李軍?劉雨亮?李靜?李純璞?陶宗玉?張文正?張建?魏開斌

摘? 要：目的? 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究黃芪-川芎藥對治療股骨頭缺血性壞死的分子作用機制。方法? 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP數(shù)據(jù)庫）篩選出黃芪-川芎藥的主要活性成分及作用靶點，應(yīng)用GenneCards數(shù)據(jù)庫與維恩圖獲取黃芪-川芎藥對與股骨頭缺血性壞死的共同作用靶點，運用Cytoscape 3.7.1軟件和STRING數(shù)據(jù)庫進行中藥-疾病-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析，最后進行基因本體（GO）富集分析和基因相互作用（KEGG）通路分析，通過分析得出結(jié)果。結(jié)果? 黃芪-川芎藥對主要通過22種活性成分、38個作用靶點及35個生物學(xué)通路發(fā)揮作用治療股骨頭缺血性壞死。其中主要活性成分為槲皮素、山奈酚和芒柄花素;主要核心靶點為AKT1;關(guān)鍵通路為PI3K-Akt信號通路。結(jié)論? 通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究揭示黃芪-川芎藥對系通過多種成分、多個靶點、多種通路治療股骨頭缺血性壞死，為后續(xù)研究開展試驗工作提供了思路和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);黃芪;川芎;股骨頭缺血性壞死;作用機制

中圖分類號：R285 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1009-8011（2022）-13-00-04

股骨頭缺血性壞死（Avascular necrosis of the femoral head）因其高致殘率、早期保髖方法的療效不理想及其發(fā)病機制的復(fù)雜性，成為目前臨床治療的難題之一。隨著近年來糖皮質(zhì)激素較廣泛的臨床應(yīng)用，導(dǎo)致股骨頭缺血性壞死疾病的發(fā)病率不斷攀升，而早期有效、臨床療效滿意的保髖治療方法亟需探討。目前該疾病保髖治療的現(xiàn)狀：西藥保髖治療僅能改善癥狀，難以阻斷疾病進展;保髖手術(shù)方式創(chuàng)傷大且療效欠佳;而中醫(yī)藥治療具有多種組分、多個靶點、多種機制等特點，在保髖治療方式中具有獨特的優(yōu)勢，并取得了良好的臨床效果，這使得對有效治療的具體藥物及其作用機制進行下一步探討研究尤為重要[1]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為股骨頭缺血性壞死疾病的發(fā)病原因系腎精不足、氣血兩虛、寒濕痰瘀痹阻所致，導(dǎo)致肌肉筋骨失養(yǎng)、氣血滯澀不暢的病機，并將該疾病歸于“骨痹”“骨痿”或“骨蝕”等病證范疇。黃芪-川芎藥對具有益氣健脾補腎，化瘀活血通絡(luò)之功，契合股骨頭缺血性壞死的病理機制。有研究表明，非創(chuàng)傷性股骨頭壞死通過黃芪生骨湯聯(lián)合手術(shù)治療可改善其中醫(yī)證候，有效且安全[2];股骨頭壞死區(qū)的骨內(nèi)壓通過使用黃芪復(fù)方制劑能得到有效降低。川芎的主要成分為川芎嗪，具有增強股骨頭血管化的作用，可有效預(yù)防類固醇藥物誘導(dǎo)的骨壞死。綜上所述，黃芪-川芎藥對是治療股骨頭缺血性壞死疾病的潛在藥物，其具體作用機制有待深入研究。

1? 資料與方法

1.1? 黃芪-川芎藥對的活性成分和靶點檢索與收集

以“中藥名稱”為關(guān)鍵詞在TCMSP系統(tǒng)（https：//tcmsp- e.com/）[3]中檢索黃芪和川芎的組成成分及藥物所含化學(xué)成分信息，設(shè)定閾值口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18作為篩選藥物關(guān)鍵活性化合物的標(biāo)準(zhǔn)，進一步查找黃芪藥物和川芎藥物的化學(xué)成分相對應(yīng)的蛋白作用靶點。最后使用Uniprot數(shù)據(jù)庫給靶點添加基因縮寫，并去除掉重復(fù)靶點，進行規(guī)范化處理。

