甘肅黨參中花生莖線蟲(chóng)的鑒定與記述

倪春輝，李惠霞，劉永剛，韓 變，石明明，魏雪娟，李文豪，徐雪芬

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室, 甘肅 蘭州 730070；2 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所, 甘肅 蘭州 730070)

莖屬線蟲(chóng)DitylenchusFilipjev隸屬于動(dòng)物界Animalia線蟲(chóng)門(mén)Nematode墊刃目Tylenchida粒科Anguinidae[1]，已報(bào)道的莖屬線蟲(chóng)近100種[2]，但目前被承認(rèn)的莖屬線蟲(chóng)有效種只有60多個(gè)[3]。與其他線蟲(chóng)相比，莖屬線蟲(chóng)具有食性較廣的特點(diǎn)，多數(shù)種以真菌為食，只有少數(shù)種可以侵染高等植物。一般為害植物的塊莖、球莖和鱗莖，也可為害地上部分，引起組織變色、壞死、腐爛和畸形，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。莖屬線蟲(chóng)中危害較大的有水稻莖線蟲(chóng)D.angustus、鱗球莖線蟲(chóng)D.dipsaci、腐爛莖線蟲(chóng)D.destructor、非洲莖線蟲(chóng)D. africanus與食菌莖線蟲(chóng)D.myceliophagus[2,5]。其中，鱗球莖線蟲(chóng)、腐爛莖線蟲(chóng)和水稻莖線蟲(chóng)，可對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害[5]。鱗球莖線蟲(chóng)寄主范圍超過(guò)500種，主要發(fā)生于氣候溫和地帶，危害植物鱗莖及地上部分[6]。腐爛莖線蟲(chóng)可侵染200多種植物，主要發(fā)生于溫帶地區(qū)，為害植物地下部分，在缺少高等植物的情況下還可取食多種真菌[7]。2014年Zhang等[8]在中國(guó)花生主要種植地區(qū)發(fā)現(xiàn)1種新的莖線蟲(chóng)，并將其鑒定為花生莖線蟲(chóng)D. arachis。

中藥黨參為桔梗科Campanulaceae植物黨參Codonopsis pilosula(Franch) Nannf、素花黨參C.pilosula(Franch) Nannf.var.modesta (Nannf.)L.T.Shen或川黨參(C. tangshenOliv.)的干燥根，主要功效為補(bǔ)血、降壓、補(bǔ)中益氣、增強(qiáng)機(jī)體抵抗能力、增加血紅蛋白與紅細(xì)胞、治療貧血和降低血壓等[9]。在甘肅省，黨參主要產(chǎn)于定西、隴南、天水和平?jīng)龅鹊兀a(chǎn)量約占全國(guó)產(chǎn)量的70%和出口量的80%，已成為甘肅省農(nóng)民增收的重要經(jīng)濟(jì)作物之一[10]。目前，已報(bào)道的危害黨參的莖線蟲(chóng)僅有腐爛莖線蟲(chóng)[11]。2019年甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院線蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室在甘肅黨參主產(chǎn)區(qū)調(diào)查黨參線蟲(chóng)病發(fā)生分布時(shí)，發(fā)現(xiàn)1種與腐爛莖線蟲(chóng)差異較大的莖線蟲(chóng)群體，本文擬通過(guò)形態(tài)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，明確黨參中分離的莖線蟲(chóng)分類(lèi)地位，為該線蟲(chóng)的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試線蟲(chóng)分離自甘肅省渭源縣(104° 15′5.76″E，35° 11′ 30.84 ″N)黨參病樣。

1.2 方法

1.2.1 線蟲(chóng)分離 將黨參病樣沖洗干凈，自然晾干后拍照觀察。采用改良貝曼漏斗法[12]分離線蟲(chóng)，將病根切成約1 cm小段，放入漏斗內(nèi)鋪墊的兩層面巾紙上，加水浸沒(méi)黨參根段。10～12 h后，收集指形管中的線蟲(chóng)懸浮液，備用。

