勵(lì)建榮, 檀茜倩, 王 丹, 崔方超, 呂欣然

(渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心, 遼寧 錦州 121013)

益生菌是在積累到一定數(shù)量的時(shí)候?qū)θ梭w健康產(chǎn)生有利影響的一類(lèi)活的微生物,具有提高免疫力、增強(qiáng)腸道菌群調(diào)節(jié)能力、治療代謝疾病和改善情緒等多種功能[1-4]。 益生菌種類(lèi)很多,其中的乳酸菌,包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、魏斯氏菌(Weissella)等[5]中的大部分,是公認(rèn)的一類(lèi)安全益生菌,其為革蘭氏陽(yáng)性、微需氧、不形成芽孢、接觸酶陰性；另一類(lèi)研究較多的益生菌為芽孢桿菌屬中的一部分細(xì)菌,其菌株特點(diǎn)為革蘭氏陽(yáng)性、需氧或厭氧、可形成孢子,孢子的形成使其能更好地耐受高溫、高滲透壓和酸性環(huán)境,相比于乳酸菌在應(yīng)用上更具優(yōu)勢(shì)[6]；此外還有布勞特氏菌屬(Blautia)的部分細(xì)菌,屬毛螺菌科,多分布于哺乳動(dòng)物的糞便和腸道,這個(gè)菌屬的一些菌曾經(jīng)一度被劃分到梭菌屬和瘤胃球菌屬中,其生長(zhǎng)特性為嚴(yán)格厭氧,不具有運(yùn)動(dòng)性,成對(duì)或者成鏈狀出現(xiàn),大部分菌株不形成孢子但對(duì)環(huán)境(酸、鹽和氧化反應(yīng))具有較強(qiáng)的耐受性[7]；一些與腸道共生的真菌比如鮑氏酵母菌也被認(rèn)為具有益生功效[8]。 食源性致病微生物在食品中的存在不僅會(huì)加速食品腐敗也會(huì)引發(fā)食用安全風(fēng)險(xiǎn)。 目前研究發(fā)現(xiàn),很多益生菌及從其發(fā)酵液中分離的代謝物都具有抑制食源性致病微生物的作用,具有在食品安全和品質(zhì)控制方面應(yīng)用的潛力；并且由于其兼具益生特性,相對(duì)于其他食源性致病微生物的控制技術(shù)更具優(yōu)勢(shì),有很好的開(kāi)發(fā)前景[9-11]。 本研究擬分析現(xiàn)有益生菌及其代謝物對(duì)食源性致病微生物的抑制機(jī)制,基于目前益生菌及其代謝物在食品安全和品質(zhì)控制中的應(yīng)用研究實(shí)例,闡述其在果蔬、肉類(lèi)等食品中的應(yīng)用方式、應(yīng)用條件、對(duì)貨架期的延長(zhǎng)效果,并對(duì)其應(yīng)用研究趨勢(shì)進(jìn)行探討。希望為基于益生菌及其代謝物的食品安全和品質(zhì)控制技術(shù)開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供有益的借鑒和參考。

1 抑制食源性致病微生物的益生菌及其代謝物類(lèi)型

益生菌及其產(chǎn)生的代謝物種類(lèi)繁多,研究發(fā)現(xiàn),很多益生菌及其代謝物具有抑制包括細(xì)菌、真菌、病毒在內(nèi)的多種食源性致病微生物的功能。 益生菌對(duì)食源性致病微生物的抑制效果不僅取決于其種類(lèi)、培養(yǎng)條件、分泌的代謝物種類(lèi),也與食源性致病微生物本身的特性(種類(lèi)、耐藥性、生物被膜形成能力、毒力因子產(chǎn)生能力)有關(guān)[12-13]。 表1 列出了部分對(duì)食源性致病微生物有抑制作用的益生菌及其代謝物類(lèi)型。 益生菌的生長(zhǎng)和代謝受到自身特性和多種環(huán)境因素的影響,不同來(lái)源的同種益生菌的抑菌譜也有差別。 益生菌的代謝產(chǎn)物成分復(fù)雜,對(duì)食源性致病微生物起到抑制作用的活性物質(zhì)主要有肽類(lèi),如抗細(xì)菌肽和抗真菌肽,包括乳酸鏈球菌素(Nisin)、乳酸片球菌素(pediocin)、枯草菌素(subtilin)等；有機(jī)酸類(lèi),如乳酸、丙酸、醋酸、苯乳酸、吲哚乙酸等；此外還有過(guò)氧化氫、醇類(lèi)、酚類(lèi)、酶類(lèi)和多糖類(lèi)等多種物質(zhì)。 可通過(guò)微生物的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)合分子生物學(xué)(基因檢測(cè)或基因組分析)以及儀器分析[氣相色譜-質(zhì)譜或高效液相色譜-質(zhì)譜(GC-MS 或HPLCMS)]等手段對(duì)這些活性物質(zhì)進(jìn)行探定和分離。

表1 抑制食源性致病微生物的益生菌及其代謝物Tab.1 Inactivation effect of probiotics and their metabolites against foodborne pathogens

