袁 婷,羅龍輝,張雪吟,劉吉平
(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院/亞太地區(qū)蠶桑培訓(xùn)中心, 廣東 廣州 510642)
桑樹是一種藥食同源的多年生木本植物,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、畜牧養(yǎng)殖等各個行業(yè)中[1-3]。桑樹病害的發(fā)生一直制約著蠶桑產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展,其中,桑樹青枯病作為一種毀滅性的細(xì)菌性檢疫病害,嚴(yán)重影響了桑樹的產(chǎn)量和質(zhì)量[4]。1969年廣東省順德市首次報道了桑樹青枯病的發(fā)生[5],隨后傳播至廣東大部分的桑樹種植區(qū)。至今,桑青枯病仍在廣東、廣西等地的蠶桑主產(chǎn)區(qū)流行發(fā)生,并在全國范圍內(nèi)的桑園種植地多有發(fā)生報道[6-7]。桑樹青枯病的病原菌為茄科雷爾氏菌Ralstonia solanacearum,茄科雷爾氏菌的寄主范圍廣,能感染桑樹在內(nèi)的450余種植物的根或莖,根據(jù)其對不同寄主致病性差異的分類報道,侵染桑樹的茄科雷爾氏菌多為5號生理小種[8-9]。由于茄科雷爾氏菌種類多,存在不同的致病變種,且致病機(jī)理復(fù)雜又危害嚴(yán)重,被世界各國的檢疫部門列入植物生產(chǎn)和出口貿(mào)易的重點檢疫對象[10-12]。
建立高效快速的桑樹青枯病病原茄科雷爾氏菌檢測技術(shù),不僅對桑樹苗木的流通和檢疫提供技術(shù)支持、為桑樹產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展保駕護(hù)航,還對各種作物青枯病的防控有重要的參考價值。目前,有關(guān)青枯病的病原菌茄科雷爾氏菌的分子檢測技術(shù)主要有各種的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法[13-14]和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增 (Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)[15]。然而這2種檢測技術(shù)在實際應(yīng)用中均存在一定的局限性,如PCR法檢測時間相對較長,靈敏度低,在桑樹青枯病的檢測中效果不明顯[16];而LAMP技術(shù)雖有檢測靈敏度高、反應(yīng)時間短等優(yōu)點,但環(huán)境的氣溶膠往往影響檢測結(jié)果的可靠性或引起假陽性[17-18]。等溫多自配引發(fā)擴(kuò)增 (Isothermal multiple self-matching-initiated amplification,IMSA)技術(shù)是2015年馬學(xué)軍團(tuán)隊發(fā)明的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)[19-20],該技術(shù)主要針對靶基因設(shè)計6條引物,并能特異性地識別7個基因位點,與LAMP和熒光定量PCR相比具有更強(qiáng)的特異性及更高的靈敏度,在食品安全、動物健康養(yǎng)殖、人畜共患病病原的檢測應(yīng)用中證實是可靠的[21-24],但有關(guān)IMSA檢測植物病原菌特別是桑樹青枯病病原的報道較少。
本研究擬以茄科雷爾氏菌果膠裂解酶基因(Pectate lyase gene)為靶標(biāo),嘗試融合IMSA引物設(shè)計策略和LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的技術(shù)體系,建立一種快速高效的茄科雷爾氏菌IMSA-LAMP檢測技術(shù),并對其反應(yīng)體系和實用性等進(jìn)行優(yōu)化,以期為桑樹細(xì)菌病檢測、桑樹青枯病檢疫和桑樹種苗的流通提供新的檢測技術(shù)和手段。
2020—2021年從廣東、廣西兩地的桑園采集了疑似桑青枯病癥狀的莖及根共24份,如表1所示。
表1 桑樹青枯病田間病樣Table 1 Field samples of mulberry bacterial wilt
