曲 敏, 陳紅麗, 王 宇, 張鑫平, 黃雨洋, 朱秀清

(哈爾濱商業(yè)大學 食品工程學院/黑龍江省普通高校食品科學與工程重點實驗室/黑龍江省谷物食品與谷物資源綜合加工重點實驗室, 哈爾濱 150028)

傳統(tǒng)豆制品包括豆?jié){、豆花、豆腐、豆干和豆腐皮等。 我國有著悠久的豆制品食用歷史,近年來隨著居民生活水平的提高,我國大豆制品消費量迅速增長。 據(jù)中國豆制品專業(yè)委員會報道,在2019年豆制品生產(chǎn)行業(yè)前50 強企業(yè)的投豆量達到了266 萬t,2021年的投豆量約達317 萬t。 在傳統(tǒng)豆制品中,產(chǎn)量最大、影響最廣的莫過于豆腐。 雖然不同豆制品的制作工藝與產(chǎn)品特點不同,但蛋白含量與水分含量高的產(chǎn)品特點為微生物提供了理想的繁殖條件,極易引起腐敗變質(zhì),如發(fā)生脹袋、變酸、變臭、變軟、變黏等。 如葡萄糖酸內(nèi)酯豆腐在夏季的保質(zhì)期只有1 ～2 d,冬季(0 ～4 ℃)不超過7 d[1]；汪立平等[2]將未開封的豆?jié){在37 ℃放置約7 d,發(fā)現(xiàn)豆?jié){盒鼓起,產(chǎn)生酸敗味；歐杰等[3]將白干、薄百葉于25 ℃貯藏3 d 后,產(chǎn)酸變黏。 腐敗變質(zhì)問題直接影響了傳統(tǒng)豆制品的品質(zhì)與食用安全。 鑒于傳統(tǒng)豆制品尤其是鮮食豆制品保質(zhì)期短、運輸儲存均需低溫冷藏,而且豆制品生產(chǎn)企業(yè)多以生產(chǎn)基地為中心,向四周圓形輻射銷售,其輻射距離與豆制品的保鮮時間和企業(yè)的運輸能力呈正相關(guān),嚴重影響了豆制品加工企業(yè)的產(chǎn)量和規(guī)模。 近年來,傳統(tǒng)豆制品的腐敗變質(zhì)及腐敗菌污染引起了國內(nèi)外學者們的關(guān)注,確定腐敗菌的來源和種類,分析不同腐敗菌與豆制品品質(zhì)變化的相關(guān)性,并采用安全有效的方法對其進行抑制,日益成為研究熱點。 本文對引起傳統(tǒng)豆制品腐敗變質(zhì)的原因、腐敗菌的種類與腐敗特點及抑制機理和方法進行了綜述,并對控制腐敗菌、延長保質(zhì)期提出了建議。

1 引起豆制品腐敗的原因

對豆制品造成污染的微生物主要有3 種來源途徑:原材料自身、生產(chǎn)加工過程以及貯藏條件等。

1.1 原材料自身的影響

1.1.1 種植環(huán)境的影響

在大豆種植過程中,土壤中的微生物有可能是引起豆制品變質(zhì)的腐敗菌來源之一。 這些土壤中的微生物在大豆種植期間會受到相關(guān)因素的影響,比如發(fā)育期、降水量以及輪作的影響等。

大豆在種植前期、分枝期、結(jié)莢期、成熟期時,其根際土壤微生物數(shù)量存在著動態(tài)變化的規(guī)律,根際微生物總數(shù)由高到低依次為:細菌、放線菌、真菌。 細菌在種植前期數(shù)量最高,真菌在分枝期總數(shù)最多,放線菌總數(shù)在結(jié)莢期達到最大值,根際微生物數(shù)量在成熟期降至最低[4]。 降水量是決定細菌和真菌群落多樣性和組成的主要環(huán)境因素之一[5],同時降水量增多促進了土壤有機質(zhì)的轉(zhuǎn)化,進而促進產(chǎn)生更多的細菌——真菌營養(yǎng)級相互作用。 如南方地區(qū)的降水量顯著高于北方地區(qū),導致南方地區(qū)大豆根際微生物共發(fā)生網(wǎng)絡比在北方地區(qū)復雜,具有更多的細菌——真菌連接[6]。 大豆輪作后,根際微生物的細菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性更加高。 根際土壤中細菌的操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)數(shù)增加了6.85 倍,Ace指數(shù)增加了4.15 倍,Chao1 和Shannon 指數(shù)分別增加了5.45 倍和2.43 倍。 富集了假單胞菌屬(Pseudomonas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)等。 土壤休眠孢子含量相對減少了77%,根瘤菌(Rhizobium)的豐度增加[7]。 研究表明:在不同產(chǎn)地、不同種植環(huán)境中采集的不同品種大豆,細菌總數(shù)和芽孢數(shù)總集中在一定范圍內(nèi),細菌總數(shù)都集中在6 ～7 lg(CFU/g),芽孢總數(shù)集中在1 ～2 lg(CFU/g)[8]。柳玉[8]采集了來自黑龍江地區(qū)不同種植環(huán)境的大豆,發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)是原料中攜帶的豆制品的固定致腐菌。 根據(jù)蛋白電泳分析,大豆中的芽孢桿菌(Bacillus)與大豆生長和收獲過程中的微環(huán)境存在較大關(guān)系,與大豆產(chǎn)地和品種無關(guān)。

