雷振山，王童童，季 新，張?zhí)旌＃醺毒?，董麗平，趙亞帆，劉 娟

（1. 信陽農(nóng)林學院，河南 信陽 464000；2. 新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學院，河南 新鄉(xiāng) 453000；3. 河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/河南省水稻生物學重點實驗室，河南 鄭州 450046）

鹽脅迫是主要的環(huán)境脅迫之一，嚴重影響農(nóng)作物的生長發(fā)育和產(chǎn)量。我國內(nèi)陸鹽堿地約為1億hm2，沿海灘涂為234 萬hm2，是我國極為重要的后備耕地資源，綜合利用潛力巨大[1]。水稻（Oryza sativa）是我國重要的糧食作物，同時也是改良沿海灘涂和鹽堿地的先鋒糧食作物。因此，挖掘水稻耐鹽基因，培育耐鹽水稻新品種，提高水稻耐鹽性，對擴大耕地面積、提高水稻生產(chǎn)效率進而保障我國糧食安全具有重要意義。

鹽脅迫對植物造成的傷害主要包括滲透脅迫、氧化脅迫和離子毒害，進而導致植物營養(yǎng)失衡，尤其是K+的缺乏[2]。K 作為第二大礦質(zhì)營養(yǎng)元素，對植物細胞的生理代謝具有重要的作用。大量研究表明，許多植物的根K+保留能力與其鹽脅迫耐受性呈正相關(guān)[3]。鹽脅迫誘導植物根K+外排主要通過2條途徑：去極化激活外向整流型K+選擇性通道（Guard cell outward rectifying K+channel，GORK）和可滲透的非選擇性陽離子通道（Non‐selective cation channel，NSCC）[4‐5]。此外，鹽脅迫還會導致植物體內(nèi)活性氧（ROS）的過度積累[6]，而ROS 能夠激活NSCC，進而刺激K+外排[7‐8]。LIU 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫條件下，耐鹽水稻品種根中OsGORK的表達水平明顯低于鹽敏感水稻品種，且根K+的保留對水稻耐鹽性具有重要調(diào)控意義。因此，培育具有良好K+保留能力的水稻品種是提升水稻耐鹽性的重要途徑。

MicroRNA（miRNA）是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的非編碼小分子RNA，其長度為21～24 nt[10]。在植物中，miRNA 負調(diào)控其靶基因，參與調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成和生物及非生物脅迫響應(yīng)過程[11‐12]。近年來，研究者揭示了高鹽脅迫條件下水稻[13]、玉米[14]和番茄[15]等作物miRNA 的表達模式，并探究了相關(guān)miRNA 在響應(yīng)鹽脅迫過程中的調(diào)控機制。孟淑君等[13]通過高通量測序，在水稻根中檢測到12種鹽脅迫響應(yīng)的miRNA，其中，miR159、miR168和miR164 的表達受鹽脅迫誘導，而miR397、miR396、miR156、miR167 和miR1432 的表達受鹽脅迫抑制。ZEESHAN 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫可分別誘導耐鹽品種、鹽敏感品種中43、75 個miRNA 表達，且預(yù)測miR156、miR160、miR171、miR319、miR159和miR9657 可提高水稻耐鹽性。miR528 為單子葉植物特有且保守的一類miRNA，在植物生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮多種作用[17]。miR528 在水稻中具有較高的表達豐度。通過降解組測序分析發(fā)現(xiàn)，miR528 在水稻中具有生物學功能完全不同的多個潛在靶miRNA 位點[18]。ZHANG 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR528 可通過直接靶向調(diào)控OsUCL23（Uclacyanin 23）來調(diào)節(jié)水稻花粉粒的形成。WU 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR528抑制靶基因L-抗壞血酸氧化酶基因（AO）的表達，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)ROS 的積累水平，進而調(diào)控水稻抗病反應(yīng)。YUAN 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，超表達水稻miR528 能夠提高匍匐翦股穎的耐鹽性。WANG等[22]研究發(fā)現(xiàn)，超表達miR528可增強鹽脅迫條件下水稻的ROS 清除能力，進而增強水稻的耐鹽性。然而，miR528 是否調(diào)控鹽脅迫下水稻植株K+平衡，以及相關(guān)的調(diào)控機制研究還鮮有報道。為此，以miR528超表達水稻及T-DNA 插入突變體mir528為試驗材料，研究鹽脅迫對其生長、K+含量、K+流速及K+通道基因表達量的影響，以期解析miR528 對鹽脅迫條件下水稻幼苗K+穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為野生型水稻中花11（ZH11）及其2個超表達miR528 株系（miR528-OE1、miR528-OE2）、野生型水稻Dongjin（DJ）及其T-DNA 插入突變體mir528（PFG_3A-1186.R），超表達miR528株系由上海交通大學薛紅衛(wèi)課題組提供，mir528突變體由中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所曹曉鳳課題組提供[20]。

