陳錫龍，趙 貴，黃 鑫，謝麗麗，王慶紅，孫真崢，楊 強(qiáng)

貴州省獸藥飼料檢測(cè)所，貴州貴陽(yáng) 550003

0 引言

獸藥，是指用于預(yù)防、治療、診斷動(dòng)物疾病或者有目的地調(diào)節(jié)動(dòng)物生理機(jī)能的物質(zhì)[1]。獸藥殘留是指食品動(dòng)物使用獸藥后，動(dòng)物產(chǎn)品的任何可食用部分中所有與藥物有關(guān)的物質(zhì)殘留，包括原型藥物或（和）其他代謝產(chǎn)物[2]。牛奶中的獸藥殘留主要是養(yǎng)殖過(guò)程中獸藥濫用或使用不當(dāng)造成的，這種情況可稱(chēng)之為主動(dòng)行為；不排除少數(shù)被動(dòng)行為可能造成獸藥殘留超標(biāo)的情況，如在不知情的情況下使用含有某種非法添加獸藥成分的中獸藥等。牛奶中獸藥殘留超標(biāo)對(duì)人體特別是嬰幼兒健康有著嚴(yán)重影響，長(zhǎng)期食用獸藥殘留超標(biāo)的牛奶，可能導(dǎo)致獸藥殘留蓄積，引起毒害損傷，甚至致畸、致癌[3]。為應(yīng)對(duì)牛奶中獸藥殘留超標(biāo)，我國(guó)于2019年9月發(fā)布的《GB 31650—2019食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定了牛奶中81 種獸藥的最大殘留限量[4]，進(jìn)一步完善了國(guó)內(nèi)奶牛有關(guān)獸藥使用的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)[5]。

獸藥殘留檢測(cè)是保障牛奶質(zhì)量安全的重要手段和措施。但是，由于獸藥種類(lèi)繁多，如果逐一進(jìn)行檢測(cè)，則效率低下，且成本高昂，而高通量檢測(cè)技術(shù)可以一次性檢測(cè)多種獸藥殘留，省時(shí)省力，因此成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[6]。我國(guó)針對(duì)牛奶中獸藥殘留的檢測(cè)已出臺(tái)多項(xiàng)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[7~11]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)單類(lèi)獸藥殘留的檢測(cè)技術(shù)已日漸成熟，但對(duì)多類(lèi)獸藥殘留檢測(cè)的研究則較少，且不夠充分。這是由于同時(shí)測(cè)定多類(lèi)獸藥殘留存在較多難點(diǎn)，如獸藥種類(lèi)多、性質(zhì)差異大，前處理技術(shù)無(wú)法兼顧所有藥物而使回收率、定量下限等不能滿足測(cè)定要求[12]。

近年來(lái)的研究表明，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定法在多種類(lèi)獸藥殘留檢測(cè)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，已成為當(dāng)前研究的主流。例如，王浩等[13]利用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定法測(cè)定了牛奶中五類(lèi)35 種抗生素殘留；李寧等[14]開(kāi)發(fā)了牛奶中四類(lèi)25 種抗生素殘留的檢測(cè)方法；方靈等[15]建立了同時(shí)測(cè)定牛奶中五類(lèi)38 種抗生素殘留的分析方法；張炯愷[16]建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定乳制品中十類(lèi)90 種獸藥殘留量的方法。這些方法的研究為牛奶中多種獸藥殘留的快速檢測(cè)提供了重要借鑒和參考，但尚不滿足作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的條件，仍需繼續(xù)優(yōu)化和探索。

本文使用乙腈處理牛奶樣品并結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法建立了七類(lèi)20 種常用獸藥在牛奶中殘留量的檢測(cè)方法，取得了滿意的結(jié)果。20 種獸藥包括3 種β-內(nèi)酰胺類(lèi)、4 種喹諾酮類(lèi)、1 種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、1 種林可酰胺類(lèi)、9 種磺胺類(lèi)、1 種增效劑類(lèi)和1 種激素類(lèi)藥物，均為使用廣泛的獸藥。該方法對(duì)于牛奶中多類(lèi)別、多組分獸藥殘留的分析監(jiān)測(cè)和快速篩查具有良好現(xiàn)實(shí)基礎(chǔ)和參考價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備