將線蟲(chóng)懸浮液移入1.5 mL離心管，用有效氯為5 g/L的 NaClO溶液消毒2 min后，3 000 r/min離心2 min，棄上清液，隨后將下層線蟲(chóng)懸浮液用無(wú)菌水沖洗2～3遍。以5 g/L硫酸鏈霉素與5 g/L氨芐青霉素混合液消毒10 min后，再次離心，吸出消毒液，無(wú)菌水沖洗3遍后定容，在4 ℃條件下保存?zhèn)溆?，方法參考文獻(xiàn)[13]。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定 參照謝輝等[14]方法將線蟲(chóng)溫?zé)釟⑺拦潭ê螅贏xio Lab.A1顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss公司)下觀察形態(tài)特征，并進(jìn)行形態(tài)特征測(cè)量，參照文獻(xiàn)[2,7]方法計(jì)算測(cè)量值。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 參照王江嶺等[15]方法略有改進(jìn)，提取單條線蟲(chóng)DNA。挑取單條雌蟲(chóng)于無(wú)菌水中清洗3遍，然后挑入裝有10 μL 線蟲(chóng)裂解液(Worm lysis buffer，WLB)的 200 μL PCR 反應(yīng)管中，離心后依次在液氮中處理1 min，85 ℃水浴2 min，步驟重復(fù)2次。隨后加入1 mg/mL蛋白酶K 1 μL，于PCR儀中65 ℃溫育1 h，保持95 ℃ 10 min使蛋白酶K失活，14 000 r/min離心5 min，最后于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

采用線蟲(chóng)ITS區(qū)通用引物18S：5′-TTGATT ACGTCCCTGCCCTTT-3′、26S：5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′[16]與 TW81：5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′、AB28：5′-ATATG-CTTAAGTTCAGCGGGT-3′[17]；28S 區(qū)引物 D2A：5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′與 D3B：5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′[18]，對(duì)線蟲(chóng)ITS-rDNA、28S D2/D3基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)采用25 μL體系：上、下游引物(10 μmol/L)各 1 μL，2× SanTaqFast PCR Master Mix (含藍(lán)色染料) 12.5 μL(上海生工)，DNA 模板 3 μL，ddH2O 7.5 μL。

擴(kuò)增程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 10 s， 55 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，38 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，于 4 ℃ 條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后送往北京擎科西安分公司測(cè)序，使用軟件SeqMan進(jìn)行序列拼接，于NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，下載相似性較高的序列，以BI法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)：使用MAFFT比對(duì)分析后，用DAMBE檢測(cè)飽和度，用軟件MrMTgui連接PAUP與MrModelTest進(jìn)行模型選擇，最后使用Mrbayes以最佳模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用FigTree修正發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 特異性引物PCR擴(kuò)增 參照Z(yǔ)hang等[19]花生莖線蟲(chóng)ITS區(qū)特異性引物DARF (5′-GGGAAGGCGAAGCTAAGCTA-3′) 與 DARR(5′-AACTTAGAGGCCAACGAAGCC-3′)，對(duì)“1.2.3”中提取的DNA模板和腐爛莖線蟲(chóng)群體DNA模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min；94 ℃ 10 s，52 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，38 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用25 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。

1.2.5 ITS-rDNA區(qū)段PCR-RFLP分析 選用DdeⅠ、HinfⅠ、Tru9Ⅰ(MseⅠ)、SduⅠ這 4 種內(nèi)切酶，參照Subbotin等[20]的方法對(duì)線蟲(chóng)ITS-rDNA區(qū)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切體系20 μL：PCR純化產(chǎn)物 8 μL，內(nèi)切酶 (10 U/μL)1 μL，與內(nèi)切酶相對(duì)應(yīng)的Buffer 2 μL，ddH2O 9 μL。37 ℃ 條件下反應(yīng) 1.5 h，以腐爛莖線蟲(chóng)作為對(duì)照。反應(yīng)產(chǎn)物用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。使用在線軟件Wbcuter 2.0(http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html)分析酶切片段長(zhǎng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)描述

