王詩(shī)琳 于玲莉 成殷

摘 要 細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品是個(gè)體化產(chǎn)品，產(chǎn)量小、效期短，無(wú)菌檢查需采用快速檢查法。本文介紹細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品的快速無(wú)菌檢查方法及其制造商在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中可能會(huì)遇到的主要問(wèn)題，供業(yè)界和監(jiān)管部門(mén)參考。

關(guān)鍵詞 細(xì)胞治療 快速微生物檢查 無(wú)菌

中圖分類號(hào)：R951； R927.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：C 文章編號(hào)：1006-1533（2022）11-0014-03

引用本文 王詩(shī)琳， 于玲莉， 成殷. 快速無(wú)菌檢查方法在細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品中的應(yīng)用及監(jiān)管概述[J]. 上海醫(yī)藥， 2022， 43（11）： 14-16； 35.

Application and regulation of rapid sterility test in cell and gene therapy products

WANG Shilin， YU Lingli， CHENG Yin

（Shanghai Center for Drug Evaluation and Inspection， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Cell and gene therapy products are individualized products with low yield and short shelf life. Rapid test is needed for sterility test. This article introduces the rapid sterility test of cell and gene therapy products and the main problems that the manufacturers may encounter in the actual application process so as to provide reference for the industry and regulatory authorities.

KEY WORDS cell therapy； rapid microbial examination； sterility

細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品是個(gè)體化產(chǎn)品，產(chǎn)量小、效期短，無(wú)菌檢查需采用快速檢查法。本文介紹細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品的快速無(wú)菌檢查方法及其制造商在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中可能會(huì)遇到的主要問(wèn)題，供業(yè)界和監(jiān)管部門(mén)參考。

1 細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品

在我國(guó)，細(xì)胞治療產(chǎn)品不包含輸血用血液成分、未經(jīng)體外處理的移植用造血干細(xì)胞、生殖相關(guān)細(xì)胞，以及由細(xì)胞組成的組織、器官類產(chǎn)品等[1]。

2 快速無(wú)菌檢查方法

快速無(wú)菌檢查方法包括三磷酸腺苷生物發(fā)光成像法、流式細(xì)胞術(shù)法、等溫微量熱法、實(shí)時(shí)定量核酸擴(kuò)增法、基于呼吸作用的無(wú)菌檢測(cè)方法、固相細(xì)胞計(jì)數(shù)法[2]、同源序列核酸擴(kuò)增法[3]、羧基熒光素二醋酸酯和4， 6-二脒基-2-苯基吲哚雙染色熒光計(jì)數(shù)法[4]等（表1）。

目前，對(duì)細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品的快速無(wú)菌檢查主要采用商業(yè)化的儀器或設(shè)備進(jìn)行，其中以基于呼吸作用的無(wú)菌檢測(cè)方法最常用，所用技術(shù)主要包括：①基于二氧化碳底物顯色的檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)儀器配套的專用培養(yǎng)瓶進(jìn)行微生物培養(yǎng)，微生物增殖后產(chǎn)生的二氧化碳引起瓶?jī)?nèi)H+濃度變化，瓶底的顯色硅膠感應(yīng)器與H+結(jié)合而發(fā)生顏色變化，從而被儀器檢測(cè)和記錄。②基于熒光增強(qiáng)顯示的檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)儀器配套的專用培養(yǎng)瓶進(jìn)行微生物培養(yǎng)，微生物增殖后產(chǎn)生的二氧化碳引起瓶底熒光底物的光強(qiáng)度和波長(zhǎng)變化，從而被儀器檢測(cè)和記錄。

3 國(guó)內(nèi)外對(duì)細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品快速無(wú)菌檢查法的監(jiān)管要求