水培營養(yǎng)液配方參照國際水稻所營養(yǎng)液（Yoshida）配方：1.5 mmol/L NH4NO3、0.3 mmol/L NaH2PO4、0.5 mmol/L K2SO4、1.0 mmol/L CaCl2、1.6 mmol/L MgSO4、0.5mmol/L NaSiO3、20μmol/L Fe-EDTA、0.075 μmol/L（NH4）6Mo7O24、18.9 μmol/L H3BO3、9.5 μmol/L MnCl2、0.1 μmol/L CuSO4、0.2μmol/L ZnSO4、70.8μmol/L 檸檬酸，pH值5.5。

1.2 試驗處理

挑選飽滿的水稻種子，用10% H2O2消毒10 min，蒸餾水沖洗5～6 次，置于培養(yǎng)箱28 ℃催芽2 d。將露白的種子播于PCR板孔（底部有小孔）中，固定在泡沫板上，將泡沫板漂于水培盒子中，先用清水培養(yǎng)5 d，再用1/4全營養(yǎng)液培養(yǎng)2 d，之后用1/2全營養(yǎng)液培養(yǎng)2 d，最后采用全營養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)至苗齡15 d，在營養(yǎng)液中加入100 mmol/L NaCl 模擬鹽脅迫處理（簡稱NaCl），以不添加NaCl 的營養(yǎng)液為對照（簡稱CK），其他培養(yǎng)條件均同鹽脅迫處理。各處理均設(shè)3次生物學重復。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 株高、生物量及相對含水量 于鹽脅迫處理7 d 取樣，采用直尺測量株高（從根基部到葉尖）。然后，用去離子水沖洗，吸水紙吸去組織表面的水分，稱量植株根和地上部鮮質(zhì)量，之后置于烘箱中烘干至恒質(zhì)量，測定根和地上部的干質(zhì)量，并計算相對含水量。

1.3.2 K+含量 將鹽脅迫處理7 d 取樣烘干的根和地上部樣品研磨成粉末，用98%H2SO4-30%H2O2消解至溶液澄清。冷卻后，用去離子水定容，利用火焰光度計（FP6410，上海精密科學儀器有限公司）測定植株地上部和根的K+含量。

1.3.3 K+流速 選取飽滿一致的種子，消毒滅菌后置于緩沖液（0.5 mmol/L KCl、0.1 mmol/L CaCl2）中萌發(fā)生長5 d，將水稻幼苗根進行100 mmol/L NaCl 瞬時處理，采用非損傷微電極離子流速測定技術(shù)（MIFE 系統(tǒng)，塔斯馬尼亞大學）測定水稻根成熟區(qū)K+的流速，在瞬時加100 mmol/L NaCl 處理前，先在無NaCl 的緩沖液中測定5 min，具體測定方法參考LIU等[9]的方法。

1.3.4 基因表達量 苗齡15 d 的水稻幼苗經(jīng)100 mmol/L NaCl 處理0、1、48 h 后，取根樣品，液氮速凍保存于-80 ℃冰箱備用。 采用TRIzol 試劑（Invitrogen）提取根總RNA，采用MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（TransGen Biotech）進行RNA、miRNA 的反轉(zhuǎn)錄。以β-actin基因為內(nèi)參，分析miR528 和K+通道基因OsAKT1（ArabidopsisK+transporter 1）、OsGORK的表達量，其引物序列見表1。采用GoTaqqPCR反應(yīng)混合體系（Promega）進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR），其中，miRNA 的定量采用Stem-loop 方法。采用2?ΔΔCT法計算基因的相對表達量，具體反轉(zhuǎn)錄及定量反應(yīng)體系參考趙亞帆[23]的方法。

表1 qRT-PCR所用引物序列Tab.1 Sequences of primers used for real-time fluorescence quantitative PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對不同水稻材料miR528表達量的影響