雌蟲(chóng)：蟲(chóng)體圓柱形，兩端較細(xì)，經(jīng)溫?zé)釟⑺篮蟪省癑”字型，尾部稍向腹部彎曲(圖1A)。唇區(qū)低平，稍有溢縮?？卺橀L(zhǎng)8.2～9.8 μm。中食道球梭形，有瓣?；壳蜉^發(fā)達(dá)(圖1B)，半月體較清晰，位于排泄孔前1至數(shù)個(gè)體環(huán)處(圖1C)。食道腺稍覆蓋于腸背部。側(cè)線6條。陰門(mén)橫裂，稍有突起，位于蟲(chóng)體后端。單生殖腺前伸，后陰子宮囊發(fā)達(dá)，長(zhǎng)度是肛陰距的55%。尾部向末端逐漸變窄，端圓(圖1D、1G)。

圖1 花生莖線蟲(chóng)的光學(xué)顯微鏡結(jié)果Fig. 1 Light photomicrographs of Ditylenchus arachis

雄蟲(chóng)：除生殖系統(tǒng)外，與雌蟲(chóng)相似。交合刺后端向腹面彎曲，引帶較短；交合傘明顯，較長(zhǎng)，自交合刺前端向后延伸，約至尾長(zhǎng)的70%(圖1E)。

2.2 形態(tài)特征指標(biāo)

對(duì)分離得到的莖線蟲(chóng)群體進(jìn)行形態(tài)特征測(cè)量，將其測(cè)量值與花生莖線蟲(chóng)河北群體測(cè)量值進(jìn)行比較(表1)，甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體與花生莖線蟲(chóng)河北群體的形態(tài)特征測(cè)量均值雖存在差異，其中，甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體除體長(zhǎng)、陰門(mén)至頭端的長(zhǎng)度與體長(zhǎng)的比值、尾長(zhǎng)均值略大外，其他均值均略小。但是所有測(cè)量范圍值基本一致，故根據(jù)形態(tài)學(xué)特征初步將甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體鑒定為花生莖線蟲(chóng)。

表1 甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體與河北原始群體測(cè)量值比較1)Table 1 Morphometrics comparison of Ditylenchus arachis population from Codonopsis pilosula in Gansu with original Hebei population of D. arachis

2.3 特異性引物檢測(cè)

采用花生莖線蟲(chóng)特異性引物對(duì)甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體與腐爛莖線蟲(chóng)群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果(圖2)顯示，甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體擴(kuò)增條帶為150～200 bp，符合花生莖線蟲(chóng)特異性引物擴(kuò)增條帶長(zhǎng)度(171 bp)，而腐爛莖線蟲(chóng)未擴(kuò)增到任何片段。

圖2 甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體與腐爛莖線蟲(chóng)ITS特異性引物擴(kuò)增電泳圖Fig. 2 Electrophoresis of PCR products amplified from Ditylenchus arachis from Codonopsis pilosula in Gansu and D. destructor using species-specific ITS primers

2.4 分子生物學(xué)特征

采用線蟲(chóng)ITS區(qū)通用引物18S、26S與TW81、AB28雙向測(cè)序后拼接序列，比對(duì)后得到引物TW81、AB28擴(kuò)增的具體序列長(zhǎng)度，為816 bp，上傳至NCBI獲得序列號(hào)為MW207369和MW207370。28S區(qū)引物D2A與D3B雙向測(cè)序后拼接序列，得到序列長(zhǎng)度為777 bp，上傳至NCBI，獲得序列號(hào)為MW207367和MW207368。NCBI中BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體ITS-rDNA序列與河北花生莖線蟲(chóng)群體KX426050序列相似性為99.75%，僅存在2個(gè)堿基差異；28S D2/D3區(qū)序列與河北花生莖線蟲(chóng)群體KX426054序列相似性為100%，無(wú)堿基差異。