1.1.2 種皮微生物與內(nèi)源微生物的影響

渡邊篤二[9]利用掃描電鏡觀察到大豆種皮表面具有大量坑凹,其凹陷深度延伸至表皮柵欄細胞的底部,形成氣孔。 另外,大豆籽粒具有多層結(jié)構(gòu)。 微生物可能棲息于氣孔及籽粒多層結(jié)構(gòu)的不同部位。 如細菌主要存在于大豆籽粒種皮的外表面以及氣孔中,其中外表面細菌總數(shù)約為6.72 lg(CFU/g),氣孔中的細菌總數(shù)約為4.32 lg(CFU/g)[8]。 研究發(fā)現(xiàn),細菌在大豆表皮的柱狀細胞上附著力較強,能引起豆制品質(zhì)構(gòu)變軟、氣味酸臭等的耐熱芽孢桿菌(Bacillus)和腸球菌(Enterococcus)[2],如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和屎腸球菌(Enterococcus faecium)等主要存在于大豆的外表面和表皮中,且簡單水洗和脫皮不能將其除去,這為豆制品生產(chǎn)中微生物的去除增加了困難。因此,研究微生物在大豆中的分布部位,結(jié)合特性及其與豆制品的品質(zhì)劣變和腐敗的關(guān)系變得日益迫切起來。

內(nèi)生菌存在于大豆、豌豆和苜蓿等豆科植物的很多組織器官中。 王玉霞等[10]從在不同地點采集的大豆的各種組織中分離得到了137 株內(nèi)生細菌,發(fā)現(xiàn)其中2 株為芽孢桿菌(Bacillus)。 Kuklinsky等[11]從兩個不同大豆品種中分離到了內(nèi)生細菌和附生細菌。 部分分離株經(jīng)16S rDNA 序列分析鑒定,其中的絕大多數(shù)為假單胞菌科(Pseudomonaceae)、伯克霍爾菌科(Burkholderiacea)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)。 這些分離株與分離季節(jié)、大豆生長期及獲得分離物的組織相關(guān)的細菌種群密度方面存在著顯著的差異。 Tuitemwong 等[12]的研究表明假單胞菌(Pseudomonas)和腸桿菌(Enterobacter)是使豆腐腐敗變質(zhì)的腐敗菌,會使豆腐產(chǎn)生胺臭味、表面出現(xiàn)黃色素和變酸。

1.2 生產(chǎn)過程的影響

原料預處理的影響。 我國豆制品廠用的大豆原料都是從地里收割、沒有經(jīng)過任何特殊處理便投入生產(chǎn),會沾有泥土、糞便等污染物,因此殘留著大量的微生物,故原料大豆一次清洗、二次清洗及濾漿過程中細菌總數(shù)變化很小[8]。 石彥國等[13]發(fā)現(xiàn)大豆原料中所攜帶的一部分微生物通過簡單的水洗和脫皮并不能將其除去,仍附著在大豆表皮的柱狀細胞上。 無論利用干法或是濕法脫皮,交叉污染都會發(fā)生,很難起到減少大豆中微生物的目的。 柳玉等[8]發(fā)現(xiàn),浸泡過程中細菌總數(shù)增加0.43 ～1.10 lg(CFU/g)。