桑青枯病病原菌茄科雷爾氏菌菌株YZqk1、YLqk1(GDMCC No.:1.1615)、XZqk2(GDMCC No.:1.1619)、XCqk4(GDMCC No.:1.1616)、LZqk5(GDMCC No.:1.1617)、YDqk6(GDMCC No.:1.1620)和其他桑源細(xì)菌菌株:陰溝腸桿菌XCYG-001(GDMCC No.:1.1600)、克雷伯氏菌 LCKL-001(GDMCC No.:1.1602)、菠蘿泛菌 LCFJ-001(GDMCC No.:1.1601)、銅綠假單胞菌 YD-001(GDMCC No.:60613)、丁香假單胞菌 ZJDX-003(GDMCC No.:61844)、多黏類芽孢桿菌 YD-002(GDMCC No.:61095)、短小桿菌 YDDX-001、芽孢桿菌YD-003,均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞太地區(qū)蠶桑培訓(xùn)中心實驗室分離鑒定,含GDMCC No.的菌種由廣東省菌種保藏中心保藏。
30 ℃條件下,將茄科雷爾氏菌菌株置于TTC瓊脂培養(yǎng)基[25]培養(yǎng)5 d,將非茄科雷爾氏菌菌株接種于LB瓊脂培養(yǎng)基[25]培養(yǎng)2 d。
供試細(xì)菌根據(jù)Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司,以下簡稱為“生工”]說明書提取總DNA。供試病樣及健康桑樹樣本根據(jù)Ezup柱式植物總DNA抽提試劑盒(生工)說明書提取總DNA。DNA提取后,利用超微量分光光度計(NDlife)進(jìn)行濃度測定,用TE緩沖液稀釋到10 ng/μL左右,-20 ℃保存?zhèn)溆?,作為后續(xù)檢測的模板。
IMSA-LAMP引物設(shè)計,如圖1A所示,在IMSA-LAMP檢測中使用了6種引物,包括2種莖引物(SteF和SteR)和2對嵌套雜交引物(2個外引物DsF和DsR和2個內(nèi)引物FIT和RIT);引物特異性識別靶基因的7個不同區(qū)域,從5′端標(biāo)記為F3、F2、F1、T、R1c、R2c和 R3c;DsF 和 DsR 引物由F3和R3以及F1c和R1c序列組成,F(xiàn)IT和RIT引物由F2和R2以及Tc和T序列組成,SteF和SteR引物分別是R1c和F1c序列[26]。IMSA-LAMP擴(kuò)增原理如圖1B所示,為便于說明,DNA合成從DsF開始,F(xiàn)IT被設(shè)置為起始過程(DNA合成以類似方式在DsR和RIT中進(jìn)行);帶箭頭的水平直線代表底物延長方向,帶箭頭的斜線代表與目標(biāo)位點退火的引物,帶箭頭的弧線表示2個區(qū)域的自動匹配。在該步驟中,生成了4種不同長度的基本自匹配結(jié)構(gòu)(SMS-1~SMS-4)[26]。根據(jù)NCBI報道的茄科雷爾氏菌果膠裂解酶基因(WP_197360060.1)序列,利用引物在線設(shè)計軟件(http://primerexplorer.jp/elamp 5.0.0/index.html)設(shè)計之后,根據(jù)引物可能存在的二聚體和相近的退火溫度,調(diào)整并設(shè)計出6套IMSALAMP檢測的引物組。所有引物均由擎科生物有限公司合成,引物均用HPLC法純化,引物序列見表2。
圖1 IMSA-LAMP引物設(shè)計(A)及擴(kuò)增(B)示意圖[26]Fig. 1 Schematic diagram of primer design (A) and amplification (B) for IMSA-LAMP [26]
表2 用于擴(kuò)增茄科雷爾氏菌果膠裂解酶基因的引物序列Table 2 Primer sequences used for amplifying pectate lyase genes of Ralstonia solanacearum