Waters-UPLC Xevo TQ-XS高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源及MassLynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國(guó)沃特士公司；Denver Instrument TB-215 D型電子分析天平，美國(guó)丹佛公司；Mettler Toledo ME802E型電子天平，美國(guó)梅特勒-托利多集團(tuán)公司；FV64全自動(dòng)智能氮吹儀，廣州得泰儀器科技有限公司（Detelogy）：艾卡（IKA MS3）旋渦混合器，德國(guó)艾卡-沃克股份兩合公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及試劑

阿莫西林、氨芐西林、苯唑西林、泰樂(lè)菌素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、林可霉素、甲氧芐啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺氯噠嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺甲噁唑、地塞米松，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和中國(guó)食品藥品檢定研究院；泰樂(lè)菌素A（泰樂(lè)菌素殘留標(biāo)志物），TOKU-E公司；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，德國(guó)Merck公司；實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)Milli-Direct-Q8UV-R凈化系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）制備的超純水；試驗(yàn)所用牛奶樣品均為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)留樣。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC? HSS T3，1.8 μm，2.1 mm×150 mm。流動(dòng)相A為0.2%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.2%甲酸乙腈。線性梯度洗脫程序：0~0.5 min，10%B；0.5~11.0 min，10%B上升至90%B；11.0~11.50 min，90%B保持0.5 min；11.50~11.60 min，90%B至10%；11.60~14.00 min，10%B保持2.4 min。流速：0.3 mL/min。柱溫：40 ℃。樣品溫度：10 ℃。進(jìn)樣量：2 μL。

1.3.2 質(zhì)譜測(cè)定條件

電噴霧離子源，正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；離子源入口電壓：3.5 kV；離子源溫度：150 ℃；霧化氣流速：550 L/h；21 種化合物質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 21種化合物質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

1.4.1 單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

（1）甲氧芐啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺甲噁唑、林可霉素、地塞米松單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

稱(chēng)取甲氧芐啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺甲噁唑、林可霉素、地塞米松各約50 mg，需折算為凈含量，精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，加甲醇使其溶解，用甲醇定容，搖勻，配制成各成分凈含量為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，4~8 ℃冰箱中保存。

（2） 磺胺喹噁啉單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱(chēng)取磺胺喹噁啉約50 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，加甲醇適量，再加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL使溶解，用甲醇定容，搖勻，得含磺胺喹噁啉濃度約為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，4 ~8 ℃冰箱中保存。

（3）環(huán)丙沙星、氧氟沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、泰樂(lè)菌素單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱(chēng)取環(huán)丙沙星、氧氟沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、泰樂(lè)菌素各約10 mg，精密稱(chēng)定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，配制成各成分凈含量為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于-20 ℃以下避光保存。

（4）泰樂(lè)菌素A單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱(chēng)取約5 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，配制成各成分凈含量為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于-20 ℃以下避光保存。（5）阿莫西林、氨芐西林、苯唑西林單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

各按凈含量稱(chēng)取阿莫西林、氨芐西林、苯唑西林約10 mg，精密稱(chēng)定，置100 mL容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，配制成各成分凈含量為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，因其容易分解，須臨用前現(xiàn)配。

1.4.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取各含量為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各1.00 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，得濃度為10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液；另取上述混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液1.00 mL，置預(yù)先放入適量水的量瓶中，再加入其余含量為100 μg/mL的各標(biāo)準(zhǔn)工作（或貯備）溶液100 μL，加水稀釋并定容，搖勻，即得各化合物濃度為100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線系列溶液的配制

（1）空白樣品基質(zhì)的制備

稱(chēng)取空白牛奶樣品2.0 g，按1.6 樣品處理方法從“置50 mL離心管中，”開(kāi)始，一直到“室溫氮吹濃縮至約1 mL，取出，渦旋10~30 s”為止，處理所獲得的溶液即為空白樣品基質(zhì)。

（2）合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線系列溶液的配制

分別將5 份空白樣品基質(zhì)轉(zhuǎn)移到2 mL量瓶中，再分別加入濃度為100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液10 μL、20 μL、40 μL、100 μL和200 μL，加水稀釋定容，渦旋混勻，即得濃度分別為0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL和10.0 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線系列溶液。

1.5 磺胺對(duì)甲氧嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶，磺胺氯吡嗪和磺胺氯噠嗪特征離子色譜峰保留時(shí)間的確定

因磺胺對(duì)甲氧嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶，磺胺氯吡嗪和磺胺氯噠嗪互為同分異構(gòu)體，需要配制各自適合上機(jī)測(cè)試濃度的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)試，以確定其特征離子色譜峰的保留時(shí)間，否則易造成識(shí)別誤判。