加熱過程中的殘留。 在大豆加工過程中,加熱不僅能使蛋白質(zhì)適度變性、使抗營養(yǎng)因子失活,還能殺死生豆?jié){中大量的微生物。 但過熱會使豆?jié){黏度增加,不利于與凝固劑混合,影響其硬度。 因此,在豆制品的加工過程中,一般采用較為溫和的加熱煮漿方式,但革蘭氏陽性芽孢桿菌和耐熱菌會殘留下。同時,某些芽孢桿菌在逆環(huán)境中會產(chǎn)生殘留的耐熱芽孢,待到環(huán)境適宜,重新萌發(fā),產(chǎn)生毒素,食品安全遭到威脅。 例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)可產(chǎn)生淀粉酶及枯草桿菌素,引起食品腐敗變質(zhì),蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)可引起食物中毒。 柳玉[8]發(fā)現(xiàn)大豆經(jīng)加熱煮漿過程細菌總數(shù)會較大幅度的降低,但在37 ℃保存時,殘留細菌得以迅速繁殖,在24 h 后即達到8.14 ～9.07 lg(CFU/g)。 這些加熱后仍殘留的微生物將隨后續(xù)加工步驟進入到最終產(chǎn)品,直接影響豆制品的衛(wèi)生安全和保質(zhì)期。 因此,原料中的初始細菌數(shù)量和加熱方式直接影響大豆制品的食用安全和貨架期。

加工輔料帶入的安全隱患。 豆腐加工過程中,需要加入內(nèi)酯、石膏、鹽鹵等凝固劑,空氣和土壤中也存在著乳酸菌(lactic acid bacteria)和浮游芽孢桿菌(Bacillus)等,由于生產(chǎn)和保藏不當,極易在生產(chǎn)中將雜菌引入。 Fei 等[14]利用高通量測序技術(shù)對傳統(tǒng)豆腐凝固劑——天然發(fā)酵豆腐乳清(naturally fermented tofu whey,NFTW)微生物多樣性進行了分析,結(jié)果表明乳酸桿菌(Lactobacillus)占比95.31%,是NFTW 微生物群落中的優(yōu)勢屬。 石彥國等[13]利用紫外線對豆腐中的凝固劑進行殺菌處理。 發(fā)現(xiàn)與未殺菌組對比,殺菌組豆?jié){中的細菌總數(shù)減少了近一半,說明對凝固劑進行殺菌處理可以有效控制豆腐中的微生物增長。

設備清洗不徹底等。 生產(chǎn)結(jié)束后,設備清洗不夠徹底使表面仍附著有大量微生物,某些設備與豆?jié){、豆腐直接接觸,營養(yǎng)物質(zhì)豐富,微生物迅速繁殖,造成產(chǎn)品質(zhì)量劣變。 吳麗櫻[15]發(fā)現(xiàn)磨漿機和裝豆?jié){的容器等清洗不徹底,易形成富含蛋白質(zhì)和多糖的環(huán)境。 磨漿時,大豆中的內(nèi)源微生物芽孢桿菌(Bacillus)會釋放出來,在此環(huán)境下繁殖迅速,在容器壁上形成菌膜,污染豆腐。

1.3 貯藏條件的影響

在不同的貯藏條件下,復雜食品體系中的微生物之間會通過互惠共生、群體感應或者拮抗作用等相互影響,腐敗菌代謝會產(chǎn)黏液、產(chǎn)酸、產(chǎn)腐敗味等,導致顏色、質(zhì)構(gòu)、氣味等顯現(xiàn)出腐敗特性。 如果某種細菌具有較強競爭力并且能適應此種環(huán)境,它就會大量生長繁殖成為優(yōu)勢菌,其他菌生長受到抑制。吳麗櫻等[16]研究了內(nèi)酯豆腐和簡易包裝老豆腐的腐敗菌群變化。 結(jié)果顯示,引起內(nèi)酯豆腐腐敗變質(zhì)的主要是耐熱的芽孢桿菌屬(Bacillus),而簡易包裝的老豆腐初始菌相構(gòu)成復雜,在4、25、37 ℃等不同溫度儲藏腐敗后,與初始菌相差異明顯,4 ℃下老豆腐腐敗菌主要有假單胞菌(Pseudomonas)、芽孢桿菌(Bacillus)。 25、37 ℃儲藏腐敗后明串珠菌屬(Leuconostoc)在數(shù)量上占據(jù)絕對優(yōu)勢。 李博等[1]研究了37 ℃下不同貯藏時間(0 d 和1 d)下的葡萄糖酸內(nèi)酯豆腐中優(yōu)勢菌群的變化。 發(fā)現(xiàn)新鮮的貯藏0 d 的豆腐中的主要微生物是堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus),在37 ℃存放1 d 的樣品中優(yōu)勢菌群則以屎腸球菌(Enterococcus faecium)為主,可以說盡管初始芽孢桿菌(Bacillus)在新鮮豆腐中數(shù)量占優(yōu)勢,但相同條件下屎腸球菌(Enterococcus faecium)生長繁殖速度大于芽孢桿菌,故成為導致豆腐迅速發(fā)生腐敗變質(zhì)的腐敗菌。

