張小全 賈振宇 李舉旭 李洪臣 王豹祥 汪 健 石 剛 王 川 武云杰

（1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，450002，河南鄭州；2河南省煙草公司三門(mén)峽市公司，472000，河南三門(mén)峽；3湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，430040，湖北武漢；4安徽皖南煙葉有限責(zé)任公司，242000，安徽宣城）

與國(guó)外優(yōu)質(zhì)煙葉相比，我國(guó)煙葉鉀含量普遍較低，提鉀增質(zhì)是煙葉生產(chǎn)技術(shù)的研究熱點(diǎn)[1-3]。皖南煙區(qū)是中國(guó)典型的濃香型煙葉產(chǎn)區(qū)，煙葉具有獨(dú)特的焦甜香風(fēng)格，但鉀含量總體偏低[4]，提高鉀含量是急需解決的問(wèn)題。鉀含量受品種、氣候、土壤和鉀肥施用技術(shù)等多種因素的影響[2-3,5]，人們從農(nóng)藝措施、施肥技術(shù)、理化調(diào)控和土壤改良等角度研究提高煙葉鉀含量[1]。煙株生長(zhǎng)所需的鉀大部分來(lái)源于土壤，因此，培育發(fā)達(dá)的根系、增強(qiáng)根系吸收能力是提高鉀含量的技術(shù)措施之一[1,6]。大量研究[7-8]表明，黃腐酸鉀能提高根系活力，促進(jìn)根系發(fā)育，能有效促進(jìn)煙株對(duì)鉀的吸收，提高煙葉干物質(zhì)累積量和鉀含量。γ-聚谷氨酸作為肥料增效劑具有富集和促進(jìn)養(yǎng)分吸收、提高養(yǎng)分利用率等作用[9-10]。團(tuán)棵期豆?jié){灌根可以有效促進(jìn)烤煙根系與地上部的生長(zhǎng)發(fā)育，提高煙葉鉀含量和品質(zhì)[11-12]。

煙葉成熟期是決定煙株鉀積累和煙葉鉀含量的關(guān)鍵時(shí)期[3]。煙株進(jìn)入成熟期后，由于土壤對(duì)鉀的礦化固定、速效鉀隨水分流失、根系活力變化以及前期鉀的大量吸收等原因，通常出現(xiàn)根際的速效鉀供應(yīng)不足，成熟期干物質(zhì)積累的同時(shí)對(duì)鉀的積累減緩或下降，且鉀在煙葉中的分配率降低，在非經(jīng)濟(jì)器官中的分配率升高[13-15]，導(dǎo)致中后期煙葉鉀含量偏低。生產(chǎn)上通常采用追施鉀肥、根區(qū)施肥和噴施葉面鉀肥等方法來(lái)提高鉀含量[16-17]。眾多研究聚焦在探索不同促根措施對(duì)煙株早期的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量和質(zhì)量的影響上，而關(guān)于不同促根措施對(duì)烤煙成熟期鉀吸收利用機(jī)制深入的研究較少。鑒于此，本試驗(yàn)研究了皖南煙區(qū)在正常施肥基礎(chǔ)上增施黃腐酸鉀、γ-聚谷氨酸和豆?jié){灌根促根措施對(duì)烤煙成熟期根系生理、烤后煙葉鉀含量、煙株不同部位鉀積累量、鉀離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)的影響，探明不同促根措施對(duì)皖南烤煙成熟期鉀代謝的影響機(jī)制，為皖南優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試烤煙品種為當(dāng)?shù)刂髟云贩N云煙97，由安徽皖南煙葉有限責(zé)任公司提供。肥料為煙草專(zhuān)用有機(jī)無(wú)機(jī)復(fù)合肥（N:P:K=5:8:12，有機(jī)質(zhì)含量20%）。黃腐酸鉀為礦源黃腐酸鉀（黃腐酸含量52%，氧化鉀含量20%），γ-聚谷氨酸含量8%，豆?jié){為每千克黃豆加9kg水磨碎后密封保存，經(jīng)腐熟發(fā)酵10d后得到（有機(jī)質(zhì)674.3g/kg，磷 14.6g/kg，鉀 14.1g/kg）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年在安徽省宣城市鄂皖黃鶴樓煙葉高科技示范園（118°99′E，31°22′N(xiāo)）進(jìn)行。試驗(yàn)地土壤為黃棕壤，質(zhì)地為壤土，前茬為水稻，土壤pH 6.23、有機(jī)質(zhì)24.90g/kg、全氮1.65g/kg、堿解氮146.90mg/kg、速效磷35.29mg/kg、速效鉀184.25mg/kg。起壟前條施復(fù)合肥1350kg/hm2，移栽后35d壟上撒施復(fù)合肥750kg/hm2，并及時(shí)培土3～5cm。