基于ITS-rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3A)，甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體與花生莖線蟲(chóng)聚為一枝，與腐爛莖線蟲(chóng)聚為一大枝，結(jié)果表明甘肅莖線蟲(chóng)群體ITS-rDNA序列與花生莖線蟲(chóng)親緣關(guān)系最近，其次為腐爛莖線蟲(chóng)，與其他莖屬線蟲(chóng)距離較遠(yuǎn)。

圖3 基于 ITS-rDNA (A) 和28s D2/D3 (B)的甘肅黨參莖線蟲(chóng)(GSDA1、GSDA2)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree of stem nematode (GSDA1、GSDA2) from Codonopsis pilosula in Gansu Province based on ITS-rDNA (A) and 28s D2/D3 (B)

采用貝葉斯法構(gòu)建28S D2/D3區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3B)。結(jié)果顯示，甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體與花生莖線蟲(chóng)聚為一支，與腐爛莖線蟲(chóng)聚為一大支，表明甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體28S D2/D3區(qū)序列與花生莖線蟲(chóng)親緣關(guān)系最近，其次為腐爛莖線蟲(chóng)，與其他莖屬線蟲(chóng)距離較遠(yuǎn)。據(jù)此，將甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體鑒定為花生莖線蟲(chóng)。

2.5 ITS-rDNA區(qū)段PCR-RFLP分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載花生莖線蟲(chóng)序列KX426050，使用軟件BioEdit與線蟲(chóng)ITS-rDNA通用引物TW81/AB28比對(duì)，截去序列兩端，得到以引物TW81/AB28擴(kuò)增的花生莖線蟲(chóng)序列。以軟件Wbcuter 2.0使用4種內(nèi)切酶DdeⅠ、HinfⅠ、SduⅠ、Tru9Ⅰ(MseⅠ)對(duì)甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體、花生莖線蟲(chóng)與腐爛莖線蟲(chóng)進(jìn)行酶切，得到酶切片段數(shù)量及大小(表2)。由表2可知，甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體與花生莖線蟲(chóng)群體酶切片段大小一致，且明顯區(qū)別于腐爛莖線蟲(chóng)。以內(nèi)切酶DdeⅠ、HinfⅠ、Tru9Ⅰ(MseⅠ)和SduⅠ對(duì)甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體與腐爛莖線蟲(chóng)ITS-rDNA區(qū)PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行酶切，結(jié)果如圖4所示，結(jié)果與使用軟件Wbcuter 2.0的酶切結(jié)果一致，甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體與腐爛莖線蟲(chóng)群體酶切結(jié)果存在明顯差異。

表2 軟件Wbcuter酶切甘肅黨參莖線蟲(chóng)和腐爛莖線蟲(chóng)ITS序列結(jié)果Table 2 Enzyme digestion results of Ditylenchus arachis population from Codonopsis pilosula in Gansu and D. destructor ITS sequences by Wbcuter bp

圖4 腐爛莖線蟲(chóng)(A)與甘肅黨參莖線蟲(chóng)(B)ITS-rDNA區(qū)段PCR-RFLP結(jié)果Fig. 4 Electrophoresis of ITS-rDNA amplified by PCR-RFLP for Ditylenchus destructor (A) and D. arachis population in Gansu (B)