1.6 樣品的處理

稱(chēng)取2.0 g牛奶樣品，置50 mL離心管中，加入4 mL乙腈處理，渦旋10~30 s，10 000 r/min離心5 min，取上清液過(guò)Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化，收集洗脫液于10 mL玻璃試管中；殘?jiān)尤? mL乙腈洗滌，洗液過(guò)Oasis PRiME HLB固相萃取柱，合并洗脫液，室溫氮吹濃縮至約1 mL，取出，渦旋10~30 s，轉(zhuǎn)移至具刻度的10 mL塑料離心管中，加少量水洗滌試管，洗液合并于離心管中，加水稀釋至2.0 mL，渦旋，混勻，10 000 r/min離心5 min，取上清液適量過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.7 檢出限和定量限

選取適當(dāng)?shù)目瞻着Ｄ虡悠?，?.4.3（1）空白樣品基質(zhì)的制備方法制得空白樣品基質(zhì)，添加適量的21 種化合物的濃度均為100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，加水定容至2 mL，渦旋混勻后過(guò)濾膜，取濾液上機(jī)測(cè)定。以特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N≥3的濃度為方法檢出限，S/N≥10的濃度為方法定量限。

1.8 準(zhǔn)確度和精密度

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。分別在2.0 g空白牛奶中加入濃度為100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液40 μL和200 μL，制得添加量為2.0 μg/kg和10.0 μg/kg的陽(yáng)性添加樣品，按1.6 樣品處理方法處理后上機(jī)測(cè)定，每個(gè)添加水平分別作5 個(gè)平行，每個(gè)平行進(jìn)樣2 針。計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。

1.9 實(shí)際樣品的測(cè)定

對(duì)51 批實(shí)驗(yàn)室中留樣的牛奶樣品進(jìn)行了檢測(cè)。

1.10 泰樂(lè)菌素殘留物的檢測(cè)

因《GB31650—2019食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定泰樂(lè)菌素的殘留標(biāo)志物為泰樂(lè)菌素A，故本研究同時(shí)考察了泰樂(lè)菌素及其殘留標(biāo)志物泰樂(lè)菌素A的添加回收及檢測(cè)情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性范圍

按1.4.3混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線系列溶液的配制方法配制21 種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液上機(jī)測(cè)定。21 種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（2 ng/mL）總離子流圖見(jiàn)圖1，21 種化合物的出峰順序和保留時(shí)間見(jiàn)表1。21 種化合物分離度良好，響應(yīng)靈敏。以各化合物定量離子色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，其相應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制21 種化合物的線性回歸方程。結(jié)果表明：21 種化合物在0.5~10.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.991。21 種化合物的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

圖1 21種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（2 ng/mL）總離子流圖

2.2 檢出限和定量限

采用空白基質(zhì)添加目標(biāo)化合物的方法，以特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N≥3的濃度為方法檢出限，S/N≥10的濃度為方法定量限，該方法的檢出限為0.02~0.4 μg/kg；定量限為0.05~1.2 μg/kg。各化合物的檢出限和定量限數(shù)據(jù)見(jiàn)表2?？瞻讟悠穲D譜見(jiàn)圖2。

表2 21 種化合物線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

圖2 牛奶空白樣品總離子流圖

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。按照1.8的方法，制得添加量為2.0 μg/kg和10.0 μg/kg的陽(yáng)性添加樣品，按1.6樣品處理方法處理后上機(jī)測(cè)定。陽(yáng)性添加牛奶樣品總離子流圖見(jiàn)圖3。按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算含量，求得21 種化合物的平均回收率為60.6%～93.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%~17.9%，各化合物的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表3 21種化合物在陽(yáng)性添加樣品中的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖3 陽(yáng)性添加牛奶樣品總離子流圖（添加量為2.0 μg/kg）

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

對(duì)51 批實(shí)驗(yàn)室中留樣的牛奶樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明：絕大多數(shù)獸藥未檢出殘留，少數(shù)獸藥雖檢出殘留，但均未超過(guò)國(guó)家規(guī)定的最大殘留限量。

2.5 色譜條件的優(yōu)化

參考方靈等[15]的研究，選用ACQUITY UPLC ?HSS T3（1.8 μm，2.1 mm×150 mm）色譜柱對(duì)21 種化合物進(jìn)行分離。使用0.2%甲酸乙腈作為有機(jī)相，考察選取0.1%甲酸水、0.2%甲酸水、5 mmol/L乙酸銨和5 mmol/L甲酸銨作為水相，采用梯度洗脫方式對(duì)21 種化合物進(jìn)行分離，結(jié)果表明，選用0.2%甲酸水作為水相時(shí)，21 種化合物的分離度和峰形較優(yōu)。故選用0.2%甲酸水作為水相，用0.2%甲酸乙腈作為有機(jī)相。