以提取的供試細(xì)菌、疑似桑樹青枯病病樣及健康桑樹樣本DNA為模板,對茄科雷爾氏菌果膠裂解酶基因片段進(jìn)行熒光定量PCR特異性擴(kuò)增。擴(kuò)增體系:2× LAMP Master Mix 12.5 μL(生工),DNA Polymerase 0.5 μL(生工),Sterilized ddH2O 8.0 μL(生工),5×103mmol SYTOTM9 核酸染料 1 μL(Thermo Fisher Scientific),引物 Mix 1.0 μL(外引物、莖引物、內(nèi)引物體積比為 1∶4∶8),DNA 模板 2.0 μL,共 25.0 μL。反應(yīng)程序:63 ℃ 1 min,80 ℃ 1 min;將63 ℃ 1 min作為1個循環(huán),設(shè)計45個循環(huán)。
為了驗證“1.4”篩選的引物檢測桑樹青枯病病菌的特異性,以桑源茄科雷爾氏菌及非茄科雷爾氏菌菌株進(jìn)行IMSA-LAMP引物特異性試驗,以健康桑樹DNA作為陰性對照、無菌水為空白對照、茄科雷爾氏菌DNA為陽性對照,反應(yīng)條件同“1.5”。
為保證茄科雷爾氏菌DNA能在IMSALAMP體系中達(dá)到最佳擴(kuò)增效果,在上述“1.5”反應(yīng)擴(kuò)增體系基礎(chǔ)上,對引物比例進(jìn)行篩選。以10 ng/μL的茄科雷爾氏菌YZqk1 DNA為模板,以“1.6”最佳引物組為擴(kuò)增引物,設(shè)置4組不同的引物濃度比例,即外引物(100 μmol/L)、莖引物(100 μmol/L)、內(nèi)引物 (100 μmol/L)體積比依次為1∶4∶8、1∶2∶4、1∶1∶2、1∶8∶4,見表3。使用熒光定量PCR儀進(jìn)行IMSA-LAMP擴(kuò)增,根據(jù)起始擴(kuò)增時間及熒光強(qiáng)度等選擇最佳引物濃度比例。
表3 外、莖、內(nèi)引物體積配比Table 3 Volume ratio of outer, stem and inner primers μL
以10 ng/μL的茄科雷爾氏菌YZqk1 DNA為模板,在 61.5、62.0、62.5、63.0、63.5、64.0、64.5和65.0 ℃ 8個反應(yīng)溫度下,通過熒光定量PCR儀進(jìn)行IMSA-LAMP擴(kuò)增,反應(yīng)體系見“1.5”。通過比較不同反應(yīng)溫度的熒光擴(kuò)增曲線,獲得最佳反應(yīng)溫度。
將茄科雷爾氏菌YZqk1純培養(yǎng)后置于25 mL LB肉湯中擴(kuò)增培養(yǎng),于28 ℃條件下培養(yǎng)48 h,用稀釋涂布計數(shù)方法將菌液濃度稀釋成1×106CFU/mL,取1 mL于離心機(jī)中12 000 r/min離心4 min,取沉淀,根據(jù)Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取總DNA。利用超微量分光光度計進(jìn)行濃度測定,按10倍稀釋法用TE緩沖液將DNA梯度稀釋7次,具體計算公式:稀釋后DNA濃度=稀釋前DNA濃度÷10稀釋次數(shù),將每個梯度作為模板進(jìn)行IMSA-LAMP檢測,反應(yīng)體系見“1.5”。選擇優(yōu)化后的引物、引物濃度比例及反應(yīng)溫度,根據(jù)熒光擴(kuò)增曲線判定檢測結(jié)果;同時,采用Primer Premier 5.0軟件對茄科雷爾氏菌果膠裂解酶基因設(shè)計1對PCR檢測引物:PL-F(AGCTTGCTCGCTTTGAGCTGCTGCAAGACC)/PL-R(TGATCGCCCGAACAACCATTTCCAGA CGCC),擬擴(kuò)增的目的片段長度為135 bp,并利用該引物對模板進(jìn)行PCR檢測,反應(yīng)體系為2× Taq PCR Master Mix 12.5 μL(生工),10 μmol/L 引物 PLF、PL-R 各 1 μL,DNA 模板 2 μL,Sterilized ddH2O補(bǔ)足至25 μL;擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 變性 30 s、55 ℃ 退火 30 s、72 ℃ 延伸30 s,30個循環(huán);72 ℃ 最終延伸 8 min,于4 ℃ 保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μL經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。