目前大量具有抑制食源性致病微生物的益生菌資源尚待挖掘,因?yàn)榇蟛糠謥?lái)源的樣品菌群成分復(fù)雜[29]。 隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,常利用擴(kuò)增子技術(shù)或宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)樣品中的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,在確定其中具有益生潛力的菌株類(lèi)型后可針對(duì)性采用合適的培養(yǎng)基對(duì)益生菌進(jìn)行分離[30-31]；同時(shí),培養(yǎng)組學(xué)的發(fā)展也加速了益生菌株資源的挖掘和研究。 培養(yǎng)組學(xué)是將優(yōu)化的培養(yǎng)條件應(yīng)用于微生物群研究的一種技術(shù),將基質(zhì)輔助激光解吸/電離-時(shí)間飛行質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI -TOF MS)與16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)結(jié)合對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。 培養(yǎng)組學(xué)高通量的培養(yǎng)條件可獲得大量菌株,尤其適宜一些對(duì)生長(zhǎng)條件要求挑剔菌株的培養(yǎng),常應(yīng)用于新益生菌資源的挖掘中[32]。

2 益生菌及其代謝物對(duì)食源性致病微生物的抑制機(jī)制

2.1 對(duì)細(xì)菌的抑制機(jī)制

食源性致病菌常以?xún)煞N狀態(tài)存在,浮游態(tài)和生物被膜態(tài)。 細(xì)菌的生物被膜是細(xì)菌為了應(yīng)對(duì)極端環(huán)境所采取的保護(hù)行為。 生物被膜的形成始于黏附,是一個(gè)涉及菌群結(jié)構(gòu)、功能和組分之間變化的動(dòng)態(tài)過(guò)程。 細(xì)菌會(huì)被大量的胞外多糖骨架包裹,附著在食品或者加工設(shè)備的表面,使其清除變得更加困難[33]。 益生菌及其代謝物對(duì)細(xì)菌的抑制機(jī)制主要包括破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),干預(yù)細(xì)菌內(nèi)部DNA、RNA、蛋白、細(xì)胞壁和脂肪酸等生命活動(dòng)所需要的關(guān)鍵物質(zhì)合成,與細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)關(guān)鍵性的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),阻斷關(guān)鍵的能量代謝通路,干擾細(xì)菌群體行為和破壞生物被膜結(jié)構(gòu)等等。 這些機(jī)制與益生菌及其代謝物與食源性致病菌的類(lèi)型和特性有關(guān),常同時(shí)包含多種機(jī)制。 圖1 列舉了其中的部分機(jī)制。

圖1 益生菌及其代謝物對(duì)食源性致病菌的抑制機(jī)制Fig.1 Inactivation mechanism of probiotics and their metabolites against foodborne pathogens

2.1.1 對(duì)浮游狀態(tài)細(xì)菌的抑制機(jī)制

2.1.1.1 破壞細(xì)胞壁完整性

益生菌分泌的代謝物會(huì)作用于細(xì)胞壁,在細(xì)胞壁上形成孔洞,引起內(nèi)部物質(zhì)溶出,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 很多抗菌肽對(duì)細(xì)菌的抑制多采用這種機(jī)制,且其抑菌譜與抗菌肽結(jié)構(gòu)和食源性致病菌的類(lèi)型有關(guān)。 與細(xì)胞壁上的受體結(jié)合是抑制過(guò)程的第一步,結(jié)合位點(diǎn)包括脂質(zhì)Ⅱ和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的甘露糖滲透酶(mannose permease of the phosphotransferase system,man-PTS)等。 脂質(zhì)Ⅱ作為膜錨定的細(xì)胞壁合成前體,對(duì)細(xì)胞壁肽聚糖的生物合成至關(guān)重要。 Nisin 和很多羊毛硫類(lèi)細(xì)菌素都以脂質(zhì)Ⅱ作為其對(duì)接位點(diǎn)[34]。 脂質(zhì)Ⅱ不是pediocin 與細(xì)胞結(jié)合的靶標(biāo)位點(diǎn),pediocin 分子與目標(biāo)細(xì)菌接觸后,其分子上的正電荷會(huì)與細(xì)胞壁上的磷脂壁酸的負(fù)電荷結(jié)合,隨后pediocin 分子插入這些目標(biāo)細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)膜,形成孔洞[35]。 另一種由戊糖片球菌分泌的新型抗菌肽pentocin ZFM94 在細(xì)胞上形成孔洞同樣不以脂質(zhì)Ⅱ?yàn)槭荏w,其具體結(jié)合位點(diǎn)還未明確,但這種抗菌肽抑菌譜很寬,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌都具有抑制作用,探明其結(jié)合機(jī)制對(duì)其應(yīng)用有十分重要的作用[36]。 分離自植物乳桿菌SHY 21-2 的植物乳桿菌素LP 21-2 (分子質(zhì)量為1362.82 Da,少于20 個(gè)氨基酸)也同樣具有較寬抑菌譜,對(duì)包括金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、青霉等在內(nèi)的細(xì)菌、真菌均具有抑制作用,掃描電鏡和透射電鏡分析發(fā)現(xiàn)其可在細(xì)胞壁形成孔洞和褶皺以及破壞細(xì)胞膜和原生質(zhì)層的完整性,但具體結(jié)合位點(diǎn)和機(jī)制有待進(jìn)一步探究[37]。