2.6 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

方法采用蠕動(dòng)進(jìn)樣方式向質(zhì)譜系統(tǒng)注入500 ng/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，確定化合物的最佳質(zhì)譜條件。各化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)超高效液相色譜流動(dòng)相帶入ESI電離源，進(jìn)行一級(jí)全掃描質(zhì)譜分析。在正離子模式下對(duì)[M+H]+進(jìn)行子離子掃描，得到主要的離子，并選擇響應(yīng)值高的離子進(jìn)行碰撞能量?jī)?yōu)化，最終確定了多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)的離子對(duì)及碰撞能量，建立了相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)。特別地，化合物中磺胺對(duì)甲氧嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶，磺胺氯吡嗪和磺胺氯噠嗪互為同分異構(gòu)體，建立質(zhì)譜參數(shù)后，分別以濃度為5 ng/mL的上述4 種化合物單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液通過(guò)液相系統(tǒng)經(jīng)色譜柱注入質(zhì)譜儀，確定其相應(yīng)的保留時(shí)間，利用保留時(shí)間進(jìn)行定性，從而避免識(shí)別誤判。

2.7 提取溶劑的選擇和前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

牛奶基質(zhì)復(fù)雜，前處理主要是沉淀蛋白和除脂，本研究主要選擇乙腈、0.2%的甲酸乙腈和5%的三氯乙酸溶液沉淀牛奶中的蛋白，使用Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化除脂。采用乙腈、0.2%的甲酸乙腈沉淀蛋白，方法簡(jiǎn)單快捷，省時(shí)省力，但研究中發(fā)現(xiàn)采用0.2%的甲酸乙腈處理樣品后，磺胺類(lèi)化合物的回收率普遍偏低，一般只有30%~40%，且基質(zhì)干擾較大，故最終選擇用乙腈作為提取溶劑。為充分提取化合物殘留，選擇用2 mL乙腈洗滌殘?jiān)淮?，但并非洗滌次?shù)或乙腈使用量越多越好。氮吹濃縮時(shí)保持室溫不加熱為宜，以免較高的溫度加速某些化合物的分解。氮吹濃縮至1 mL左右，以除去絕大部分的乙腈即可，繼續(xù)吹干也需要復(fù)溶，且會(huì)花費(fèi)較多的時(shí)間。氮吹濃縮后的樣品仍含有少量蛋白，直接過(guò)濾膜會(huì)比較困難，故選擇轉(zhuǎn)移定容后離心，反而使處理更加快捷和高效。

2.8 單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液或貯備液的配制

根據(jù)化合物性質(zhì)的差異，配制單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液或貯備液時(shí)采用了不同的配制方法。例如，對(duì)于在甲醇中溶解度為微溶或以上且性質(zhì)穩(wěn)定的化合物一般配制為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，以便較長(zhǎng)時(shí)間保存；對(duì)于在甲醇中溶解度為極微溶解或以下且性質(zhì)穩(wěn)定的化合物一般配制為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。對(duì)于阿莫西林、氨芐西林、苯唑西林等在甲醇中容易分解，但在水中相對(duì)穩(wěn)定的化合物，則用水作溶劑臨用時(shí)現(xiàn)配。個(gè)別較昂貴且購(gòu)買(mǎi)時(shí)裝量極少的化合物，如泰樂(lè)菌素A，則配制為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。幾乎不溶于甲醇或水的磺胺喹噁啉，則加了少量堿性溶液進(jìn)行溶解處理。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液均為現(xiàn)用現(xiàn)配。

3 結(jié)論

研究建立的牛奶中20 種常用獸藥殘留量測(cè)定的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，使用乙腈沉淀蛋白，經(jīng)Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化除脂，再氮吹濃縮后加水定容離心，上機(jī)測(cè)定，獲得了較滿意的結(jié)果。方法測(cè)定的獸藥種類(lèi)覆蓋范圍廣，且均為使用廣泛的獸藥，具有較強(qiáng)的針對(duì)性。同時(shí)，方法前處理簡(jiǎn)單，方便快捷，準(zhǔn)確度和靈敏度高，可作為牛奶中常用獸藥殘留量的快速篩查和定量方法。