黃酒中菌落總數(shù)測定不確定度評定

相露婷 傅華靖 王佳麗 劉鎮(zhèn)

摘 要：目的：評估黃酒中菌落總數(shù)檢測結(jié)果的不確定度。方法：按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016）方法，測定11份同一批次的黃酒樣品中菌落總數(shù)，依據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）評定檢測結(jié)果的不確定度。結(jié)果：依據(jù)所采取的方法，在置信概率為95%時，11份黃酒樣品的菌落總數(shù)對數(shù)值因重復(fù)測量產(chǎn)生的擴展不確定度為0.130，置信區(qū)間為1.269～1.529。結(jié)論：本研究建立的方法同樣適合類似檢測條件下菌落總數(shù)不確定的評定。

關(guān)鍵詞：黃酒;菌落總數(shù);不確定度

Evaluation of Uncertainty in the Determination of Aerobic Plate Count in Huangjiu

XIANG Luting， FU Huajing， WANG Jiali， LIU Zhen

（Shaoxing Institute for Food and Drug Control， Shaoxing 312000， China）

Abstract： Objective： To evaluate the uncertainty of aerobic plate count in Huangjiu. Method： According to the GB 4789.2—2016， aerobic plate count in 11 samples of Huangjiu in the same batch was detected. The uncertainty of detection results was evaluated according to JJF 1059.1—2012. Result： When the confidence probability was 95%， the expanded uncertainty of the logarithm of the aerobic plate count in 11 Huangjiu samples was 0.130， and the confidence interval was 1.269～1.529. Conclusion： The method in this study is also suitable for the evaluation of the uncertainty of aerobic plate count under similar detection conditions.

Keyword： Huangjiu; aerobic plate count; uncertainty

菌落總數(shù)是食品檢驗較為常見的檢測項目。在實際檢測中，樣品中菌種總數(shù)的檢測結(jié)果往往發(fā)散較大，而影響檢測結(jié)果的因素也很復(fù)雜。因此，每個實驗室都會對本實驗室的菌落總數(shù)計數(shù)的能力進行考核驗證。黃酒作為地理標(biāo)志產(chǎn)品，其檢測過程中對菌落總數(shù)并沒有作出明確的規(guī)定，但微生物污染對于黃酒的生產(chǎn)和保存是非常關(guān)鍵的因素，在生產(chǎn)加工過程中對菌落總數(shù)的監(jiān)測是必不可少的項目。因此，對菌落總數(shù)的檢測不確定度評定是必不可少的。由于黃酒本身的特殊性質(zhì)，其中含有的乙醇可能對菌落產(chǎn)生一定的抑制作用，從而影響菌落計數(shù)結(jié)果，所以此次對黃酒中菌落計數(shù)的不確定度進行評定非常重要且具有實際參考意義。

本次研究應(yīng)用平板菌落計數(shù)法測量黃酒中的菌落總數(shù)，通過對影響測量結(jié)果的不確定度分量的分析和量化，求出被測定菌落總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴展不確定度，并對測量結(jié)果進行表述。鑒于檢測過程中黃酒本身含菌量較少，在實際實驗樣品中加入少于100 CFU標(biāo)準(zhǔn)菌株作為污染菌，以便統(tǒng)計和分析研究。因此，在測定不確定度之前，還需測定該黃酒對不同菌種的抑制情況，從中選擇影響較小的菌種進行不確定度評定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本次研究采用樣品為市面上較為常見的傳統(tǒng)型黃酒，酒精度為11.0%vol，酒齡3年。菌種為大腸埃希氏菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC6538、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，生產(chǎn)廠家為青島海博，批號20190531;平板計數(shù)瓊脂，生產(chǎn)廠家為青島海博，批號20200504;氯化鈉，生產(chǎn)廠家為國藥化工，批號20191106。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ2000B型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠;ESCO class Ⅱ型生物安全柜，新加坡藝思高科技有限公司;MLS-3780型高壓蒸氣滅菌器，日本三洋公司;HPP260型生化培養(yǎng)箱，德國memmert公司;BGZ-240型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌液計數(shù)

取標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基36 ℃培養(yǎng)24 h，將菌液制成10倍系列稀釋液，吸取1 mL稀釋液，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1 mL稀釋液加入2個無菌平皿中，作為空白對照。使用平板計數(shù)（Plate Count Agar，PCA）培養(yǎng)基注皿。于36 ℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)。上述菌液2 ℃冰箱冷藏保存，以保證菌液濃度維持在此水平。

1.3.2 回收率測定

選取菌落數(shù)量在500～1 000 CFU/mL稀釋度菌液，分別加入10 mL黃酒中，混勻后按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016）[1]方法計數(shù)。同時以加入10 mL生理鹽水作為對照組進行計數(shù)。培養(yǎng)基為平板計數(shù)瓊脂，36 ℃培養(yǎng)48 h。