2 引起傳統(tǒng)豆制品腐敗的菌種類型

引起傳統(tǒng)豆制品腐敗的細菌種類及腐敗特點見表1[17-28]。 腐敗菌代謝導致蛋白質(zhì)的分解,使豆制品產(chǎn)黏液、產(chǎn)酸,導致其顏色變紅或變黃、質(zhì)構(gòu)特性指標下降,出現(xiàn)難聞的酸臭味等腐敗特性。 在化學指標上,有人利用有機酸分析預測豆腐新鮮度[29]:酸度變化大,腐敗程度越大。 在傳統(tǒng)豆制品腐敗菌的分離鑒定中,多用將傳統(tǒng)的表型鑒定與現(xiàn)代分子遺傳學鑒定相結(jié)合的方法來分離鑒定腐敗菌,這有利于全面評估微生物多樣性和動態(tài)[30]。

引起豆制品腐敗的微生物主要有細菌和真菌。從表1 中可以看出,引起腐敗變質(zhì)的細菌主要有芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)及金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。 其中,蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等為常見的致病微生物,會導致食源性疾病的暴發(fā)。 芽孢桿菌(Bacillus)主要作用于豆腐、豆?jié){和豆腐干,會使豆制品變酸、變臭、質(zhì)構(gòu)變軟、產(chǎn)生黏液和酸臭味；假單胞菌(Pseudomonas)主要作用于豆腐,會產(chǎn)生黃色色素或熒光素,有胺臭味(腥臭味)；大腸桿菌(Escherichia coli)主要出現(xiàn)在生產(chǎn)包裝消毒不徹底、衛(wèi)生條件差的豆制品中,會產(chǎn)酸、產(chǎn)氣；乳桿菌(Lactobacillus)主要作用于豆腐和豆?jié){,會使其酸度增高；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)主要出現(xiàn)在豆腐中,數(shù)量超標會致病。

表1 引起傳統(tǒng)豆制品腐敗的細菌種類及腐敗特點Tab.1 Types of bacteria that cause spoilage of traditional soy products and their spoilage characteristics

引起腐敗變質(zhì)的真菌主要包括霉菌和酵母菌。韓翠萍等[31]發(fā)現(xiàn)來源于生產(chǎn)設備中的克假絲酵母(Candida krusei)會使豆腐發(fā)黏、脹袋以及質(zhì)構(gòu)變軟。 歐杰等[3]發(fā)現(xiàn)誕沫假絲酵母(Candida zeylanoides)、季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)、皮狀絲孢酵母(Trichosporon cutaneum)、蕓苔絲孢酵母(Trichosporon brassicae)是存在于傳統(tǒng)豆制品白干與薄百葉中的腐敗菌,會導致豆制品發(fā)生腐敗。 其他一些真菌,如圓弧青霉(Penicillium cyclopium)和黃綠青霉(Penicillium toxicarum Miyake)等也在腐敗變質(zhì)的豆制品中被檢出。

3 傳統(tǒng)豆制品腐敗菌的抑制機理與方法

3.1 腐敗菌抑制的機理

當前,對腐敗菌的抑制主要采用物理殺菌、化學抑菌和生物防腐技術(shù),歸納總結(jié)腐敗菌的抑制機理見圖1。 由圖1 可知,通過破壞細菌細胞壁的重要組成成分——肽聚糖,干擾細胞壁的合成,使菌體結(jié)構(gòu)受損；通過損傷細菌細胞膜,使其穿孔,膜通透性和流動性得到增加,從而破壞細胞膜結(jié)構(gòu),氨基酸、離子等諸多內(nèi)容物滲岀,最終使細胞失活；抑制細菌中大分子物質(zhì)——核酸和蛋白質(zhì)合成。 抑菌劑可與DNA 結(jié)合或作用于與DNA 合成有關(guān)的酶類,使細菌中相關(guān)基因的正常合成、表達受阻,抑制蛋白質(zhì)合成,影響微生物生長代謝所需要的酶,從而抑制或殺死腐敗菌；大分子量的抑菌劑可以變成一種生物絮凝劑,吸附在細胞壁表面,形成致密高分子膜,使細菌困在一個相對密閉的環(huán)境中,阻礙營養(yǎng)物質(zhì)吸收,擾亂細菌的新陳代謝,實現(xiàn)抑菌的效果；抑菌劑與腐敗菌競爭營養(yǎng)物質(zhì),使得運輸?shù)郊毦鷥?nèi)部的營養(yǎng)物質(zhì)減少,機體的正常代謝紊亂,微生物生長受到抑制。

