基于線粒體16S r RNA和COI序列的江蘇啟東海域4種貝類遺傳多樣性分析

閆永斌，葛玉雙，程起群，范瑞良，李楠楠，全為民

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306）

貝類的種類極為豐富，具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值，在漁業(yè)產(chǎn)業(yè)和生態(tài)修復(fù)中占有極為重要的地位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年貝類產(chǎn)量超過(guò)1 500萬(wàn)t，占水產(chǎn)品總量的23.7%［1］。日本鏡蛤（Dosinia japonica）、四角蛤蜊（Mactra veneriformis）、西施舌（Coelomactra antiquata）、中 國(guó) 蛤 蜊（Mactra chinensis）隸屬于軟體動(dòng)物門（Mollusca），雙殼綱（Bivalvia），簾蛤目（Veneroida），主要分布在中國(guó)、韓國(guó)、朝鮮、日本以及俄羅斯遠(yuǎn)東海域，且分布區(qū)多有重疊［2-5］，這4種貝類都具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，尤以西施舌為貴。受過(guò)度捕撈等因素的影響，這4種貝類的野生種群狀況堪憂：日本鏡蛤和西施舌的資源量不斷減少，呈現(xiàn)不斷衰減的趨勢(shì)；四角蛤蜊的產(chǎn)量也逐年下降［2，4］；中國(guó)蛤蜊由于野生種群的生存受到威脅，而養(yǎng)殖的蛤蜊幼苗依舊需要靠野外采捕得到，因此苗種的稀少也阻礙了中國(guó)蛤蜊增養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展［4］。除了經(jīng)濟(jì)價(jià)值外，貝類的生態(tài)價(jià)值也極其重要。貝類可通過(guò)降低水體中顆粒有機(jī)物（藻類和有機(jī)碎屑）的濃度，間接控制氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度，耦合水層-底棲環(huán)境，保護(hù)生物多樣性和營(yíng)造生物生境，并且承擔(dān)了生態(tài)系統(tǒng)中的部分固碳功能，在水體生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)中起到重要的作用［6-8］。

遺傳多樣性是指同一物種不同種群間、同一群體不同個(gè)體間遺傳變異的總和，是物種和種群適應(yīng)環(huán)境變化的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，是生物多樣性的重要組成部分［9-10］。貝類的遺傳多樣性，不僅反映其本身的資源狀況，還會(huì)對(duì)水域生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的變化產(chǎn)生影響。因此，開(kāi)展貝類遺傳多樣性的調(diào)查研究，具有重要的意義。動(dòng)物mtDNA具有母系遺傳、進(jìn)化速度快、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子量小等特點(diǎn)，常被用于物種遺傳多樣性等領(lǐng)域的研究；其中的16SrRNA（16Sribosomal RNA）和COI（細(xì)胞色素氧化酶I亞基，cytochrome oxidase subunit I）基因是貝類遺傳多樣性領(lǐng)域中應(yīng)用較廣的分子標(biāo)記［4，9-10］。

有關(guān)日本鏡蛤、四角蛤蜊、西施舌和中國(guó)蛤蜊等4種貝類的研究，主要集中在生殖發(fā)育、繁殖生物學(xué)、生藥學(xué)、增養(yǎng)殖技術(shù)等方面［4，11-12］；染色體核型分析、重金屬積累、寄生蟲(chóng)病、免疫等方面的研究也有若干報(bào)道［4，13］。而涉及遺傳多樣性的文獻(xiàn)較少，僅見(jiàn)國(guó)內(nèi)有若干關(guān)于四角蛤蜊、西施舌和中國(guó)蛤蜊的研究［3-4，9-14］。本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增并測(cè)序啟東海域的日本鏡蛤、四角蛤蜊、西施舌和中國(guó)蛤蜊等4種貝類的16S rRNA和COI基因片段，調(diào)查分析其遺傳多樣性狀況，以期為啟東海域貝類種質(zhì)資源的管理、保護(hù)和監(jiān)測(cè)提供參考依據(jù)，進(jìn)而為精準(zhǔn)制定相關(guān)的管理和保護(hù)措施提供科學(xué)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2019年8月6—14日，在江蘇省啟東海域（31°39.616′～32°08.474′N、121°44.742′～122°09.980′E）設(shè)置27個(gè)采樣點(diǎn)，以采集各種貝類樣本，其中包括日本鏡蛤、四角蛤蜊、中國(guó)蛤蜊和西施舌樣本共2 031只。樣本取回后，放置在-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取