2.1.1.2 破壞細(xì)胞膜的通透性和完整性

細(xì)菌的細(xì)胞膜是一種選擇透過(guò)性膜,通過(guò)與外界環(huán)境有選擇性地交換物質(zhì)為內(nèi)部提供利于各種關(guān)鍵生物化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的條件。 細(xì)胞膜有選擇性地允許保持細(xì)胞膜正常功能的K+、Na+、H+等離子通過(guò)。 研究發(fā)現(xiàn),動(dòng)物雙歧桿菌BB04 分泌的抗菌肽bifidocin A 會(huì)使大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性增加,造成細(xì)胞內(nèi)K+和無(wú)機(jī)磷大量滲出導(dǎo)致細(xì)胞死亡[38]。細(xì)胞膜正常的選擇通透性也對(duì)細(xì)胞維持正常酶活力和代謝平衡非常重要,細(xì)胞膜通透性的改變會(huì)造成鐵離子失衡,進(jìn)而影響到細(xì)菌能量代謝(轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝調(diào)控、調(diào)節(jié)細(xì)胞壓力和運(yùn)動(dòng))有關(guān)的各種功能,導(dǎo)致細(xì)菌死亡[39]。

細(xì)菌的細(xì)胞膜還是細(xì)菌應(yīng)對(duì)外界環(huán)境不利因素的屏障,細(xì)胞膜完整性的破壞會(huì)造成細(xì)菌死亡。 研究發(fā)現(xiàn),鼠李糖乳桿菌代謝分泌的新型細(xì)菌素1.0320(表面帶有負(fù)電荷、分子質(zhì)量在1 ～3.3 kDa)具有破壞大腸桿菌UB1005 細(xì)胞膜的完整性和通透性的功能[40]。 芽孢桿菌JS-4 產(chǎn)生的抗菌肽(分子質(zhì)量為3346.6 Da,分子序列與subtilin 類(lèi)似,但15位的丙氨酸和24 位的亮氨酸分別被纈氨酸和異亮氨酸替代)也通過(guò)破壞細(xì)胞膜的通透性和完整性,造成細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的失衡,進(jìn)而間接影響代謝、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等一系列的生物學(xué)過(guò)程來(lái)抑制食源性致病菌。 研究證實(shí)此抗菌肽有很好的熱和pH 穩(wěn)定性,但是容易被蛋白酶降解,其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可作為進(jìn)一步探明其機(jī)制的基礎(chǔ)[41]。

2.1.1.3 影響基因表達(dá)和阻斷代謝通路

基因決定蛋白表達(dá),對(duì)基因的破壞會(huì)阻斷細(xì)菌某些重要酶和受體的合成,最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。 益生菌的一些代謝物會(huì)破壞細(xì)菌的遺傳物質(zhì)。 研究發(fā)現(xiàn),苯乳酸可插入單增李斯特菌和大腸桿菌的基因組中,隨后影響DNA 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和表達(dá),最后阻礙細(xì)菌生長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)菌死亡,與溴化乙錠作用機(jī)制類(lèi)似[42]。 益生菌的另一些代謝產(chǎn)物還可以通過(guò)影響基因表達(dá)和細(xì)菌正常代謝通路來(lái)抑制細(xì)菌。 研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌素BM1157 可使大腸桿菌蛋白表達(dá)水平發(fā)生明顯改變,其原生質(zhì)組分和細(xì)胞膜組分顯著降低,周質(zhì)空間也相對(duì)減少,蛋白酶和蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物的表達(dá)水平上調(diào)；同時(shí)大腸桿菌與鐵的結(jié)合能力降低,鐵缺失進(jìn)而使其催化酶和水解酶活性降低,碳水化合物代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)受到顯著影響,導(dǎo)致生物活性分子合成時(shí)所需的物質(zhì)和能量供應(yīng)不足,氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和脂質(zhì)代謝等過(guò)程進(jìn)而受到阻斷,細(xì)胞分化受到影響,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[43]。