圖1 傳統(tǒng)豆制品中腐敗菌增殖的抑制機理Fig.1 Mechanism of inhibiting proliferation of spoilage bacteria in traditional soy products

3.2 腐敗菌抑制的方法

3.2.1 物理殺菌

傳統(tǒng)的物理殺菌技術(shù)主要有低溫保藏、輻照殺菌、超高壓保鮮和超高溫瞬時殺菌等。

利用低溫保藏技術(shù)(4 ～10 ℃),抑制微生物的生長及代謝活動。 可較好的保持豆制品的原有風味,但耗能多、成本高,豆腐即使在冷藏條件下也很容易被微生物污染,致使低溫難以有效控制耐低溫的病原微生物；利用輻照殺菌技術(shù)可有效損害細菌細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)DNA,使其化學鍵裂解不能繼續(xù)復制。 是一種殺菌效果好、對食品質(zhì)量影響不大,能有效延長食品保質(zhì)期的冷殺菌技術(shù)。 目前,被用來進行食品殺菌和提高可儲存性的是60Co 和137Cs 發(fā)射的γ 輻射技術(shù)。 徐遠芳等[32]將湘氏休閑豆干放在不同吸收劑量的60Co γ 射線下照射。 發(fā)現(xiàn)8.6 kGy 的吸收劑量可以將細菌和霉菌數(shù)減少到10 CFU/g以下,達到貯藏和保鮮的目的。 但輻照食物可能引起的致畸、致癌、致突變性等安全問題存在的爭議限制了該技術(shù)的使用。 利用超高壓保鮮技術(shù)(液體或氣體壓力在100 MPa 以上稱為超高壓)可破壞微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的非共價鍵及其高級結(jié)構(gòu),使蛋白質(zhì)凝固和酶失活。 還能造成細胞膜破裂,使微生物體內(nèi)化學組分外流,對微生物具有致死作用。具有溫度升高值很小,殺菌高效快速、均勻,能耗低的優(yōu)點。 但超高壓殺菌只能使用軟包裝材料,包裝方式有限。 Préstamo 等[33]將豆腐樣品在5 ℃、400 MPa 的超高壓下分別放置5、30、45 min,發(fā)現(xiàn)高壓處理可以減少豆腐中微生物的數(shù)量。 5 min 時菌落數(shù)值減少了0.31 lg CFU/mL,30 min 時數(shù)值減少了1.56 lg CFU/mL；在相同條件下,隨著時間增長(45 min),細菌數(shù)量總體減少了2.38 lg CFU/mL；感官測試結(jié)果表明處理后的豆腐可以被消費者接受,加壓樣品的口感在良好范圍內(nèi),高壓處理過的樣品比未經(jīng)處理的樣品口感更為細膩、適口感增加。 但高壓處理加劇了豆腐中網(wǎng)狀基質(zhì)顆粒的分散,影響了豆腐的品質(zhì)。 利用超高溫瞬時殺菌技術(shù)將食品瞬間加熱到135 ℃高溫以上,食品中微生物的蛋白質(zhì)肽鏈彎曲結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而變性,3 ～5 s 可將微生物孢子完全殺滅,達到殺菌目的,而不影響食品的營養(yǎng)和色香味。 韋艷姿等[34]利用超高溫瞬時殺菌技術(shù)將豆?jié){在(135 ±5)℃下保持3 ～5 s 后,發(fā)現(xiàn)豆?jié){中的所有細菌包括芽孢菌都被殺滅,產(chǎn)品口感保持良好。 結(jié)合無菌包裝技術(shù),豆?jié){可在常溫下存放30 d 以上,極大延長了保質(zhì)期。