從所采集的2 031只貝類樣本中，隨機(jī)選取日本鏡蛤、四角蛤蜊、中國(guó)蛤蜊和西施舌樣品各30只（以各物種中文名稱的首字母作為編號(hào)，分別編號(hào)為：R1～R30、S1～S30、Z1～Z30、X1～X30）。取閉殼肌組織；用海洋動(dòng)物組織基因組DNA試劑盒（天根公司）提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〔襟E按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 線粒體16Sr RNA和COI基因序列的PCR擴(kuò)增與測(cè)序

分別用通用引物或自行設(shè)計(jì)的引物，對(duì)4種貝類的16SrRNA和COI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物信息見(jiàn)表1。由于COI通用引物對(duì)西施舌樣本的擴(kuò)增效果不佳，故西施舌COI標(biāo)記的擴(kuò)增引物需自行設(shè)計(jì)（在NCBI網(wǎng)站下載1條西施舌線粒體COI基因序列，序列號(hào)為FJ653656.1，然后基于該基因兩端的保守序列，利用軟件Primer Premier 6設(shè)計(jì)、優(yōu)化西施舌的COI擴(kuò)增引物），引物在上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

PCR反應(yīng)總體積為25μL，包括Taq酶預(yù)混液12.5μL，正反引物各1μL，DNA模板3μL，雙蒸水7.5μL。PCR擴(kuò)增程序見(jiàn)表2。

表2 PCR擴(kuò)增程序Tab.2 PCR amplification program

PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物與PCR引物相同。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)ClustalX（Version1.83）［17］軟件進(jìn)行多序列比對(duì)和分析，采用MEGA X［18］軟件確定各序列的堿基組成、多態(tài)位點(diǎn)及個(gè)體間遺傳距離等。采用DNASP v5.0［19］軟件計(jì)算單倍型個(gè)數(shù)（H），單倍型多樣性（Hd），核苷酸多樣性（Pi）和平均核苷酸差異數(shù)（k）等遺傳多樣性參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

日本鏡蛤、四角蛤蜊、中國(guó)蛤蜊和西施舌4種貝類的PCR擴(kuò)增電泳圖見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，4種貝類均可擴(kuò)增出與預(yù)期片段大小一致的目的片段。其中16SrRNA長(zhǎng)度均約為300 bp；而COI標(biāo)記由于采用的引物不同，擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)度有差異，日本鏡蛤、四角蛤蜊和中國(guó)蛤蜊擴(kuò)增長(zhǎng)度均約為665 bp，而西施舌長(zhǎng)度約為505 bp。

圖1 線粒體標(biāo)記PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 PCR products of mtDNA genes

2.2 序列變異特征

絕大部分PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果良好，符合分析要求。最終用于分析的序列數(shù)分別為：1）16SrRNA基因標(biāo)記：四角蛤蜊30條、中國(guó)蛤蜊30條、日本鏡蛤29條、西施舌29條；2）COI基因標(biāo)記：四角蛤蜊28條、中國(guó)蛤蜊29條、日本鏡蛤30條、西施舌30條。平均堿基組成見(jiàn)表3。

由表3可知，4種貝類的16SrRNA和COI基因片段的堿基組成結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出A＋T明顯高于C＋G、且C的比例都是最低的特點(diǎn)，而兩種基因片段不同之處在于堿基A和T比例的不同，在16SrRNA基因片段中A與T的比例相差不大，而在COI基因片段中T的比例明顯高于A的比例。

表3 4種貝類16S r RNA和COI基因片段序列平均堿基含量Tab.3 Average base composition of 16Sr RNA and COI gene fragments of four shellfishes （%）

2.3 4種貝類的遺傳多樣性分析

由表4可知，就16S rRNA而言，四角蛤蜊單倍型多樣性最高（Hd＝0.933），中國(guó)蛤蜊最低（Hd＝0.411），日本鏡蛤與西施舌相差不大；而西施舌核苷酸多樣性最高（Pi＝0.009 37），中國(guó)蛤蜊最低（Pi＝0.001 74），四角蛤蜊與日本鏡蛤相差不大。COI基因結(jié)果顯示，四角蛤蜊單倍型多樣性最高（Hd＝1.000），中國(guó)蛤蜊最低（Hd＝0.874），日本鏡蛤與西施舌相差不大；西施舌核苷酸多樣性最高（Pi＝0.013 47），中國(guó)蛤蜊最低（Pi＝0.003 49）。

表4 基于16S r RNA和COI基因片段的4種貝類遺傳多樣性分析Tab.4 Analysis of genetic diversity based on 16S r RNA and COI gene fragments