2.1.2 對(duì)生物被膜態(tài)細(xì)菌的抑制機(jī)制

益生菌及其代謝物可通過(guò)干擾細(xì)菌的群體感應(yīng)信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)生物被膜的控制,與殺死細(xì)菌的抑菌機(jī)制不同,這種機(jī)制以阻礙細(xì)菌的生長(zhǎng)為目的,不容易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。 群體感應(yīng)(quorum sensing, QS)是細(xì)菌之間依靠其所分泌的信號(hào)分子(autoinducer, AI)的濃度進(jìn)行交流的一種機(jī)制,與AI 的濃度呈現(xiàn)正向的相關(guān)性,能影響基因表達(dá)的調(diào)控,對(duì)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、抗生素的合成、生物被膜的形成、毒力因子的產(chǎn)生都具有非常重要的作用[44-45]。 不同細(xì)菌QS 系統(tǒng)產(chǎn)生的信號(hào)分子種類(lèi)不同,主要包括高絲氨酸內(nèi)酯類(lèi)(HSL)、寡肽(AIP)和AI -2 三大類(lèi)[46-47]。 群體感應(yīng)淬滅(quorum quenching, QQ)即通過(guò)干擾細(xì)菌QS 系統(tǒng)使其QS 現(xiàn)象消失,具有QQ 功能的物質(zhì)可以稱(chēng)為QS 抑制劑,其抑制機(jī)制主要包括分解信號(hào)分子以及干擾信號(hào)分子與受體結(jié)合等。 在益生菌的代謝物中發(fā)現(xiàn)多種天然的QS 抑制劑[48-49]。 研究發(fā)現(xiàn),乳酸片球菌產(chǎn)生的乳酸可以抑制銅綠假單胞菌的las 和rhl 兩種QS 系統(tǒng),影響了C4-HSL 等短鏈的HSL 的產(chǎn)生,進(jìn)而抑制銅綠假單胞菌的群集和泳動(dòng)行為,減弱其生物被膜以及其他毒力因子(彈性蛋白酶、綠膿菌素等)的形成能力[50]。 干酪乳桿菌CRL431 和乳酸片球菌CRL730發(fā)酵液的三氯甲烷提取物可抑制銅綠假單胞菌,顯著影響其生物被膜形成、生物量以及代謝活動(dòng),同時(shí)可抑制其毒力因子的產(chǎn)生[51]。 部分芽孢桿菌和乳酸菌可分泌群體感應(yīng)淬滅酶(QQ 酶),通過(guò)水解信號(hào)分子的內(nèi)酯環(huán),破壞信號(hào)分子酰基側(cè)鏈的酰胺鍵,還原信號(hào)分子阻止其被受體識(shí)別等機(jī)制,影響相應(yīng)食源性致病菌生物被膜的形成[52-54]。

另外益生菌及其代謝物還可以通過(guò)阻止致病菌黏附行為的發(fā)生,與致病菌競(jìng)爭(zhēng)和外排作用來(lái)達(dá)到清除和抑制食源性致病菌生物被膜的目的。 研究發(fā)現(xiàn),乳酸片球菌PA003 可抑制大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌在不銹鋼、聚氯乙烯和玻璃表面形成生物被膜,對(duì)已經(jīng)形成的生物被膜通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)和外排作用破壞生物被膜結(jié)構(gòu)達(dá)到清除生物被膜的目的[55]。 多株乳酸乳球菌也可通過(guò)抑制單增李斯特菌的黏附過(guò)程來(lái)抑制其生物被膜形成[56]。

2.2 對(duì)真菌的抑制機(jī)制

益生菌對(duì)真菌的抑制作用主要是通過(guò)其產(chǎn)生的抗真菌肽以及有機(jī)酸、羧酸等物質(zhì)進(jìn)行的,抑制機(jī)制與其對(duì)真菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞和與真菌互相競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。 研究發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌(Bacillus siamensisLZ88)代謝產(chǎn)物中的兩種肽類(lèi)物質(zhì)iturins 和macrolactin,以及揮發(fā)性的有機(jī)酸二甲基丁酸可使互隔交鏈孢霉菌絲發(fā)生明顯的形態(tài)改變,使菌絲形成孔洞,并發(fā)生不規(guī)則萎縮和減少其上附著的分生孢子數(shù)目,這些不帶分生孢子的菌絲隨之會(huì)發(fā)生斷裂、萎縮、瓦解和死亡[57]。 益生菌也會(huì)和真菌競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)因子,尤其當(dāng)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)素含量較低時(shí),益生菌會(huì)優(yōu)先利用營(yíng)養(yǎng)素,其結(jié)果就是環(huán)境中剩下的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足以保證真菌孢子萌發(fā),導(dǎo)致孢子的活性受到抑制。 雖然當(dāng)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)素濃度增高達(dá)到孢子萌發(fā)所需要營(yíng)養(yǎng)條件時(shí)其可以正常萌發(fā),但研究發(fā)現(xiàn)其萌發(fā)率要遠(yuǎn)低于未經(jīng)處理時(shí)的狀態(tài),說(shuō)明益生菌代謝物對(duì)真菌孢子結(jié)構(gòu)也造成一定程度的損傷[58]。 益生菌及其代謝物可清除和抑制真菌生物被膜,研究發(fā)現(xiàn)其可抑制多株白色念珠菌生物被膜的形成,其機(jī)制主要與阻止生物被膜的黏附以及同真菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)[59]。