3.1 國(guó)內(nèi)監(jiān)管要求

2021年10月國(guó)家藥典委員會(huì)公布的《細(xì)胞類制品微生物檢查法草案擬公示稿》[5]中指出，采用快速微生物檢查法進(jìn)行細(xì)胞類制品放行檢查，應(yīng)充分考慮細(xì)胞類制品的生產(chǎn)工藝、無(wú)菌保障水平、微生物污染風(fēng)險(xiǎn)和使用者的獲益風(fēng)險(xiǎn)比等因素，基于風(fēng)險(xiǎn)有條件地施行。

2022年1月，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局公布了《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范-細(xì)胞治療產(chǎn)品附錄（征求意見(jiàn)稿）》[6]，對(duì)細(xì)胞治療產(chǎn)品從供者物料的運(yùn)輸、接收，產(chǎn)品的生產(chǎn)、檢驗(yàn)，到成品的放行、儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)娜^(guò)程提出了質(zhì)量控制的要求。

3.2 國(guó)外監(jiān)管法規(guī)

美國(guó)藥典42版-國(guó)家處方集37版通則<1071>《短效期產(chǎn)品放行的快速微生物檢查：依據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方法》[2]中指出，快速微生物檢查應(yīng)基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估施行，其可用于中間過(guò)程控制，作為獲得無(wú)菌結(jié)果和對(duì)污染及早發(fā)現(xiàn)、及早控制的手段。

歐盟藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄2《人用生物原料藥和藥品的生產(chǎn)》[7]中指出，對(duì)于短效期和終產(chǎn)品需要提前進(jìn)行批認(rèn)證的生物藥品，應(yīng)考慮采用其他等效的方法，包括快速微生物檢查法。可在兩個(gè)或多個(gè)階段進(jìn)行批認(rèn)證和放行。

3.3 驗(yàn)證要求

在以快速無(wú)菌檢查法替代現(xiàn)行中國(guó)藥典的無(wú)菌檢查方法前，制造商必須開(kāi)展快速無(wú)菌檢查法替代中國(guó)藥典無(wú)菌檢查方法的驗(yàn)證工作，定性驗(yàn)證參數(shù)包括專屬性、檢測(cè)限、耐用性、重現(xiàn)性等。制造商可參考中國(guó)藥典2020年版通則9201[8]、美國(guó)藥典40版-國(guó)家處方集35版通則<1223>[9]、歐洲藥典9.2版通則5.1.6[10]、歐洲藥典10.3版通則2.6.27[11]和美國(guó)注射劑協(xié)會(huì)第33號(hào)技術(shù)報(bào)告[12]等中的相關(guān)要求開(kāi)展驗(yàn)證（表2）。須確認(rèn)快速無(wú)菌檢查法的應(yīng)用效果優(yōu)于或至少等同于傳統(tǒng)無(wú)菌檢查法。A636CD05-F3BB-4D7F-830D-328A56D78017

4 制造商在應(yīng)用快速無(wú)菌檢查方法過(guò)程中遇到的主要問(wèn)題

細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品的制造商在應(yīng)用快速無(wú)菌檢查方法的過(guò)程中會(huì)遇到各種問(wèn)題，概括起來(lái)主要包括以下幾項(xiàng)。

1）樣品成本

中國(guó)藥典2020年版通則9201[8]中指出，替代方法學(xué)驗(yàn)證參數(shù)應(yīng)包括專屬性、檢測(cè)限、耐用性和重現(xiàn)性。驗(yàn)證試驗(yàn)需要使用大量的樣品，而細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品的產(chǎn)量極小且成本極高，傳統(tǒng)的無(wú)菌檢查法的取樣方案并不適用。中國(guó)藥典要求盡量使用產(chǎn)品進(jìn)行無(wú)菌檢查，但因其單次產(chǎn)量極小，現(xiàn)階段也接受具有代表性的供試品，如在生產(chǎn)過(guò)程中不同的點(diǎn)取樣和最終制劑取樣的檢查方案[13]。