低溫等離子體技術(shù)是一種新型綠色的非熱殺菌技術(shù),近年來在食品加工業(yè)中的應用正在嶄露頭角。利用低溫等離子體在放電過程中激發(fā)氣體產(chǎn)生的紫外線破壞了微生物的結(jié)構(gòu),同時在放電過程中等離子蝕刻誘導產(chǎn)生含氧氮活性基團破壞了微生物的遺傳物質(zhì)及細胞膜與細胞壁結(jié)構(gòu),造成細胞質(zhì)外泄,細胞死亡。 低溫等離子體技術(shù)具有殺菌效率高,低溫處理時間短、無毒、運行成本低的優(yōu)點。 并且能夠非熱滅活潛在的腐敗微生物[35]。 低溫等離子體冷殺菌技術(shù)正在成為食品殺菌研究領(lǐng)域的熱點,隨著食品殺菌技術(shù)的快速提高,該技術(shù)具有廣闊的應用和發(fā)展空間。 但目前多用于生鮮肉制品的保鮮殺菌中,尚未應用在豆制品中。

3.2.2 化學抑菌

目前被廣泛應用于食品防腐中的措施是直接向豆制品中添加化學防腐劑,用來控制食品微生物的生長。 常用的化學防腐劑包括苯甲酸及其鹽類、山梨酸及其鹽類。 Koo 等[36]研究了大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella)、李斯特菌(Liste-ria monocytogenes)和蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)在豆腐上接種后,采用硫胺素二月桂基硫酸鹽(thiamine dilauryl sulfate,TDS)對豆腐進行腐敗菌抑菌實驗。 結(jié)果表明,添加w=2%的TDS 顯著降低了4 種菌的數(shù)量水平。 Shin 等[37]研究了異硫氰酸鹽(isothiocyanates,ITCs)在10 ℃條件下對在貯藏的0、2、4、6、8、10 d 的豆腐腐敗微生物影響。 結(jié)果表明:200 mg/kg 的ITCs 對儲存10 d 的豆腐中的微生物生長有明顯的抑制作用,顏色、味道、氣味、咀嚼性和過度接受度等感官屬性的偏好較高。 在貯藏初期,添加ITCs 對豆腐的感官性狀(特別是口感和氣味)有輕微的影響,而在10 ℃下貯藏10 d 后,豆腐的感官性狀保持了良好。 但化學防腐劑濫用和過量使用會造成一系列食品安全問題,對人體健康存在著潛在威脅,使用范圍受限。

3.2.3 生物防腐

從動植物、微生物中提取天然抑菌劑具有資源豐富、天然、高效的特點,在確保食品的微生物安全性、功能性的同時,還能賦予食品更高的營養(yǎng)價值,是一個有待開發(fā)的食品防腐新領(lǐng)域。 生物防腐劑包括動物源抑菌劑、植物源抑菌劑和微生物源抑菌劑。

3.2.3.1 動物源生物抑菌劑

動物源生物抑菌劑是一類氨基酸類、天然肽類、高分子糖類等物質(zhì)。 直接從動物體中分離提取而來,對多種微生物具有抑菌活性。 鄭衛(wèi)等[38]發(fā)現(xiàn)w=1%的殼聚糖溶液可以抑制豆腐中大腸桿菌的生長,將豆腐保質(zhì)期延長至3 d,保證豆腐的口感。王敏等[39]采用具有抑菌活性作用的蜂膠作為非發(fā)酵豆制品中的保鮮劑,結(jié)果顯示w=0.4%的蜂膠可以明顯抑制腐敗菌的生長,使豆制品保質(zhì)期延長。Kim 等[40]發(fā)現(xiàn)添加w=0.05%和w=0.1%牡蠣殼粉的豆腐制品,具有口感好,硬度適中,豆味較低的特點,可延長貨架期。 然而,動物源抑菌劑的抗菌特性及其潛在的食品應用仍處于起步階段,具有深遠的潛力和應用空間。

3.2.3.2 植物源生物抑菌劑

植物源抑菌劑是指植物產(chǎn)生的具有抗菌作用的化合物,包括香辛料(精油)及中草藥提取物(醛、酮、酯、醚、酸、萜類等)和茶多酚等,具有保護和延續(xù)物種及防御疾病的作用。 Cui 等[41]利用脂質(zhì)體包裹的丁香油對豆腐中的金黃色葡萄球菌進行抑制研究,結(jié)果表明處理24 h 后,金黃色葡萄球菌的數(shù)量減少了99.87%。 衛(wèi)強等[42]發(fā)現(xiàn)梔子葉揮發(fā)油可使豆腐保鮮期延長6 d,對豆腐中的菌群有較強的抑制作用。