3 討論

國(guó)外已有學(xué)者對(duì)雙殼類mtDNA、16S rRNA及COI基因序列開(kāi)展研究［20-21］。本研究擴(kuò)增測(cè)定了日本鏡蛤、四角蛤蜊、中國(guó)蛤蜊和西施舌的16SrRNA及COI基因片段序列，分析了各個(gè)物種之間的差異以及同一物種不同標(biāo)記之間的差異，初步得到了啟東海域4種貝類的遺傳多樣性本底信息，為該地區(qū)貝類資源管理、保護(hù)和監(jiān)測(cè)工作提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

3.1 堿基組成分析

有關(guān)無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體全基因組測(cè)序的報(bào)道均顯示，其基因序列堿基組成比例為A＋T＞G＋C。且對(duì)于16S rRNA基因，rRNA的生物學(xué)活性不僅依賴于DNA序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)，也依賴于二級(jí)甚至三級(jí)結(jié)構(gòu)。rRNA基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)由多個(gè)大小不一的莖環(huán)組成，通過(guò)G-C、A-U甚至不太穩(wěn)定的G-U配對(duì)來(lái)維持，其二級(jí)結(jié)構(gòu)中的環(huán)富含A，而莖富含G，由于G-C之間氫鍵的作用力大于A-U和G-U，因此莖中富含G有利于維持其二級(jí)結(jié)構(gòu)［22-23］。

本研究結(jié)果亦顯示，4種貝類16S rRNA和COI標(biāo)記的堿基比例都是A＋T＞C＋G，這與無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體DNA堿基組成特點(diǎn)相符［3］。從16SrRNA標(biāo)記看，堿基A與T的比例相差不大，但堿基G的比例大于C，該堿基比例與孟學(xué)平等［4］對(duì)西施舌、中國(guó)蛤蜊和四角蛤蜊的研究結(jié)果以及陳淑吟等［10］對(duì)西施舌的研究結(jié)果大致相似，符合rRNA堿基組成特點(diǎn)。從COI標(biāo)記看，堿基T的比例大于A，堿基G的比例大于C。該堿基比例與朱立靜等［3］對(duì)四角蛤蜊的研究結(jié)果相似，與陳淑吟等［10］對(duì)西施舌的研究結(jié)果有一定差異，但總體比例相差不大，而與王帥［14］對(duì)西施舌長(zhǎng)樂(lè)群體的研究結(jié)果差異較大，其結(jié)果顯示，西施舌COI基因A／G／C／T所占的比例分別為42.27%、15.32%、21.41%、21.00%，原因可能是西施舌長(zhǎng)樂(lè)群體與其他群體遺傳分化距離較遠(yuǎn)。

3.2 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性不僅是形成生物多樣性的基礎(chǔ)，也是物種進(jìn)化潛能的保證，核苷酸多樣性（Pi）表示每個(gè)群體內(nèi)各個(gè)單倍型的兩兩配對(duì)差異的平均值，是衡量群體遺傳多樣性的一個(gè)重要指標(biāo)［24］；兩個(gè)隨機(jī)群體選取的mtDNA序列間核苷酸多樣性值越小，群體的遺傳多樣性越低。核苷酸多樣性指數(shù)Pi值考慮了各種mtDNA單倍型在群體中所占的比例，能夠精確反映一個(gè)群體mtDNA的多態(tài)程度［25］。GRANT和BOWEN［26］根據(jù)單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（Pi）兩者的關(guān)系將種群事件分為4種模式：第一類為Hd和Pi均低（Hd＜0.5，Pi＜0.005）；第二類為Hd高而Pi低；第三類為Hd低而Pi高；第四類為Hd和Pi均高。

本研究中，從16S rRNA基因來(lái)看，西施舌、四角蛤蜊和日本鏡蛤的單倍型多樣性水平較高（Hd＞0.5），核苷酸多樣性水平也較高（Pi＞0.005），屬于第四類情況，其遺傳多樣性處于一個(gè)較高的水平；而中國(guó)蛤蜊的單倍型多樣性水平（Hd＜0.5）和核苷酸多樣性水平（Pi＜0.005）均較低，屬于第一類情況，表明其最近發(fā)生了種群瓶頸效應(yīng)或由單一、少數(shù)系群所發(fā)生的創(chuàng)立者效應(yīng)（founder effect）。從COI基因來(lái)看，西施舌和四角蛤蜊的單倍型多樣性水平較高（Hd＞0.5），并且核苷酸多樣性水平也較高（Pi＞0.005），屬于第四類情況，其遺傳多樣性水平較高；而日本鏡蛤和中國(guó)蛤蜊的單倍型多樣性水平較高（Hd＞0.5）而核苷酸多樣性水平較低（Pi＜0.5），屬于第二類情況，可能是經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)后，種群的迅速生長(zhǎng)和基因突變的積累導(dǎo)致的。

