)基的幼苗長勢緩慢，未形成叢生芽，2號、3號、4號增殖培養(yǎng)基均可產(chǎn)生叢生芽，分別為4.5、4.2、4.8株，但從叢生芽生長狀態(tài)來看，2號增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)叢生芽莖部相對較粗，植株長勢良好，生命力旺盛，葉色濃綠，且生長較快，13 d左右即可長出新芽。4號增殖培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽較纖細(xì)，培養(yǎng)后期逐漸變黃，不利于后期生根。由此可見，在本試驗范圍內(nèi)，0.5 mg/L 6-BA與0.05 mg/L NAA的組合對青牛膽叢生芽生長、增殖效果最佳，誘導(dǎo)出的叢生芽生長最快。因此，最佳增殖培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA。

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對青牛膽生根的影響

由表5可知，5種培養(yǎng)基均成功誘導(dǎo)出不定根，其中3號、4號、5號培養(yǎng)基生根誘導(dǎo)率相當(dāng)，均在95%以上，以5號培養(yǎng)基生根率最高，達(dá)97.5%，且根系萌動時間最早，第5天開始露白，植株葉色濃綠，健壯。2號培養(yǎng)基根系12 d后開始萌動，根系生長緩慢。1號空白培養(yǎng)基誘導(dǎo)率最低，僅為49.5%，且根系萌動時間最長，培養(yǎng)15 d后根系開始有萌動跡象。由此表明，NAA和IBA不同配比均能誘導(dǎo)根的生長，最佳生根培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L IBA。

表5 不同濃度生根劑對不定根誘導(dǎo)情況的影響

2.4 煉苗移栽情況

生根培養(yǎng)30 d后，當(dāng)80%組培苗根長至7～8 cm時，擰松瓶蓋，2 d后將瓶蓋全部打開，3 d后放置于全天自然光照、溫度25℃的通風(fēng)條件下煉苗。7 d后將苗取出，洗凈附著在根上的培養(yǎng)基，并移栽到營養(yǎng)土∶珍珠巖=3∶1（體積比）的苗床上。移栽后的前5 d用透明塑料棚保溫保濕，保持空氣濕度在85%以上，每天噴灌1次，5 d后慢慢通風(fēng)，接受自然光照，移栽15 d后成活率高達(dá)100%。

3 結(jié)論與討論

植物細(xì)胞在理論上都存在全能性，任何植物的器官或組織都能作為組織培養(yǎng)的外植體[13]。本試驗采用青牛膽幼嫩莖節(jié)誘導(dǎo)繁殖，能快速繁殖并獲得大量植株，是一種非常有效的繁殖途徑。本試驗在潘麗梅等[10]的基礎(chǔ)上降低了2，4-D濃度，并將KT換成NAA，誘導(dǎo)得到的不定芽并無玻璃化問題，且長勢好，速度快。莖段可以為再生苗提供營養(yǎng)，促進(jìn)壯苗，每叢不定芽能夠再分化出叢生苗，大大降低了青牛膽育苗成本，更符合離體微繁的目的。在生根培養(yǎng)時，IBA和NAA可誘導(dǎo)生根，相對而言，IBA誘導(dǎo)效果優(yōu)于NAA，這一結(jié)論與李小泉等[12]的研究結(jié)果相似。綜上，本試驗青牛膽最佳啟動誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，最佳增殖培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，最佳生根培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L IBA，煉苗移栽后成活率高達(dá)100%，該試驗體系為青牛膽規(guī)?；a(chǎn)實踐提供了一定的技術(shù)參考。