采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。CK處理為常規(guī)施肥；TPFA處理為常規(guī)施肥基礎(chǔ)上添加黃腐酸鉀3.0kg/hm2，每40g對(duì)水定容至100L，移栽時(shí)每株穴灌500mL；TPGA處理為常規(guī)施肥基礎(chǔ)上添加γ-聚谷氨酸150L/hm2，每2L原液對(duì)水定容至100L，移栽時(shí)每株穴灌500mL；TSRI處理為常規(guī)施肥基礎(chǔ)上豆?jié){灌根150kg/hm2，每千克黃豆加工成發(fā)酵豆?jié){后用水定容至50L，移栽后30d每株灌根500mL。小區(qū)面積為120.00m2，行距120.00cm，株距50.00cm，小區(qū)為4行區(qū)，每小區(qū)植煙200株，田間重復(fù)2次。于3月28日移栽，煙株第1朵中心花開(kāi)放50%時(shí)打頂，每株留16片葉，其他田間管理按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)技術(shù)方案執(zhí)行。待煙葉成熟時(shí)，各小區(qū)分別收獲，按密集烘烤工藝進(jìn)行烘烤。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

在進(jìn)入成熟期時(shí)（移栽后95d），每個(gè)處理選取12株生長(zhǎng)一致的煙株，6株用于測(cè)定根鮮重、根體積和根系活力等指標(biāo)；取3株將根、莖和葉分開(kāi)，從下往上數(shù)第1～5片為下部葉，第6～10片為中部葉，第11片及以上為上部葉，105℃下殺青30min，70℃烘干后稱(chēng)干重，用于測(cè)定鉀含量；另3株取從下往上數(shù)第3片葉和第8片葉，從上往下數(shù)第2片葉，各取10g煙葉，并取10g須根（用去離子水清洗干凈），用液氮冷凍后于-80℃保存，重復(fù)3次，用于測(cè)定鉀吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量。

用稱(chēng)重法測(cè)根系鮮重，用排水法測(cè)根系體積，用氯化三苯基四氮唑（TTC）法測(cè)定根系活力[18]。用鹽酸溶液浸提—火焰光度法測(cè)定殺青樣鉀含量。用流動(dòng)分析儀法測(cè)定烤后煙樣品鉀含量。鉀積累量是相同部位的干物質(zhì)積累量乘以相同部位的鉀含量。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定鉀相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量，具體引物信息和方法參照文獻(xiàn)[19]，所有樣品設(shè)置6次重復(fù)，基因相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCT方法計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，并利用SPSS 26.0進(jìn)行One-way ANOVA方差分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理烤煙成熟期根系特性比較

不同處理烤煙成熟期根系特性如表1所示。3個(gè)促根處理的根鮮重（除TPFA外）、根干重和根體積均極顯著高于CK處理，TPGA處理的根鮮重極顯著高于其他處理，較CK處理提高78.36%，TPFA和TPGA處理的根體積極顯著高于TSRI處理。TPFA和TSRI處理的成熟期根系活力顯著高于TPGA和CK處理。說(shuō)明3種促根措施可明顯促進(jìn)烤煙根系發(fā)育。

表1 不同處理烤煙成熟期根系生理特性Table 1 Root physiological characteristics of flue-cured tobacco with different treatments at mature stage

2.2 不同處理烤煙成熟期鉀積累特性差異

由表2可知，煙株不同器官的鉀含量表現(xiàn)為莖＞葉＞根，各處理上部葉和中部葉的鉀含量沒(méi)有顯著差異，在1.41%～1.53%范圍內(nèi)。TPGA和TSRI處理的中部葉鉀含量高于其他處理，且差異不顯著，而莖中的鉀含量顯著高于CK處理。TPGA處理根中的鉀含量顯著高于其他處理。說(shuō)明不同促根措施對(duì)成熟期烤煙根和莖中鉀含量的影響大于對(duì)葉中鉀含量的影響。

表2 不同處理烤煙成熟期不同部位鉀含量Table 2 Potassium contents in different parts of flue-cured tobacco with different treatments at mature stage %