1.3.3 黃酒中菌落總數(shù)測定

根據(jù)回收率測定結(jié)果，選擇回收率較高的菌液來污染黃酒菌株。將同一份黃酒樣品分成11份，每份50 mL，取稀釋度適宜的菌液1 mL加入每份樣品中作為污染的黃酒樣品。按照標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2—2016[1]方法，無菌環(huán)境下量取樣品25 mL，置于盛有225 mL無菌生理鹽水的滅菌杯內(nèi)，混勻，制成1∶10供試液。取上述供試液1 mL，沿管壁緩慢注于9 mL無菌生理鹽水的試管中，混勻，制成1∶100供試液。選擇1∶10、1∶100兩個稀釋度進行計數(shù)。取1 mL樣品勻液于無菌平皿中，每個稀釋度做2個平皿。同時，分別吸取1 mL稀釋液加入2個無菌平皿中，作為空白對照。使用平板計數(shù)（Plate Count Agar，PCA）培養(yǎng)基注皿。于36 ℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)，11組菌落總數(shù)計數(shù)取稀釋度為100的計數(shù)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌液計數(shù)結(jié)果

結(jié)果得到3種菌液的濃度分別為大腸埃希氏8.3×108 CFU/mL、金黃色葡萄球菌7.1×107 CFU/mL、鼠傷寒沙門氏菌5.5×108 CFU/mL，詳見表1。

2.2 回收率測定結(jié)果

根據(jù)表2的結(jié)果，可以看出，該黃酒樣品對本次實驗使用的3種菌的抑菌作用基本都不大，但相較于金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌，對大腸埃希氏菌的回收率影響更小，所以在之后的不確定度評定實驗中選擇大腸埃希氏菌作為本次評定的污染菌株進行研究。

2.3 黃酒菌落總數(shù)計數(shù)結(jié)果

11份大腸埃希菌污染黃酒樣品分析數(shù)據(jù)見表3。

3 不確定度評定

3.1 不確定度來源分析

在日常檢驗過程中影響菌落總數(shù)的檢測結(jié)果的因素有很多，如檢驗人員、環(huán)境、時間、操作等都能對檢驗結(jié)果構(gòu)成不同程度的影響。根據(jù)實際情況進行分析，將不確定度的來源分成系統(tǒng)誤差（A類）和隨機誤差（B類）。A類主要包括樣品處理（稀釋、稱量、均勻度等）和儀器設(shè)備（移液器、培養(yǎng)箱、電子天平等），B類主要包括重復(fù)測定過程中的測試環(huán)境、操作人員、培養(yǎng)條件（包括培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度）等。而微生物學(xué)科屬于非嚴格性、非度量學(xué)一類，A類不確定度對合成不確定度貢獻較小，重復(fù)測量帶來的不確定度占主要部分[2]。因此，本次不確定度評定只考慮其重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度，即對B類誤差的不確定度進行評定。

3.2 不確定度計算

3.2.1 實驗重復(fù)性引入的不確定度

對11份黃酒樣品按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》 （GB 4789.2—2016）進行檢測，得到數(shù)據(jù)見表3。由于實際數(shù)據(jù)相差較大，按照取對數(shù)值的方式進行數(shù)據(jù)處理后再進行統(tǒng)計，結(jié)果見表3。

根據(jù)表3數(shù)據(jù)，再利用貝塞爾公式，計算出樣品標(biāo)準(zhǔn)差[3-5]：

得到不確定度為：=0.083 81/=0.059 3

3.2.2 擴展不確定度

取置信水平95%，v=11，查t分布表，得k=t95（11）=2.201。故擴展不確定度U=kUc=2.201×0.059 3=0.130。

4 結(jié)論與討論

當(dāng)檢驗記錄以11次檢驗對數(shù)值的平均值表示時，其取值區(qū)間分布于-0.130～0.130，其對數(shù)值再取反對數(shù)，得取值區(qū)間分布。樣品菌落總數(shù)lgX=±

0.130）。11個樣品檢驗結(jié)果平均值為26 CFU/mL，為1.398 84，該樣品的菌落總數(shù)的lgX值為1.399±0.130，分布于1.269～1.529，取反對數(shù)，其結(jié)果分布于18.578～33.806 CFU/mL，即第11個樣品菌落總數(shù)的檢驗結(jié)果可估算為18～34 CFU/mL。

本次實驗是按照食品微生物學(xué)檢驗標(biāo)準(zhǔn)來設(shè)計完成，符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求對黃酒的檢驗方法。此次研究根據(jù)不同菌種在黃酒中的回收率選出受黃酒影響較小的菌株加入本身含菌量較少的黃酒中，從而模擬最可能的實際生產(chǎn)情況，提高了本次不確定度評定的可靠性。黃酒產(chǎn)品的日常檢驗中雖然沒有特別針對菌落總數(shù)的限量要求，但是其生產(chǎn)過程有大量微生物繁殖，所以菌落總數(shù)是其出廠檢驗的常規(guī)項目。很多酒廠都有自己的微生物分析實驗室，在進行菌落總數(shù)的不確定度評定時可以參考此法。此法也可用于對其他不同品類的樣品進行不確定度評定，從而確保實驗室檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

參考文獻

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基金項目：2022年度省市場局補助項目“雛鷹計劃”培育初級項目（CY2022234）。

作者簡介：相露婷（1990—），女，浙江紹興人，本科，助理工程師。研究方向：食品檢測方向。