1.2? 股骨頭缺血性壞死疾病靶點的搜索與收集

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中輸入疾病關(guān)鍵詞“avascular necrosis of the femoral head”，進行搜索并收集相關(guān)靶點。

1.3? 中藥-疾病共有靶點的獲取

采用Venn圖對藥物靶點、疾病靶點一同進行映射，獲取黃芪-川芎藥對治療股骨頭缺血性壞死疾病潛在的作用靶點。

1.4? 構(gòu)建藥物-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

采用Cytoscape 3.7.1軟件，對藥物、活性成分、關(guān)鍵靶基因、疾病及其之間的相互對應(yīng)關(guān)系進行可視化并導(dǎo)出網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5? 構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（Protein- Protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)

將潛在作用靶點導(dǎo)入STRING在線數(shù)據(jù)庫，將物種設(shè)置為人，以“minimum required interaction score>0.700”為條件，分析獲取PPI關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，下載文件并輸出圖形，利用cytohubba插件對核心靶點進行篩選。

1.6? GO生物功能富集分析和KEGG通路分析

基于 Bioconductor中的 R 包ClusterProfiler對核心靶標(biāo)進行基因本體（GO）富集分析和基因相互作用（KEGG）通路分析，選擇P和Q均小于0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。輸出結(jié)果同時并繪制出bubbleplot氣泡圖，分析輸出的結(jié)果，探討黃芪-川芎藥對的潛在作用機制。

2? 結(jié)果

2.1? 黃芪-川芎藥對的活性成分及靶點

通過TCMSP系統(tǒng)檢索后，篩選出黃芪藥物的有效成分17個且相對應(yīng)的作用靶點179個，川芎藥物的有效成分6個且相對應(yīng)的作用靶點29個。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫進行匯總，并刪除篩選出的重復(fù)數(shù)據(jù)，最終檢索結(jié)果為黃芪-川芎藥對的活性成分共計22個，如芒柄花素（formononetin）、槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、異鼠李素（isorhamnetin）、楊梅酮（Myricanone）、川芎哚（Perlolyrine）、谷甾醇（sitosterol）1，7-二羥基-3，9-二甲氧基紫檀烯（1，7-Dihydroxy-3，9-dimethoxy pterocarpene）、毛蕊異黃酮（Calycosin）、聯(lián)苯雙酯（Bifendate）等;相對應(yīng)作用靶點共計181個。

2.2? 股骨頭缺血性壞死疾病靶點

應(yīng)用GeneCards數(shù)據(jù)庫共收集股骨頭缺血性壞死疾病的靶點272個。

2.3? 中藥-疾病共有靶點

將藥物靶點和疾病靶點采用Venn圖映射方式取交集，得到黃芪-川芎藥對治療股骨頭缺血性壞死的潛在作用靶點38個，如KT1、PTGS2、CCL2、IL1B、MMP9、TP53、CXCL8、IFNG等，提示黃芪-川芎藥對可能通過這些潛在作用靶點發(fā)揮其相應(yīng)的治療作用。

2.4? 成分-靶點作用網(wǎng)絡(luò)圖

左邊圓形狀圖標(biāo)中的MOL00433、001404、002135、002140、002157代表川芎藥物的有效活性化學(xué)成分，其他圓形狀圖標(biāo)代表黃芪藥的有效活性化學(xué)成分;右邊方塊形狀圖標(biāo)代表的潛在的作用靶點。圖片清楚地顯示了不同活性化學(xué)成分與不同作用靶點相互作用的一一對應(yīng)關(guān)系，也充分說明了黃芪-川芎藥對是通過多種活性成分、多個作用靶點及多種通路起效的，其中槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）和芒柄花素（formononetin）關(guān)聯(lián)靶點較多，系該藥對中最主要的活性成分。見圖1。