煙株的鉀吸收積累特性不僅與器官的鉀含量相關(guān)，而且與不同器官的鉀積累量密切相關(guān)。不同處理烤煙成熟期不同部位干物質(zhì)積累量見(jiàn)表3。3個(gè)促根處理的單株、根和莖的干物質(zhì)積累量均極顯著高于CK處理，單株總量表現(xiàn)為T(mén)PGA＞TSRI＞TPFA，TSRI處理的根和TPGA處理的莖干物質(zhì)積累量相對(duì)較高。各處理上部葉的干物質(zhì)積累量差異不顯著，3個(gè)促根處理的中部葉干物質(zhì)積累量均極顯著高于CK處理，TPGA處理下部葉干物質(zhì)積累量極顯著高于其他處理。說(shuō)明不同促根措施可顯著促進(jìn)皖南烤煙根和莖的發(fā)育，增加植株干物質(zhì)積累，且不同處理對(duì)中部葉和下部葉干物質(zhì)積累的影響不同。

表3 不同處理烤煙成熟期不同部位干物質(zhì)積累量Table 3 Dry matter accumulation in different parts of flue-cured tobacco with different treatments at mature stage g/株g/plant

不同處理烤煙成熟期不同部位鉀積累量見(jiàn)表4。3個(gè)促根處理的單株和莖中鉀積累量均極顯著高于CK處理，與干物質(zhì)積累表現(xiàn)一致，單株和莖中鉀積累量也是TPGA＞TSRI＞TPFA，3個(gè)促根處理的根中鉀積累量也極顯著高于CK處理，而3個(gè)處理間則差異不顯著。各處理上部葉的鉀積累量差異不顯著，3個(gè)促根處理的中部葉鉀積累量極顯著高于CK處理，TPGA處理中部葉和下部葉鉀積累量極顯著高于其他處理。說(shuō)明不同促根措施可顯著促進(jìn)皖南烤煙成熟期鉀的積累，尤其是促進(jìn)根、莖和中部葉中的鉀積累。

表4 不同處理烤煙成熟期不同部位鉀積累量Table 4 Potassium accumulation in different parts of tobacco with different treatments at mature stage g/株g/plant

不同處理烤后煙葉鉀含量見(jiàn)表5。TSRI處理上部葉中的鉀含量極顯著高于其他處理，較CK處理提高了12.93%，其他處理間差異不顯著。3個(gè)促根處理中部葉的鉀含量均極顯著高于CK處理，TSRI處理極顯著高于TPFA和TPGA處理。TSRI和TPGA處理下部葉的鉀含量分別較CK處理提高8.84%和3.40%，差異達(dá)極顯著水平。說(shuō)明TSRI和TPGA處理對(duì)于提高烤后煙葉的鉀含量具有明顯的作用。

表5 不同處理烤后煙葉鉀含量Table 5 Potassium content of flue-cured tobacco leaves with different treatments %

2.3 不同處理烤煙成熟期鉀離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)差異

2.3.1 鉀離子通道基因 內(nèi)流型鉀離子通道基因NKT1和NtKC1在各處理根中的相對(duì)表達(dá)量均高于葉中的表達(dá)量（圖1a和圖1b）。TSRI處理的上部葉和下部葉中NKT1的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他處理，TPGA和TSRI處理中部葉中NKT1基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他處理，3個(gè)促根處理根中NKT1的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于CK處理，且TPFA處理極顯著高于其他處理。NtKC1在TSRI處理上部葉、TPGA處理中部葉、TPFA和TSRI處理下部葉中的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)應(yīng)部位的其他處理。說(shuō)明3個(gè)促根處理煙株成熟期均保持著較高的鉀吸收水平。

外流型鉀離子通道基因NtORK1在TSRI處理3個(gè)部位葉片中的表達(dá)量極顯著高于其他處理（圖1c），而在根中的相對(duì)表達(dá)量則顯著低于其他處理，說(shuō)明TSRI處理成熟期葉片中的鉀代謝旺盛，鉀外排較多，而根中的鉀則外排較少。TPFA和TPGA處理上部葉和中部葉中NtORK1的相對(duì)表達(dá)量極顯著低于CK處理，鉀外排較少，TPFA處理根中NtORK1的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他處理，鉀外排較多。烤煙成熟期各處理鉀離子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtTPK1在葉片中的表達(dá)量明顯高于根中的相對(duì)表達(dá)量（圖1d）。TSRI處理葉片3個(gè)部位中NtTPK1的相對(duì)表達(dá)量顯著低于其他處理，其中上部葉與下部葉中NtTPK1的相對(duì)表達(dá)量極顯著低于其他處理，在根中的相對(duì)表達(dá)量則極顯著高于其他處理，TPGA下部葉中NtTPK1的相對(duì)表達(dá)量極顯著低于TPFA和CK處理。說(shuō)明TSRI處理成熟期葉片中的鉀離子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)代謝較弱，有利于鉀的積累，而根中的鉀離子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)代謝較強(qiáng)，有利于從土壤中持續(xù)地吸收鉀。