由圖1 可知，鹽脅迫處理0 h 時，與野生型水稻ZH11 相比，超表達miR528 水稻株系miR528-OE1、miR528-OE2 中miR528 表達量極顯著提高，分別提高了16.43、33.67 倍；與野生型水稻DJ 相比，突變體mir528中miR528 表達量顯著下降。鹽脅迫誘導miR528 表達，且超表達株系miR528-OE1、miR528-OE2 中miR528 表達量遠高于野生型水稻。在鹽脅迫處理1 h 時，與野生型水稻ZH11 相比，miR528-OE1、miR528-OE2 株系中miR528 表達量分別提高35.21、31.87倍。而鹽脅迫條件下，突變體mir528中miR528表達量低于野生型水稻DJ。

圖1 鹽脅迫對不同水稻材料miR528表達量的影響Fig.1 Effect of salt stress on the expression level of miR528 in different rice materials

2.2 鹽脅迫對不同水稻材料幼苗生長的影響

由表2 可知，在CK 條件下，超表達株系miR528-OE1、miR528-OE2 及突變體mir528株高、地上部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量和相對含水量均低于其相應(yīng)的野生型水稻。鹽脅迫條件下，超表達株系miR528-OE1、miR528-OE2株高、地上部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、根鮮質(zhì)量和相對含水量總體上均高于野生型水稻ZH11，而突變體mir528上述指標和根干質(zhì)量均低于野生型水稻DJ。與CK 相比，鹽脅迫明顯抑制不同轉(zhuǎn)基因材料的株高、地上部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量和相對含水量。與CK 相比，鹽脅迫處理野生型水稻ZH11 的地上部鮮、干質(zhì)量分別減少68.07%、53.76%，超表達株系 miR528-OE1、miR528-OE2 的地上部鮮質(zhì)量和干質(zhì)量下降幅度低于ZH11，僅分別減少56.39%、61.79%和40.34%、43.73%；而突變體mir528的地上部鮮、干質(zhì)量降低幅度與野生型水稻DJ 相近。與CK 相比，鹽脅迫處理野生型水稻DJ 根鮮、干質(zhì)量分別降低49.54%、50.52%，突變體mir528降低幅度高于野生型水稻DJ；野生型水稻ZH11 根鮮、干質(zhì)量分別下降51.28%、48.20%，超表達株系miR528-OE1 和miR528-OE2 根鮮、干質(zhì)量降低幅度相同，均分別為27.20%、27.31%，明顯低于野生型水稻ZH11。綜上，超表達miR528 可以緩解鹽脅迫對水稻植株生長的抑制，提高植株的耐鹽性。

表2 鹽脅迫對不同水稻材料幼苗生長的影響Tab.2 Effect of salt stress on the growth of seedlings of different rice materials

續(xù)表2 鹽脅迫對不同水稻材料幼苗生長的影響Tab.2（Continued） Effect of salt stress on the growth of seedlings of different rice materials

2.3 鹽脅迫對不同水稻材料幼苗K+含量的影響

由圖2可知，CK 條件下，與野生型水稻ZH11相比，超表達株系miR528-OE1、miR528-OE2地上部、根K+含量無顯著差異。鹽脅迫條件下，超表達株系miR528-OE1、miR528-OE2 地上部和根K+含量均顯著高于野生型水稻ZH11。與CK 相比，鹽脅迫處理所有水稻材料地上部、根K+含量均明顯降低，超表達株系miR528-OE1 和miR528-OE2 地上部、根K+含量下降幅度較野生型水稻ZH11 小，分別降低34.32%、42.16%和58.17%、59.12%。

由圖2 可知，CK 條件下，突變體mir528地上部K+含量顯著低于野生型水稻DJ，根K+含量與野生型水稻DJ 差異不顯著；鹽脅迫條件下，突變體mir528地上部K+含量與野生型水稻DJ 差異不顯著，但根K+含量顯著低于野生型水稻DJ。

圖2 鹽脅迫對不同水稻材料地上部、根K+含量的影響Fig.2 Effect of salt stress on the K+content in shoots and roots of different rice materials