2.5? 網(wǎng)絡(luò)蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

PPI網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2）中包含38個節(jié)點和節(jié)點間相互連接的390條邊，其中節(jié)點代表的是蛋白，邊代表的系蛋白與蛋白間的作用關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)連接程度越高越密集說明蛋白間關(guān)系密切度越高。為尋找出其中的核心蛋白，需再采用 CytoHubba 插件對網(wǎng)絡(luò)圖進行拓撲分析，從而進一步從網(wǎng)絡(luò)圖中篩選出核心蛋白。在網(wǎng)絡(luò)中“度值”（degree）是一種重要的拓撲參數(shù)之一，利用節(jié)點度值的高低來確定網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點，其中網(wǎng)絡(luò)圖中和某個節(jié)點相連的所有節(jié)點的總數(shù)量即表示為某個節(jié)點的度值，該方法常用于評估網(wǎng)絡(luò)中某種成分或目標(biāo)的重要性[4]。因此，篩選條件按Degree進行排列，其中某個節(jié)點的顏色越深且圓形越大，表明該節(jié)點的RANK更靠前，關(guān)鍵性更高。在核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖（見圖3）中度值最高的靶點是AKT1（degree=34），即可認(rèn)為其為核心靶點，黃芪-川芎藥對主要是通過AKT1靶點而發(fā)揮其治療股骨頭缺血性壞死疾病的作用。

2.6? GO富集分析和KEGG通路分析

GO富集中的交集基因主要參與以下生物過程：炎性反應(yīng)、脂多糖、活性氧代謝過程、白細胞細胞間黏附和T細胞活化等（見圖4）。KEGG主要涉及 PI3K-AkT、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE、IL-17和TNF信號通路（見圖5）。其中，PI3K-AkT通路中由于有核心靶點AkT1的參與，該通路被認(rèn)為是黃芪-川芎藥對治療股骨頭缺血性壞死的關(guān)鍵通路。

3? 討論

目前認(rèn)為酒精、激素等誘發(fā)的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等病理改變，造成了股骨頭內(nèi)血管的損傷及成骨的不足，從而導(dǎo)致股骨頭缺血性壞死疾病的發(fā)生，其典型的病理變化為成骨細胞分化的減少、髓內(nèi)脂肪細胞的增強并沉積及骨循環(huán)的受損[5]，最終導(dǎo)致股骨頭塌陷變形，致使患者疼痛、活動受限，嚴(yán)重者患肢致殘，日常生活難以自理，最終要靠全髖關(guān)節(jié)置換解除痛苦，而年輕患者不得不面臨再次置換或返修的風(fēng)險。目前西醫(yī)保髖治療該疾病的療效并不理想，而中醫(yī)藥具有多組分、多靶點、多機制的作用特點，為股骨頭壞死的整體治療方面開拓新思路，通過辨證施治從而取得了較好的療效，受到了患者及家屬的認(rèn)可。目前研究[2]黃芪生骨湯聯(lián)合手術(shù)治療、活血通絡(luò)湯（含黃芪、丹參、川芎、當(dāng)歸、巴戟天、地龍、懷牛膝、雞內(nèi)金）等治療該疾病取得了良好的療效。因此，黃芪-川芎藥對是治療股骨頭缺血性壞死疾病的潛在藥物，開發(fā)中醫(yī)藥治療股骨頭缺血性壞死的新方法以及研究其潛在的作用機制具有非常重要意義[6]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，建立“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，本研究發(fā)現(xiàn)黃芪-川芎藥對治療股骨頭缺血性壞死疾病主要是通過22種活性成分、38個作用靶點及35個生物學(xué)通路發(fā)揮其治療作用。其中槲皮素、山奈酚和芒柄花素為主要活性成分;AKT1為核心靶點;磷酸肌醇3激酶（PI3K）/AKT信號通路為關(guān)鍵信號通路。槲皮素是天然存在的多酚類化合物，文獻報道[7]槲皮素既能通過增加成骨細胞特異性基因的表達而激活成骨細胞的生成作用;又能對破骨細胞的形成、增殖和成熟起抑制作用。其他藥理研究表明槲皮素還具有抗炎、抗氧化劑和免疫調(diào)節(jié)功能，能減輕免疫細胞炎癥因子的分泌，其作用機制與抑制核因子-κB、蛋白激酶B的磷酸化有關(guān);槲皮素對疼痛類疾病的緩解具有良好藥理作用，并且該藥物的不良反應(yīng)小，故其藥用前景較好[8]。山奈酚在多項體外研究中表明其具有引起破骨細胞因子的下調(diào)而發(fā)揮抗破骨細胞活性的作用[9];同時抑制骨髓脂肪細胞的形成;并能刺激前成骨細胞分化和礦化，促進成骨細胞增殖，其機制是通過細胞外調(diào)節(jié)激酶和雌激素受體途徑來提高成骨細胞內(nèi)ALP活性而實現(xiàn)。