陳淑吟等［10］在2007年對(duì)西施舌啟東群體的16SrRNA和COI基因標(biāo)記的遺傳多樣性進(jìn)行了調(diào)查，其核苷酸多樣性指數(shù)Pi分別為0.005 49和0.009 22，均比本實(shí)驗(yàn)結(jié)果低，其中16S rRNA基因標(biāo)記可能是因?yàn)閿U(kuò)增所用的引物序列不同，導(dǎo)致結(jié)果有所差異，而COI基因標(biāo)記提示西施舌啟東群體10多年后COI基因片段的變異程度有所提高，這可能由取樣位點(diǎn)的差異或取樣方法的不同導(dǎo)致，也可能是線粒體基因組遺傳變異的結(jié)果［12］。朱立靜等［3］從COI基因標(biāo)記的角度對(duì)四角蛤蜊的南通群體和連云港群體的遺傳多樣性進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示，其核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.007 74和0.004 56，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其相差不大。王帥［14］從COI基因角度對(duì)西施舌山東群體和長(zhǎng)樂(lè)群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.007 315±0.006 113，0.004 661±0.003 247，與本實(shí)驗(yàn)相比，山東群體的四角蛤蜊遺傳多樣性水平更接近啟東群體，而長(zhǎng)樂(lè)群體的遺傳多樣性水平較低。這可能是因?yàn)樵诘乩矸植忌?，啟東群體與山東群體的距離較近，而遺傳分化距離也較近，而與長(zhǎng)樂(lè)群體的遺傳分化距離較遠(yuǎn)。

3.3 貝類遺傳多樣性與生態(tài)系統(tǒng)功能之間的關(guān)系

生物多樣性與生態(tài)系統(tǒng)功能的關(guān)系是生態(tài)學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，了解和掌握生物多樣性與生態(tài)系統(tǒng)功能的關(guān)系及其內(nèi)在機(jī)制對(duì)于生物多樣性、生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)及其合理利用意義重大。生物多樣性包括遺傳多樣性、物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性，遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，但目前研究多集中于物種多樣性與生態(tài)系統(tǒng)功能的關(guān)系上，有關(guān)遺傳多樣性與生態(tài)系統(tǒng)功能之間的關(guān)系研究?jī)H局限于植物研究中［27］。

貝類的生態(tài)作用通常體現(xiàn)在水體生態(tài)中，可降低水體中顆粒有機(jī)物（藻類和有機(jī)碎屑）的濃度，間接控制氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度，耦合水層—底棲環(huán)境，保護(hù)生物多樣性和營(yíng)造生物生境，因此貝類是一種常用的水體生態(tài)修復(fù)治理生物，并且承擔(dān)了生態(tài)系統(tǒng)中一部分的固碳作用。貝類的生態(tài)修復(fù)功能多以貽貝（Mytilus edulis）和牡蠣科貝類為主體［6］，而簾蛤目貝類的生態(tài)作用主要為固碳效應(yīng)，并且可以耦合水層—底棲環(huán)境。與森林的固碳作用相比，貝類所固定的碳在自然過(guò)程中不易釋放，能夠在較長(zhǎng)的時(shí)間產(chǎn)生作用［28］，且據(jù)張繼紅等［7］對(duì)貝類固碳作用進(jìn)行的核算和研究，蛤蜊對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中碳的固定作用是相當(dāng)明顯的。另一方面，貝類將水體中的懸浮物質(zhì)通過(guò)消化道，經(jīng)重新“包裝”后將這些顆粒物以糞便的形式運(yùn)回水體，從而將水層環(huán)境和底棲環(huán)境聯(lián)系起來(lái)［8］，糞粒有機(jī)質(zhì)可能是無(wú)脊椎動(dòng)物消費(fèi)者獲得能量的重要來(lái)源之一，因此會(huì)影響底棲動(dòng)物的生長(zhǎng)與分布。并且在一些大規(guī)模的貝類養(yǎng)殖海區(qū)，當(dāng)水交換受到限制時(shí)，貝類所排出的糞便聚積于海底，進(jìn)而導(dǎo)致氧的消耗和大型底棲生物數(shù)量的減少［29］。

綜上，貝類的遺傳多樣性不僅反映其自身的資源狀況，還會(huì)間接影響水域生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能狀況，具有重要的研究意義。本研究通過(guò)對(duì)江蘇省啟東地區(qū)4種貝類的16S rRNA及COI基因片段序列進(jìn)行分析，初步掌握其遺傳多樣性狀況，研究結(jié)果可為當(dāng)?shù)氐呢愵惙N質(zhì)資源監(jiān)測(cè)、保護(hù)以及海域生態(tài)修復(fù)提供數(shù)據(jù)支持。