綜上，超表達miR528 可提高鹽脅迫下水稻K+含量，進而增強水稻耐鹽性。

2.4 鹽脅迫對不同水稻材料幼苗根K+流速的影響

由圖3 可知，在未添加NaCl 的緩沖液中，不同水稻材料根成熟區(qū)K+外排較少，差距較小，且隨時間推進無較大波動。5 min 后加入100 mmol/L NaCl，鹽處理迅速導致所有水稻材料根成熟區(qū)K+外排。在鹽脅迫處理后3～4 min 根成熟區(qū)K+外排達到峰值。隨著鹽處理時間延長，K+外排逐漸減弱并趨于平穩(wěn)。但在鹽脅迫處理后15 min，K+外排又呈現(xiàn)增加趨勢。其中，超表達株系miR528-OE根K+外排最少。鹽脅迫處理后，野生型水稻ZH11 根K+外排流速峰值為358.19 nmol/（m2·s），而超表達株系miR528-OE 根K+外排流速峰值僅為222.88 nmol/（m2·s），突變體mir528根K+外排流速峰值明顯高于野生型水稻DJ。鹽脅迫處理后26 min，超表達株系miR528-OE 根K+外排流速僅為169.17 nmol/（m2·s），而突變體mir528根K+外排流速高達300.12 nmol/（m2·s）。以上結(jié)果表明，超表達miR528可降低鹽脅迫導致的水稻根K+流失，進而提高水稻耐鹽性。

圖3 100 mmol/L NaCl瞬時處理后不同水稻材料幼苗根成熟區(qū)K+流速Fig.3 K+flux in mature root zones of different rice materials after transient treatment with 100 mmol/L NaCl

2.5 鹽脅迫對不同水稻材料幼苗根K+通道基因表達量的影響

為了進一步分析鹽脅迫對不同水稻材料幼苗根K+通道基因表達量的影響，本研究測定了不同鹽脅迫處理時間水稻幼苗根中OsAKT1、OsGORK基因的表達量。其中，OsAKT1在植物根中負責K+的吸收，OsGORK介導K+的外排。如圖4 所示，鹽脅迫處理0 h時，超表達株系miR528-OE1、miR528-OE2幼苗根OsAKT1基因表達量顯著高于野生型水稻ZH11，突變體mir528幼苗根OsAKT1基因表達量與野生型水稻DJ差異不顯著；鹽脅迫處理1 h和48 h，miR528-OE1、miR528-OE2 幼苗根OsAKT1基因表達量顯著低于野生型水稻ZH11，突變體mir528幼苗根OsAKT1基因表達量分別極顯著和顯著高于野生型水稻DJ。

圖4 鹽脅迫對不同水稻材料幼苗根中OsAKT1和OsGORK表達量的影響Fig.4 Effect of salt stress on the expression levels of OsAKT1 and OsGORK in seedling roots of different rice materials

如圖4 所示，鹽脅迫處理0 h 時，超表達株系miR528-OE1、miR528-OE2 幼苗根OsGORK表達量顯著高于野生型水稻ZH11，突變體mir528幼苗根OsGORK基因表達量顯著低于野生型水稻DJ；鹽脅迫處理1 h，超表達株系miR528-OE1、miR528-OE2幼苗根OsGORK基因表達量分別顯著、極顯著低于野生型水稻ZH11，突變體mir528幼苗根OsGORK基因表達量顯著高于野生型水稻DJ；鹽脅迫處理48 h，超表達株系miR528-OE1、miR528-OE2 幼苗根OsGORK基因表達量分別顯著、極顯著高于野生型水稻ZH11，而突變體mir528幼苗根OsGORK基因表達量顯著低于野生型水稻DJ。

綜上，超表達miR528 水稻植株可能通過抑制根OsGORK基因的表達來增強鹽脅迫下K+的穩(wěn)態(tài)。

3 結(jié)論與討論

miRNA 在植物響應(yīng)和適應(yīng)鹽脅迫過程中具有重要作用[24]。將與逆境相關(guān)的miRNA 通過基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)入植物可以提高植物的耐鹽性[25]。ZHAO等[26]研究表明，超表達miR393a增強K+的吸收，提高匍匐翦股穎的耐鹽性。段中鑫等[27]研究表明，超表達胡楊的miR156j可以改善鹽脅迫下擬南芥種子萌發(fā)及生長狀況，提高其耐鹽性。AI 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，超表達miR1861h 可促進鹽脅迫下水稻幼苗生長，增強水稻的耐鹽性。YUAN 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，超表達水稻的miR528 通過改善含水量、質(zhì)膜完整性、葉綠素含量及K+的保留能力，增強了匍匐翦股穎的耐鹽性。本研究結(jié)果表明，超表達miR528 可以減輕鹽脅迫對水稻生長的抑制，增加地上部和根鮮、干質(zhì)量，提高水稻的耐鹽性，這主要得益于超表達株系miR528-OE1、miR528-OE2 地上部和根K+含量較野生型水稻ZH11極顯著或顯著增加，與YUAN 等[21]研究結(jié)果相似。