在食品腐敗生態(tài)系統(tǒng)中,細菌行為受到細菌群體感應(quorum sensing,QS)系統(tǒng)的控制。 來自食品加工環(huán)境中的病原體和腐敗細菌定植在食品表面定植形成了生物膜。 大部分革蘭氏陰性菌的生物膜形成是由QS 調(diào)控的。 香蘭素具有明顯的抗QS 表型抑制作用。 Li 等[43]研究了植物源抑菌劑——香蘭素對食品中腐敗菌蜂房哈夫尼菌的抑菌機理。 我們將Li 的研究歸納出作為植物源抑菌劑香蘭素的抑菌機理,見圖2。 由圖2 可知,香蘭素可與靶蛋白相互作用,與靶蛋白競爭結(jié)合；可以使相關(guān)基因表達水平下調(diào),干擾QS 系統(tǒng)主要信號分泌分子——?；呓z氨酸內(nèi)酯(n-acyl-homoserine lactone,AHL)的合成從而阻止生物膜的形成。 這些發(fā)現(xiàn)將有助于拓寬香蘭素作為QS 抑制劑的應用。 目前,植物源抑菌劑仍處于研究探索階段,尚未達到商業(yè)化應用。

圖2 植物源抑菌劑香蘭素的抑菌機理Fig.2 Bacteriostatic mechanism of vanillin as a plant-derived bacteriostatic agent

3.2.3.3 微生物源生物抑菌劑

微生物源生物抑菌劑是指某些微生物本身或由其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,具有抑制微生物生長繁殖的作用。 常用的微生物源抑菌劑有4 種(見圖3):乳酸鏈球菌素(Nisin)、納他霉素、ε-聚賴氨酸和普魯蘭多糖,微生物源生物抑菌劑的微生物源、作用特點及抑菌有效范圍不同。 由乳酸菌產(chǎn)生的抗菌肽、乳酸鏈球菌素,可抑制革蘭氏陽性菌的生長；由那他鏈霉菌產(chǎn)生的納他霉素,對幾乎所有霉菌和酵母有效；由放線菌產(chǎn)生的抗菌活性功能多肽、ε-聚賴氨酸,可破壞微生物的細胞膜；由出芽短梗霉產(chǎn)生的胞外中性多糖、普魯蘭多糖,與其他抑菌劑使用可協(xié)同增效。

圖3 4 種常用的微生物源抑菌劑Fig.3 Four commonly used microbial-derived bacteriostatic agents

將這些微生物源抑菌劑的作用機制進行歸納,見圖4。 由圖4 可知,抑菌物質(zhì)靠近細菌細胞膜后在靜電力的作用下,插入到磷脂雙分子層中,慢慢在細胞膜上形成微孔,導致膜通透性增加,離子通道遭到破壞和能量產(chǎn)生系統(tǒng)受到干擾,造成細胞內(nèi)的Ca2+、K+等外流,細胞內(nèi)容物(氨基酸、維生素等小分子物質(zhì))滲出,新陳代謝發(fā)生紊亂,破壞了腐敗菌細胞膜屏障,導致菌體死亡。 Ye 等[44]認為ε-聚賴氨酸可能的抗菌機制是當ε-聚賴氨酸與大腸桿菌O157:H7 接觸時,通過靜電吸引與細菌膜表面結(jié)合。 這種相互作用的積累造成膜擾動,導致細胞膜結(jié)構(gòu)的變化而斷裂。 因此,ε-聚賴氨酸通過細胞膜斷裂進入細胞質(zhì)。 ε-聚賴氨酸誘導活性氧(reactive oxyen species,ROS)和DNA 損傷反應(SOS 反應)的產(chǎn)生,影響細胞死亡,調(diào)控相關(guān)基因的表達水平。 這些因素的協(xié)同作用或累積影響細胞,最終導致細菌的死亡。 Punyauppa 等[45]認為乳酸鏈球菌素的抑菌機理為:使用N 端結(jié)合基序與脂質(zhì)Ⅱ的碳水化合物焦磷酸部分結(jié)合。 這使得乳鏈球菌素的C 端片段能夠插入細胞膜。 多個Nisin-脂質(zhì)Ⅱ復合物在靶細胞細胞膜上組裝形成一個穩(wěn)定的直徑為2 nm 的孔隙。 它可能導致膜透性的增加,導致膜電位的耗散,流出的小胞質(zhì)內(nèi)容物如核苷酸和離子等。 因此,受損的細胞既不能產(chǎn)生能量也不能產(chǎn)生重要的大分子,致使細胞死亡。