2.3 對(duì)病毒的抑制機(jī)制

益生菌及其代謝物對(duì)病毒的抑制機(jī)制包括干擾病毒復(fù)制和阻止其與宿主細(xì)胞結(jié)合等,具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。 已發(fā)現(xiàn)乳酸菌的一些無(wú)細(xì)胞提取物尤其是乳酸可抑制病毒的復(fù)制[60]。 還有研究發(fā)現(xiàn),植物乳桿菌LBP-K10 分泌的一種環(huán)二肽可以抑制流感病毒(H3N2),其抑制機(jī)制與其豐富的手性結(jié)構(gòu)有關(guān),其中4 個(gè)可以改變立體化學(xué)和構(gòu)象結(jié)構(gòu)的位點(diǎn)被認(rèn)為在抗病毒中起到比較關(guān)鍵的作用,并可能通過(guò)與人蛋白酶或者病毒血球凝集素裂解蛋白互作阻止病毒感染宿主細(xì)胞[61]。

3 基于益生菌及其代謝物的食源性致病微生物控制技術(shù)的應(yīng)用

基于益生菌及其代謝物的食源性致病微生物控制技術(shù)是利用益生菌及其代謝物所具有的抑制食源性微生物功能特性,將其應(yīng)用于食品來(lái)達(dá)到對(duì)食品安全和品質(zhì)進(jìn)行控制的技術(shù)。 這種技術(shù)會(huì)以從益生菌發(fā)酵液中分離提取的某些純化或半純化產(chǎn)物(單一代謝物)、益生菌無(wú)細(xì)胞提取液(多種代謝物的復(fù)合物)、益生菌(活菌)的形式應(yīng)用到對(duì)食品的品質(zhì)控制中。 益生菌及其代謝物的類(lèi)型、應(yīng)用方式、應(yīng)用條件、食品基質(zhì)的類(lèi)型、食源性致病微生物的種類(lèi)都會(huì)對(duì)其技術(shù)應(yīng)用效果(食品安全性、貨架期的延長(zhǎng)和食品品質(zhì)保持)產(chǎn)生不同的影響。

3.1 在果蔬安全與品質(zhì)控制中的應(yīng)用

果蔬的水分和糖含量較高,容易受到機(jī)械損傷,在食源性致病微生物污染以及酶的作用下發(fā)生品質(zhì)劣變,同時(shí)因其食用方式多為生食,故存在引發(fā)食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。 基于益生菌及其代謝產(chǎn)物的食源性致病微生物控制技術(shù)目前已經(jīng)應(yīng)用于果蔬從采后保藏到加工等多個(gè)環(huán)節(jié),可以保證果實(shí)的鮮度和安全性。

益生菌及其代謝物可應(yīng)用于果蔬的保鮮保藏,研究發(fā)現(xiàn),pediocin 對(duì)萵苣、生菜、芹菜和菠菜等新鮮蔬菜具有很好的品質(zhì)控制效果,可有效降低新鮮蔬菜在貯藏期間產(chǎn)生單增李斯特菌的數(shù)目[62]。 番茄和酸面團(tuán)中分離的植物乳桿菌TR7 和植物乳桿菌TR71 發(fā)酵液可延長(zhǎng)番茄的鮮度和貯藏時(shí)間,這兩種益生菌無(wú)細(xì)胞提取液(活性成分為乳酸、乙酸、苯乳酸和吡嗪衍生物)可以很好地抑制擴(kuò)展青霉和黃曲霉的生長(zhǎng), 霉菌最小抑菌濃度在6.3 ～100.0 g/L,在貯藏期間能很好地控制番茄品質(zhì),避免其腐敗[63]。

益生菌及其代謝物可對(duì)鮮切水果中的食源性致病微生物進(jìn)行控制,保證消費(fèi)者食用的安全性和口感。 利用鼠李糖乳桿菌GG 直接噴涂到鮮切蘋(píng)果的表面,可在貯藏期間不同程度降低單增李斯特氏菌和沙門(mén)氏菌的菌落數(shù),雖未達(dá)到完全殺滅效果,但根據(jù)體外實(shí)驗(yàn),兩種食源性致病菌在模擬消化道內(nèi)的生存能力下降,說(shuō)明其對(duì)宿主致病力有所減弱；同時(shí)貯藏期間鮮切蘋(píng)果的顏色、可溶性固形物和硬度可得到很好保持[64]。 將鼠李糖乳桿菌GG 噴灑于鮮切梨表面,可在貯藏期間顯著控制單增李斯特氏菌的菌落數(shù)；鮮切梨果肉可溶性固形物和總酸含量在整個(gè)貯藏期基本保持穩(wěn)定；風(fēng)味物質(zhì)(酯類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、萜類(lèi)、酮類(lèi)、酸類(lèi))種類(lèi)多樣,醇類(lèi)和酯類(lèi)的特征物濃度隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而升高,比不處理以及采用氯化鈣處理更有效地保證了梨的特征風(fēng)味[65]；鮮切梨的硬度、外觀以及抗氧化性也比不采用任何處理和氯化鈣處理的效果好[66]。