為了進一步探究超表達miR528 提高鹽脅迫條件下水稻K+含量的機制，本研究測定分析了K+流速及K+通道基因的表達量，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫處理后超表達株系miR528-OE 根K+的外排流速明顯低于野生型水稻和突變體mir528，且與野生型水稻ZH11 相比，在鹽脅迫處理1 h 時，miR528-OE1、miR528-OE2 幼苗根OsGORK基因表達量分別顯著、極顯著下降；而與野生型水稻DJ 相比，突變體mir528幼苗根OsGORK基因表達量在鹽脅迫處理1 h 時顯著增加。表明超表達miR528 增強鹽脅迫條件下K+保留能力可能是通過下調(diào)鹽脅迫條件下OsGORK基因表達來實現(xiàn)的。但是，在鹽脅迫處理48 h 時，與野生型水稻ZH11 相比，超表達株系miR528-OE1、miR528-OE2 幼苗根OsGORK基因表達量分別顯著、極顯著提高；而與野生型水稻DJ 相比，突變體mir528幼苗根OsGORK基因表達量顯著降低。GORK 通道由膜去極化激活，而它們的門控程度強烈依賴于細胞外的K+濃度[29]。前人研究表明，鹽脅迫誘導GORK表達水平增加的生理機制可能是K+外排作為“代謝開關(guān)”的信號分子，抑制能量消耗，釋放的能量可滿足防御和修復的需求[30‐32]。這說明，隨著鹽脅迫時間延長，超表達株系miR528-OE 幼苗根中OsGORK基因表達量增加，可能是為了抑制能量的消耗，促進植株生長。此外，鹽脅迫條件下K+的穩(wěn)態(tài)還與K+的吸收能力有關(guān)。K+的低親和性吸收主要通過K+通道，如內(nèi)向型整合K+通道AKT1。MANUEL 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，AKT1基因在植物根中表達，對K+的吸收起到重要調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，正常條件下，超表達株系miR528-OE1、miR528-OE2 幼苗根OsAKT1基因表達量顯著高于野生型水稻ZH11；而在鹽脅迫處理1 h 和48 h 時，miR528-OE1、miR528-OE2 幼苗根OsAKT1基因表達量均較野生型水稻ZH11 顯著下降。WU等[3]指出，由于鹽脅迫條件下植物的質(zhì)膜電位明顯去極化，AKT 家族介導K+的吸收在熱力學上是不可能的。 HAK/KUP（High‐affinity K+transporter/K+uptake permease）是一個高親和性K+轉(zhuǎn)運蛋白家族，通過調(diào)節(jié)K+的轉(zhuǎn)運來提高植物的耐鹽性[34]。因此，AKT1 介導K+的吸收可能不是鹽脅迫條件下miR528-OE1、miR528-OE2幼苗根保持較高K+含量的原因，而miR528 是否參與介導鹽脅迫條件下HAK/KUP 的表達還有待進一步研究。有研究指出，鹽脅迫條件下植物K+外排的另一條途徑是ROS 激活的NSCC 通道[7‐8]。WANG 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，超表達miR528 下調(diào)靶基因AO，增加抗壞血酸（AsA）和脫落酸（ABA）的含量，降低ROS的積累，進而增強水稻的耐鹽性?？梢姡磉_miR528 增強鹽脅迫條件下水稻K+的保留能力，還有可能與降低鹽脅迫條件下ROS 的積累進而抑制ROS 激活的NSCC通道有關(guān)，這需要進一步的研究。

綜上所述，miR528 正調(diào)控水稻的耐鹽性，超表達miR528 可減弱鹽脅迫對水稻生長的抑制，提高鹽脅迫條件下水稻對K+的保留能力，這可能是通過下調(diào)OsGORK基因的表達量來實現(xiàn)的。