3 討論與結(jié)論

莖線蟲(chóng)屬是植物線蟲(chóng)病害中一類(lèi)重要的病原，也是最難進(jìn)行種類(lèi)鑒定的屬之一，大多數(shù)種類(lèi)的特征描述仍然存在著不完善的問(wèn)題[2,4]?；ㄉo線蟲(chóng)病普遍發(fā)生于我國(guó)花生主產(chǎn)區(qū)，一段時(shí)間誤認(rèn)為是腐爛莖線蟲(chóng)為害，章淑玲[21]對(duì)采集到的線蟲(chóng)群體，進(jìn)行形態(tài)特征與分子特征的比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該種雖與腐爛莖線蟲(chóng)親緣關(guān)系較近，卻與腐爛莖線蟲(chóng)存在差異，明顯區(qū)別于其他莖屬線蟲(chóng)，將其命名為花生莖線蟲(chóng)D. arachis。本研究對(duì)采集的甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體進(jìn)行鑒定，通過(guò)形態(tài)特征與分子特征比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該線蟲(chóng)群體形態(tài)特征與花生莖線蟲(chóng)相符，形態(tài)測(cè)量值除體長(zhǎng)、陰門(mén)至頭端的長(zhǎng)度與體長(zhǎng)比、尾長(zhǎng)均值略大外，其他測(cè)量值均值均略小，但是所有測(cè)量范圍基本一致，差異可能是地理環(huán)境因素造成的。通過(guò)ITS-rDNA與28S D2/D3區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體與花生莖線蟲(chóng)群體聚為一支，明顯區(qū)別于腐爛莖線蟲(chóng)。花生莖線蟲(chóng)特異性引物PCR擴(kuò)增與ITS-rDNA區(qū)段PCR-RFLP結(jié)果顯示，甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體與花生莖線蟲(chóng)群體ITS-rDNA區(qū)段無(wú)明顯差異。綜上所述，將甘肅黨參莖線蟲(chóng)群體鑒定為花生莖線蟲(chóng)。

花生莖線蟲(chóng)主要為害花生地下部分，發(fā)病植株呈現(xiàn)矮化、黃化癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致全株枯死，植株地下部分表現(xiàn)出根系發(fā)育不良、固氮根瘤減少、結(jié)莢數(shù)減少、果莢表面呈黑褐色腐爛斑、種皮褐變皺縮等癥狀，線蟲(chóng)可侵染花生的果莢、種粒、胚栓及根莖，研究表明，2年內(nèi)干燥的果莢和種皮還可分離出線蟲(chóng)[22]。本研究采集的發(fā)病黨參，蘆頭部表面呈黑褐色腐爛斑、表皮褐變皺縮等癥狀，與花生莖線蟲(chóng)為害花生果莢癥狀相似，但由于分離得到的線蟲(chóng)群體較少，未得到大量繁殖群體，致病性測(cè)定困難，故花生莖線蟲(chóng)是否為害黨參及為害時(shí)具體癥狀需要進(jìn)一步研究。

研究表明該線蟲(chóng)適生性強(qiáng)、食性廣、抗逆性強(qiáng)，對(duì)其他作物有潛在危害風(fēng)險(xiǎn)，是一種危害較大的病原線蟲(chóng)[23-25]。該線蟲(chóng)經(jīng)緩慢脫水處理，在-80 ℃條件下保存35 d后，仍有部分線蟲(chóng)可以復(fù)蘇為害[24]?；ㄉ韵矞嘏N子萌發(fā)溫度較高，生長(zhǎng)最適溫度為23～30 ℃[26-27]。黨參喜冷涼濕潤(rùn)氣候，最適溫度18～20 ℃[28]。渭源縣黨參種植區(qū)溫度較低，由于采集環(huán)境存在較大差異，本研究采集線蟲(chóng)群體與河北地區(qū)花生莖線蟲(chóng)群體在致病性、適生性等方面是否存在差異，有待進(jìn)一步研究分析。

本研究對(duì)甘肅省渭源縣黨參病樣中分離的莖線蟲(chóng)，結(jié)合形態(tài)特征與分子特征進(jìn)行鑒定，將其鑒定為花生莖線蟲(chóng)，結(jié)果表明花生莖線蟲(chóng)已在甘肅省定殖。甘肅省渭源縣以中藥材和馬鈴薯為主要經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)品為地下塊根和塊莖，而線蟲(chóng)主要為害植物地下部，因此，應(yīng)該對(duì)該地區(qū)線蟲(chóng)病害予以足夠的重視。