益生菌及其代謝物也可以應(yīng)用于非發(fā)酵型果汁飲料品質(zhì)的控制。 鼠李糖乳桿菌GG 能控制低溫和常溫貯藏期間沙棘果汁飲料中大腸桿菌的生長(zhǎng)以及保證果汁品質(zhì),其控制效果與益生菌的適宜生長(zhǎng)溫度有關(guān)。 相對(duì)高的溫度下鼠李糖乳桿菌的代謝旺盛,可快速分泌有機(jī)酸和抗菌肽,因此會(huì)使大腸桿菌的數(shù)量在儲(chǔ)藏前期即發(fā)生非常明顯下降；而低溫貯藏條件下大腸桿菌數(shù)目則在貯藏中期開(kāi)始下降[67]。利用益生菌對(duì)非發(fā)酵果汁進(jìn)行品質(zhì)控制的過(guò)程中應(yīng)合理評(píng)估益生菌與致病菌的生長(zhǎng)互作和果汁風(fēng)味保持之間的關(guān)系。

3.2 在肉類(lèi)安全與品質(zhì)控制中的應(yīng)用

肉及肉類(lèi)制品的味道鮮美、品種和營(yíng)養(yǎng)豐富,在人們?nèi)粘Ｉ攀持姓急容^大,是獲取蛋白質(zhì)和脂肪等營(yíng)養(yǎng)素的主要來(lái)源。 肉類(lèi)容易被大腸桿菌、單增李斯特氏菌、沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌等致病微生物污染,在食用過(guò)程中殺菌不徹底以及致病菌產(chǎn)生的毒素會(huì)引起很大的食用安全隱患。 受到日式和地中海飲食方式的影響,消費(fèi)者對(duì)一些紅肉和水產(chǎn)品(三文魚(yú)、金槍魚(yú)、牡蠣)會(huì)傾向采用生食方式,根據(jù)益生菌及其代謝物的特點(diǎn),人們對(duì)其在肉類(lèi)安全與品質(zhì)控制方面也開(kāi)展了大量研究。

益生菌可以作為發(fā)酵劑保證發(fā)酵肉類(lèi)品質(zhì)。 采用植物乳桿菌和德氏乳桿菌作為發(fā)酵劑生產(chǎn)薩拉米香腸,可以使香腸中的梭狀芽胞桿菌的菌落數(shù)下降2 lg CFU/g 左右。 雖然薩拉米香腸在制作過(guò)程中的環(huán)境(較高的脂肪含量和熟化過(guò)程不斷增高的鹽濃度)對(duì)益生菌生長(zhǎng)不利,益生菌抑菌效果略低于化學(xué)防腐劑,但是益生菌的加入可減少香腸生產(chǎn)過(guò)程中的亞硝酸鹽添加量,提高發(fā)酵肉類(lèi)品質(zhì),滿足當(dāng)前消費(fèi)者的綠色、健康、微加工、無(wú)添加食品選購(gòu)理念[68]。 益生菌的添加既作為發(fā)酵劑,也兼具生物保護(hù)劑的作用,已經(jīng)被應(yīng)用于包括香腸、熏肉等多種肉品安全和品質(zhì)控制中。

除了作為發(fā)酵劑,也可以將鮮肉浸泡于益生菌液處理一定時(shí)間來(lái)達(dá)到保證鮮度和安全性的效果,在應(yīng)用中需考慮益生菌的初始活菌數(shù)目以及貯藏條件等因素。 研究發(fā)現(xiàn):初始活菌數(shù)目為7.5 lg CFU/g 的干酪乳桿菌和彎曲乳桿菌混合液的浸泡處理可以顯著降低低溫真空貯藏牛肉樣品中的致病微生物以及TVBN 值；處理后牛肉表面菌落復(fù)雜程度明顯低于未處理組,其中腐敗微生物腸桿菌、假單胞菌和熱殺索絲菌數(shù)目顯著降低。 在品質(zhì)方面,未經(jīng)處理的牛肉樣品于貯藏中后期TVBN 開(kāi)始上升迅速,在貯藏末期達(dá)到15 mg/100 g,已超中國(guó)冷鮮肉衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB2707—2016；而益生菌處理可使貨架期延長(zhǎng)10 d,且貯藏末期TVBN 值只有10 mg/100 g 左右,滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[69]。 還有研究利用干酪乳桿菌CTC494 控制低溫貯藏的真空包裝煙熏三文魚(yú)中的單增李斯特氏菌,來(lái)保證煙熏三文魚(yú)微生物安全性和品質(zhì)。 研究發(fā)現(xiàn),煙熏三文魚(yú)的品質(zhì)控制效果與益生菌菌株有很大關(guān)系,相對(duì)于干酪乳桿菌CTC494,彎曲乳桿菌CTC1742 對(duì)煙熏三文魚(yú)中單增李斯特菌的控制能力相對(duì)較弱[70]。

3.3 技術(shù)應(yīng)用研究趨勢(shì)