圖4 微生物源抑菌劑抑菌機理Fig.4 Bacteriostatic mechanism of microbial bacteriostatic agents

葛子榜[46]將微生物源保鮮劑添加到豆腐,研究其對豆腐中腐敗菌的影響。 發(fā)現(xiàn)將普魯蘭多糖、ε-聚賴氨酸和雙乙酸鈉3 種保鮮劑進行復配,對腐敗菌的抑制有明顯的協(xié)同增效作用。 對豆腐的色香味以及品質(zhì)無太大影響,可替代化學防腐劑,豆腐保存天數(shù)得到延長。 Schillinger 等[47]應用低劑量的乳酸鏈球菌素來防止豆腐中李斯特菌的繁殖。 Chen等[48]將產(chǎn)細菌素的魏斯氏菌(Weissella hellenica)D1501 作為發(fā)酵劑和凝固劑加入到新型乳酸菌豆腐中,發(fā)現(xiàn)其能夠抑制豆腐中的腐敗菌和致病菌的生長,提高了豆腐的安全性和貨架期。

同時,如何保持微生物源抑菌劑的抑菌活性也成為當前的另一個研究熱點。 張恒等[49]發(fā)現(xiàn)在豆?jié){生產(chǎn)過程中加入濃度為1.0 g/kg 的Nisin,能良好保持豆腐原有的品質(zhì)與風味,保鮮效果明顯。 葛子榜在豆腐制作過程中點腦的環(huán)節(jié)時將微生物源抑菌劑復配物加入,發(fā)現(xiàn)普魯蘭多糖與ε-聚賴氨酸組合的抑菌效果最好[46]。 其他方法-包埋微生物源抑菌劑制備微膠囊。 由于乳酸鏈球菌素、溶菌素、納他霉素等微生物源抑菌物質(zhì)在食品儲存或加工過程中存在容易降解的問題,降低了抗菌活性,限制了使用范圍,微膠囊技術(shù)可增加穩(wěn)定性、防止失活[50]。 Wu等[51]發(fā)現(xiàn)殼聚糖——Nisin 微膠囊比單獨使用Nisin對微生物生長的抑制效果高,保存效果較好。 因此,依據(jù)豆制品致腐微生物的種類,通過對不同抑菌特性的微生物源保鮮物質(zhì)進行合理組合,再進行微膠囊化,增強抑菌效果,達到穩(wěn)定、高效、廣譜抑制鮮食豆制品腐敗菌的目的。

4 展望

由于制作傳統(tǒng)豆制品的原料大豆、加工過程、儲存環(huán)境等環(huán)節(jié)均是產(chǎn)生豆制品腐敗變質(zhì)的來源。 故在原材料和產(chǎn)品的加工和儲存方面,要加強衛(wèi)生管理,制定精確、可實現(xiàn)的工藝參數(shù),規(guī)范處理流程。高標準和嚴格的車間衛(wèi)生要求才可確保產(chǎn)品質(zhì)量。傳統(tǒng)豆制品在貯藏過程中,在不同貯藏期的腐敗菌不同,隨著貯藏時間的延長,在保存環(huán)境中適宜生長的部分細菌會抑制其他幾種細菌的生長而成為優(yōu)勢腐敗菌,腐敗菌群體系呈現(xiàn)出不同優(yōu)勢菌群的動態(tài)菌相變化。 在應用傳統(tǒng)方法結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)對引起傳統(tǒng)豆制品腐敗變質(zhì)的腐敗菌進行系統(tǒng)的分離和鑒定的基礎(chǔ)上,針對特定腐敗菌進行抑制成為延長傳統(tǒng)豆制品保質(zhì)期的關(guān)鍵之一。 同時,在傳統(tǒng)豆制品生產(chǎn)加工過程中,針對不同的傳統(tǒng)豆制品品質(zhì)及腐敗菌的特點,采用超高溫瞬時殺菌技術(shù)和等離子體殺菌技術(shù)等物理方法近年來日益成為熱點。 同時,微生物源抑菌劑因其安全高效、抑菌效果好等特點日益受到廣泛關(guān)注,并逐漸應用于食品保鮮。 但目前該類抑菌劑在傳統(tǒng)豆制品保鮮中的應用多停留在實驗室研究階段,且一種或一類微生物源抑菌劑存在抗菌譜窄、作用范圍小等問題,限制了研究的深入和應用范圍的拓寬。 將物理方法結(jié)合生物方法抑菌劑對傳統(tǒng)豆制品進行保鮮將成為新的方向。 為有效延長傳統(tǒng)豆制品保質(zhì)期提供獨特的優(yōu)勢,未來的應用前景可期。