芒柄花素作為異黃酮類單體，首先在雞血藤被發(fā)現(xiàn)，研究表明其可通過激活p38絲裂原活化蛋白激酶途徑刺激骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，促進成骨細胞的再生，增加骨量而修復(fù)骨皮質(zhì)缺損，已被前期的研究證明[10];也有近期研究表明芒柄花素對與骨細胞骨吸收相關(guān)的功能基因（如CTSK、TRAP、MMP9、Car 2等）的表達起到顯著的抑制作用，因此被認(rèn)為其同時具有調(diào)控成骨細胞和破骨細胞活性功能，在治療股骨頭壞死導(dǎo)致骨結(jié)構(gòu)破壞和骨塌陷方面具有獨特的優(yōu)勢藥物之一。PI3K/AkT信號通路在細胞的存活、增殖、生長和分化過程中發(fā)揮重要作用，也是骨質(zhì)恢復(fù)再生的重要信號通路，通過調(diào)節(jié)成骨細胞與破骨細胞的增殖分化而促進骨重塑的過程。磷酸酶和緊張素同源物通過PI3K/AKT/VEGF通路調(diào)節(jié)人胰腺癌細胞的血管生成。外泌體依靠激活PI3K/AKT信號通路促進骨再生。人參皂苷可通過PI3K/AKT通路保護過氧化氫誘導(dǎo)的大鼠骨髓干細胞凋亡。LV等[11]證明骨碎補總黃酮可以通過PI3K/AKT通路改善類固醇誘導(dǎo)的股骨頭缺血性壞死。Zhan等[12]發(fā)現(xiàn)大蒜素可以通過激活PI3K/AKT通路來抑制成骨細胞凋亡和類固醇誘導(dǎo)的股骨頭壞死。PI3K-Akt信號通路不僅能增強成骨細胞增殖的活性，而且可促進成骨細胞的分化增殖，其作用機制系通過糖原合成激酶3β來實現(xiàn)Wnt/β-catenin的調(diào)控[13]。此外，該信號通路亦能通過成骨細胞釋放兩種關(guān)鍵的因子：巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受體活化因子配體（RANKL），從而觸發(fā)破骨細胞分化。隨著RANKL同受體結(jié)合后，其下游的信號（NF-κB、JNK、p38MAPK） 就會被相繼激活，誘導(dǎo)破骨細胞的分化。c-fos、活化T細胞核因子1等也調(diào)控其下游信號激酶（NF-κB、p38MAPK） 的表達，影響破骨細胞的分化。故黃芪-川芎藥對能通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路，調(diào)控股骨頭的骨質(zhì)代謝，促使股骨頭壞死區(qū)骨質(zhì)的代謝及新骨的再生。

綜上所述，本文結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)黃芪-川芎藥對中的槲皮素、山奈酚和芒柄花素等活性成分作用于主要的分子靶點AKT1，涉及并參與炎性反應(yīng)、脂多糖、活性氧代謝過程、白細胞細胞間黏附和T細胞活化等多個生物過程，并通過PI3K/AkT信號通路，增加成骨細胞特異性基因的表達，激活成骨細胞的生成作用;同時又對破骨細胞的形成、增殖和成熟起抑制作用，具有調(diào)控成骨細胞和破骨細胞活性的雙層功能，發(fā)揮其對股骨頭缺血性壞死疾病導(dǎo)致骨結(jié)構(gòu)破壞和骨塌陷等方面的獨特優(yōu)勢。相信隨著科學(xué)技術(shù)日新月異的發(fā)展、系統(tǒng)生物學(xué)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的不斷深入與完善，中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論將會獲得更充足的科學(xué)論證。目前雖然股骨頭缺血性壞死疾病的發(fā)病原因、病理變化機制仍未完全明確，但本研究在分子機制上對黃芪-川芎藥對在防治該疾病相關(guān)的相關(guān)機制進行相關(guān)的探討，研究證實該藥對在治療股骨頭壞死方面具有較好的理論價值，以期為后續(xù)具體實驗提供思路和理論依據(jù)。

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