3.3.1 開(kāi)發(fā)高產(chǎn)高效抗菌肽

抗菌肽是目前在食品品質(zhì)控制中應(yīng)用較多的一種益生菌代謝物,其中Nisin 已被多國(guó)批準(zhǔn)作為食品添加劑使用,因?yàn)槭艿郊兓夹g(shù)的影響,Nisin 的一種半純品Nisaplin 的工業(yè)應(yīng)用比較常見(jiàn)[71]。 雖然抗菌肽的分離困難,使用成本較高,部分抗菌肽的抑菌譜較窄,但是近年來(lái)還是受到了持續(xù)關(guān)注和廣泛研究；人們還結(jié)合數(shù)據(jù)科學(xué)等技術(shù)針對(duì)已有抗菌肽抗菌特性開(kāi)發(fā)了相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù),利用基因組學(xué)數(shù)據(jù)的自動(dòng)識(shí)別和篩選評(píng)估其安全性[72],已篩選到很多具有相對(duì)寬抑菌譜的抗菌肽。 提高抗菌肽產(chǎn)量的手段包括對(duì)益生菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化、對(duì)菌株進(jìn)行基因工程改造以及人工合成等,同時(shí)需要配合加速下游益生菌純化技術(shù)的開(kāi)發(fā)[73-74]。 高產(chǎn)高效抗菌肽的開(kāi)發(fā)可為益生菌代謝物在食品安全和品質(zhì)控制中的工業(yè)化應(yīng)用提供一定基礎(chǔ)。

3.3.2 提升益生菌抑制微生物性能

對(duì)益生菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化可提升其抑制微生物的性能,以達(dá)到更好地控制食源性致病微生物的效果。 益生元的添加可以提高益生菌有效代謝物產(chǎn)量并在一定程度上增強(qiáng)其抑制食源性致病微生物的能力。 研究發(fā)現(xiàn),巖藻多糖的添加可提高鼠李糖乳桿菌GG 代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和抑菌能力。 巖藻多糖可促進(jìn)鼠李糖乳桿菌GG 有機(jī)酸的產(chǎn)生,傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析發(fā)現(xiàn),鼠李糖乳桿菌GG 細(xì)胞的磷脂雙分子層受到巖藻多糖的影響,膜蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,細(xì)胞形態(tài)變長(zhǎng)；低質(zhì)量濃度(8 mg/mL)相對(duì)于高質(zhì)量濃度(80 mg/mL)巖藻多糖的添加對(duì)鼠李糖乳桿菌GG 抑菌性能的提升作用更強(qiáng),這可能與高濃度益生元添加造成的高滲透壓和快速生長(zhǎng)分泌的有機(jī)酸影響了鼠李糖乳桿菌GG 的某些信號(hào)通路有關(guān)[75],其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。 另外將益生菌在比較溫和的壓力下培養(yǎng)也可以增強(qiáng)其抑菌性能[76],但其機(jī)制以及在食品品質(zhì)控制中的應(yīng)用效果也有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。

3.3.3 人工合成多功能益生菌

可考慮采用基因工程手段構(gòu)建具有多重功能的益生菌。 有研究構(gòu)建了一種可同時(shí)分泌γ-氨基丁酸(GABA)(抗氧化劑)以及抗菌肽Nisin 的功能益生菌F44/GadB1C1,使其發(fā)酵液同時(shí)具有控制食源性致病微生物和抗氧化作用。 這株菌的發(fā)酵過(guò)程采用pH 調(diào)節(jié)的兩段式發(fā)酵,控制GABA 以及Nisin 的生物合成,發(fā)酵過(guò)程結(jié)束后F44/GadB1C1 菌的GABA產(chǎn)量可以達(dá)到9.12 g/L,是恒定pH 值發(fā)酵過(guò)程GABA產(chǎn)量的2.2 倍。 F44/GadB1C1 凍干的發(fā)酵產(chǎn)物(具有抑菌劑和抗氧化劑的雙重功能)可顯著降低豬肉冷藏期間表面微生物水平,對(duì)大腸桿菌和乳酸菌的抑制效果高于山梨酸鉀,并可很好地控制豬肉脂質(zhì)氧化,豬肉樣品的TBARS 值在貯藏期間上升緩慢,與添加叔丁基羥基茴香醚對(duì)脂肪氧化的抑制效果類(lèi)似；同時(shí)F44/GadB1C1 的發(fā)酵液也可以顯著降低草莓腐爛率,比單獨(dú)采用Nisin 具有更好的品質(zhì)保持效果,與添加苯甲酸鈉和山梨酸鉀的防腐效果相當(dāng)[77]。