2）菌株濃度

中國(guó)藥典2020年版通則9201[8]中指出，檢測(cè)限試驗(yàn)中接種的試驗(yàn)菌為每單位不超過(guò)5 CFU，以達(dá)到接種后采用中國(guó)藥典方法在50%的樣品中即可檢出該試驗(yàn)菌的效果。因此，檢測(cè)限試驗(yàn)中通常需要設(shè)置極低的菌株濃度，如每單位不超過(guò)2 CFU，但實(shí)際上很難配制恰好符合要求的菌株濃度。此外，當(dāng)菌株濃度極低時(shí)，使用胰酪大豆胨瓊脂平皿培養(yǎng)的需氧菌計(jì)數(shù)結(jié)果可能不準(zhǔn)確。為了覆蓋試驗(yàn)所需菌株濃度，通常需要進(jìn)行多梯度稀釋，而這會(huì)增加樣品的損耗。目前少有商業(yè)化的適用于檢測(cè)限驗(yàn)證的各種固定濃度的菌株，通常需要制造商自己配制。

3）取樣量

中國(guó)藥典2020年版通則9201[8]中并未提及快速無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證的樣品接種量，而其實(shí)際接種量有別于傳統(tǒng)的無(wú)菌檢查法，制造商一般會(huì)參照國(guó)外藥典的要求設(shè)置接種量。驗(yàn)證時(shí)每份培養(yǎng)基的產(chǎn)品接種量應(yīng)與產(chǎn)品放行時(shí)的快速無(wú)菌檢查法一致。對(duì)于單個(gè)容器且總體積在1 ～ 1 000 mL的單一批次細(xì)胞治療產(chǎn)品，接入每份培養(yǎng)基的產(chǎn)品量有一定的要求（表3）[11]。

4）放行策略

制造商必須對(duì)快速無(wú)菌檢查法和傳統(tǒng)的無(wú)菌檢查法進(jìn)行比較和評(píng)估，必要時(shí)同步進(jìn)行相互的驗(yàn)證[14]。在兩法平行施行期間，應(yīng)以現(xiàn)行中國(guó)藥典規(guī)定的無(wú)菌檢查法檢查結(jié)果為產(chǎn)品無(wú)菌檢查的最終判定依據(jù)。應(yīng)關(guān)注兩法檢查結(jié)果不一致的供試品，對(duì)檢查過(guò)程進(jìn)行充分的調(diào)查。

5）方法的再確認(rèn)或再驗(yàn)證

為保證快速無(wú)菌檢查方法在供試品無(wú)菌檢查過(guò)程中的適用性，應(yīng)關(guān)注生產(chǎn)和檢查過(guò)程中可能對(duì)方法適用性有影響的因素的變更或變化，如生產(chǎn)工藝變更、無(wú)菌檢查方法修訂、供試品變更等。應(yīng)評(píng)估這些變更或變化是否會(huì)影響快速無(wú)菌檢查方法的靈敏度、重現(xiàn)性等，并依據(jù)評(píng)估結(jié)果對(duì)方法進(jìn)行全面或部分的再確認(rèn)或再驗(yàn)證[15]。

5 結(jié)語(yǔ)

細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品產(chǎn)量小、效期短的特點(diǎn)決定了對(duì)該類產(chǎn)品施行快速無(wú)菌檢查法是必要的。不過(guò)，目前國(guó)內(nèi)制造商進(jìn)行快速無(wú)菌檢查法方法學(xué)驗(yàn)證的難度不小，須解決技術(shù)上的難題，積累足夠的驗(yàn)證試驗(yàn)數(shù)據(jù)，為縮短快速無(wú)菌檢查法與現(xiàn)行中國(guó)藥典無(wú)菌檢查法的平行施行期打下基礎(chǔ)，并與監(jiān)管部門(mén)一起共同促進(jìn)細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品相關(guān)法規(guī)體系的升級(jí)，保障人民的生命健康和用藥安全。

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