圖1 不同處理烤煙成熟期不同部位鉀離子通道基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 The relative expression levels of potassium ion channel genes in different parts of tobacco at mature stage of different treatments

2.3.2 鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因 3個(gè)促根處理煙株成熟期根中NtHAK1基因的表達(dá)量極顯著高于CK處理（圖2a），而根中NtKT12基因的表達(dá)量則與CK差異不顯著（圖2b）。葉片中2個(gè)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的表達(dá)有較大的差異，3個(gè)促根處理中部葉NtHAK1的相對(duì)表達(dá)量極顯著低于CK處理，TPGA和TSRI處理下部葉NtHAK1的相對(duì)表達(dá)量極顯著低于CK處理，而NtKT12的相對(duì)表達(dá)量則極顯著高于CK處理。說(shuō)明3個(gè)促根處理可提高成熟期煙株根中鉀的轉(zhuǎn)運(yùn)和積累能力。

圖2 不同處理烤煙成熟期不同部位鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 The relative expression levels of potassium transporter genes in different parts of tobacco at mature stage of different treatments

3 討論

煙葉成熟期煙株能否從土壤中吸收充足的速效鉀，是決定煙株鉀積累和煙葉鉀含量的關(guān)鍵[15]。成熟期煙株仍具有發(fā)達(dá)的根系、較強(qiáng)的根系吸收能力和活化土壤礦化鉀的能力，有利于提高煙株鉀積累量和煙葉鉀含量[19]。根系發(fā)達(dá)、分布廣、根毛多則可擴(kuò)大吸收面積，緩解成熟期土壤礦化導(dǎo)致的根際土壤速效鉀供應(yīng)不足的問(wèn)題[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，皖南煙區(qū)在正常施肥的基礎(chǔ)上添加黃腐酸鉀、γ-聚谷氨酸和豆?jié){灌根均可促進(jìn)成熟期煙株根系發(fā)育，提高鉀積累量，尤其是促進(jìn)根和莖中的鉀積累，而對(duì)煙株葉片的鉀含量卻沒(méi)有顯著效應(yīng)，可能與本試驗(yàn)用的都是同一烤煙品種云煙97、在相同的施鉀量情況下其鮮葉片的鉀含量由于遺傳背景原因提升空間有限有關(guān)，也可能與皖南煙區(qū)煙葉成熟期降雨頻繁、葉片鉀外排較多有關(guān)。3種促根措施煙株都有發(fā)達(dá)的根系，TPGA和TSRI處理根系活力也很高，煙株對(duì)鉀的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)能力也較強(qiáng)，從土壤中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的鉀積累在莖稈和根系中較多。本研究還發(fā)現(xiàn)，TPFA處理烤后煙葉鉀含量相對(duì)較低，與陳亞茹等[7]的研究結(jié)果不一致，可能與不同地點(diǎn)的土壤類(lèi)型和黃腐酸鉀的用量不同有關(guān)。

煙株中鉀素的積累和再分配與不同器官的鉀吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)能力密切相關(guān)[19,21-23]。本研究中，TPGA和TSRI處理成熟期煙株鉀離子通道基因和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的相對(duì)表達(dá)量較高，煙株鉀積累量和烤后煙葉鉀含量也相對(duì)較高。TPFA處理葉片中鉀積累量相對(duì)其他促根處理較低，烤后煙上部葉和下部葉的鉀含量也相對(duì)較低，與其成熟期葉片中鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因NtKT12的表達(dá)量相對(duì)較低的結(jié)果一致。TPFA、TPGA和TSRI處理施入到土壤中的各種養(yǎng)分含量與施入的肥料養(yǎng)分相比非常低，煙株生長(zhǎng)前期可及時(shí)補(bǔ)充土壤養(yǎng)分，促進(jìn)植株吸收和根系發(fā)育，而3種促根措施在皖南生態(tài)條件下，成熟期是如何持續(xù)地促進(jìn)煙株根系生長(zhǎng)、并通過(guò)改變土壤理化特性[24-26]、根際微生態(tài)環(huán)境[27-29]等影響煙株鉀吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的，還需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

皖南煙區(qū)在正常施肥的基礎(chǔ)上添加黃腐酸鉀、γ-聚谷氨酸和豆?jié){灌根均可促使成熟期煙株根系發(fā)育，提高鉀積累量，尤其促進(jìn)根、莖和中部葉的鉀積累。豆?jié){灌根和γ-聚谷氨酸處理成熟期煙株鉀離子通道基因和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的相對(duì)表達(dá)量較高，煙株對(duì)鉀的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)能力較強(qiáng)，烤后煙葉的鉀含量較高。