3.3.4 設(shè)計(jì)益生菌活性包裝

益生菌的活力大小以及其活力是否可以在貯藏期間得到保持是影響其對(duì)食源性致病微生物品質(zhì)控制效果的一個(gè)重要因素。 可考慮將益生菌和大分子可食用材料相結(jié)合來(lái)達(dá)到保證其活力的目的,因此開(kāi)發(fā)含有益生菌的活性包裝產(chǎn)品也成為目前益生菌在保鮮領(lǐng)域應(yīng)用和活性包裝材料研發(fā)的熱點(diǎn)。 該技術(shù)在保證益生菌具有抑制食源性致病微生物活力的同時(shí)還可以避免將益生菌直接作用于食品對(duì)食品的風(fēng)味可能造成的影響,同時(shí)這種活性包裝材料還具有保水、阻隔、抗氧化等性能。 有研究制作了益生菌植物多糖活性包裝膜,并將其應(yīng)用于水果和蔬菜的品質(zhì)控制。 該方法利用木瓜、亞麻和羅勒的種子(含有不同多糖)包裹益生菌,制備了有高保濕性、熱穩(wěn)定性和高機(jī)械強(qiáng)度的可食用膜,發(fā)現(xiàn)這種可食用膜不僅具有很強(qiáng)的阻隔性,并能同時(shí)保證鼠李糖乳桿菌GG 的活力；用其包裝草莓、香蕉、黃瓜和圣女果等鮮果可使鮮果免受紫外線照射,保持水分(黃瓜和圣女果水分的保持分別能持續(xù)7 d 和30 d)、維持良好外觀以及避免褐變等[78]。 另有研究制作了含有多種植物乳桿菌(植物乳桿菌LP3、植物乳桿菌AF1 和植物乳桿菌LU5)的魔芋基可食用膜,對(duì)鮮切獼猴桃品質(zhì)及其真菌進(jìn)行控制。 該研究發(fā)現(xiàn),隨著貯藏天數(shù)的增加,可食用膜中的益生菌仍保持較高的存活率(7 lg CFU/g 左右),且植物乳桿菌LP3 的存活率要高于其他菌株；與對(duì)照組相比,鮮切獼猴桃的腐爛和顏色變化得到了很好的控制,霉菌和酵母菌的數(shù)量顯著減少,葉綠素和抗壞血酸的含量基本沒(méi)有發(fā)生變化,且總酚含量和抗自由基活性也比對(duì)照組高,其感官的接受度也更高,說(shuō)明其食用安全性和品質(zhì)都得到了很好的保持[79]。

3.3.5 聯(lián)合其他食品安全和品質(zhì)控制技術(shù)

益生菌及其代謝物還可以和其他食品安全和品質(zhì)控制技術(shù)結(jié)合達(dá)到協(xié)同增效的效果。 研究發(fā)現(xiàn),使用益生菌和EDTA 及黑胡椒提取物復(fù)配后,相對(duì)于分別單獨(dú)采用羅伊氏乳桿菌、干酪乳桿菌、EDTA和黑胡椒提取物,復(fù)配物可將對(duì)大腸桿菌的抑制能力提升2 倍,也使低溫條件貯藏的牛肉中微生物數(shù)量顯著降低,并可抑制牛肉在貯藏過(guò)程中的脂肪氧化,保證牛肉的食用安全和品質(zhì)[80]。 利用超高壓技術(shù)結(jié)合乳酸乳球菌對(duì)肉類(lèi)進(jìn)行處理后可有效減少變形菌門(mén)類(lèi)腐敗細(xì)菌的數(shù)目,可以在很大程度上減少和避免亞硝酸鹽的使用,降低消費(fèi)者食用后的致癌風(fēng)險(xiǎn)[81]。 與其他技術(shù)的聯(lián)用擴(kuò)大了益生菌及其代謝物在食品安全和品質(zhì)控制中的應(yīng)用范圍。

4 展望

基于益生菌及其代謝物的食源性致病微生物控制技術(shù)在食品安全和品質(zhì)控制上的應(yīng)用具有很大優(yōu)勢(shì),但其工業(yè)化仍然面臨很多問(wèn)題。 首先要考慮的就是益生菌生物及其代謝物的食用安全性問(wèn)題,目前已經(jīng)批準(zhǔn)在食品中添加的益生菌及其代謝物的種類(lèi)較少,且研究發(fā)現(xiàn)某些抑菌物質(zhì)對(duì)人體內(nèi)正常益生菌群存在抑制作用,他們之間的關(guān)系也需要進(jìn)一步研究。 未來(lái)的研究需要側(cè)重對(duì)益生菌及其代謝物的安全性評(píng)價(jià),為其工業(yè)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)；同時(shí)還需要進(jìn)一步對(duì)具有益生和抑制食源性致病微生物功能的益生菌菌株資源進(jìn)行挖掘,結(jié)合生物信息學(xué)、計(jì)算生物學(xué)、數(shù)據(jù)科學(xué)和現(xiàn)代儀器分析等手段確定合適的分離培養(yǎng)方案。 益生菌抑菌活性物質(zhì)的確定和分離也是目前研究的一個(gè)瓶頸,需要開(kāi)發(fā)敏感度更高和更有效的識(shí)別和分離方法；同時(shí)相關(guān)菌株及其代謝物抑制食源性致病微生物的機(jī)制、環(huán)境對(duì)益生菌抗菌性能影響等機(jī)制也有待于進(jìn)行更深層次的研究,為更好地實(shí)現(xiàn)基于益生菌及其代謝物的食源性致病微生物控制技術(shù)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。