將廣東、廣西地區(qū)收集的24份疑似桑樹青枯病病樣(表1)提取DNA后,進(jìn)行IMSA-LAMP檢測,并取1份健康桑樹樣本為陰性對照、茄科雷爾氏菌YZqk1 DNA為陽性對照。反應(yīng)體系見“1.5”,其中引物、引物濃度比例及反應(yīng)溫度均選擇優(yōu)化后的結(jié)果,并通過熒光擴(kuò)增曲線進(jìn)行判讀;同時利用“1.9”的PCR反應(yīng)體系和參數(shù)進(jìn)行同步平行檢測。
將本研究設(shè)計的6組引物(表2)進(jìn)行IMSALAMP檢測,檢測結(jié)果如圖2所示。引物組1~6均出現(xiàn)了擴(kuò)增曲線,引物組6于反應(yīng)20 min時最先出現(xiàn)上升趨勢,35 min后反應(yīng)進(jìn)入平緩期;而其他引物組均在反應(yīng)25 min后才出現(xiàn)擴(kuò)增。因此,選擇引物組6作為IMSA-LAMP法最佳引物組;最佳引物組6的6條引物結(jié)合位置及7個特異識別位點,如圖3所示。
圖2 IMSA-LAMP 6組引物對茄科雷爾氏菌的檢測結(jié)果Fig. 2 Detection results of Ralstonia solanacearum under six primer groups of IMSA-LAMP
圖3 IMSA-LAMP引物組6的6條檢測引物的位置及7個特異識別位點Fig. 3 Locations of six primers of primer group 6 and their seven specific recognition sites in IMSA-LAMP
利用IMSA-LAMP對6株茄科雷爾氏菌及8株非茄科雷爾氏菌DNA進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖4所示。6株茄科雷爾氏菌(YZqk1、YLqk1、XZqk2、XCqk4、LZqk5、YDqk6)均在 45 min內(nèi)出現(xiàn)了“S”擴(kuò)增曲線(圖4:曲線1~6)。其他8株非茄科雷爾氏菌、無菌水及健康桑樹DNA均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線 (圖4:曲線 7~17)。表明,IMSA-LAMP檢測方法篩選的引物能有效地檢測茄科雷爾氏菌。
圖4 茄科雷爾氏菌IMSA-LAMP特異性檢測結(jié)果Fig. 4 Specific detection results of IMSA-LAMP forRalstonia solanacearum
設(shè)置外、莖、內(nèi)引物濃度比例為 1∶4∶8、1∶2∶4、1∶1∶2、1∶8∶4,以 10 ng/μL 的茄科雷爾氏菌 YZqk1 DNA為模板進(jìn)行IMSA-LAMP擴(kuò)增,擴(kuò)增溫度為63 ℃,反應(yīng)時間為45 min,結(jié)果如圖5所示。4種不同引物濃度比例均出現(xiàn)了“S”曲線,當(dāng)外、莖、內(nèi)引物濃度比例為1∶4∶8時,起始擴(kuò)增時間最短,為12 min,25 min到達(dá)擴(kuò)增的平緩期;當(dāng)外、莖、內(nèi)引物濃度比例為1∶8∶4時,起始擴(kuò)增時間為14 min,30 min達(dá)平緩期;當(dāng)外、莖、內(nèi)引物濃度比例為1∶2∶4 時,起始擴(kuò)增時間為 23 min,35 min 達(dá)到平緩期;當(dāng)外、莖、內(nèi)引物濃度比例為1∶1∶2時,起始擴(kuò)增時間為25 min,45 min內(nèi)未出現(xiàn)平緩期。最終可確定最佳外、莖、內(nèi)引物比例為1∶4∶8。
圖5 不同外、莖、內(nèi)引物濃度比例下茄科雷爾氏菌IMSA-LAMP檢測結(jié)果Fig. 5 IMSA-LAMP detection results of Ralstonia solanacearum under different concentration ratios of outer, stem and inner primers
根據(jù)最佳引物比例進(jìn)行IMSA-LAMP反應(yīng)溫度篩選,設(shè)置溫度梯度為 61.5、62.0、62.5、63.0、63.5、64.0、64.5及 65.0 ℃,結(jié)果如圖6所示。在61.5~65.0 ℃時,均有擴(kuò)增曲線。在64.5 ℃時,起始擴(kuò)增時間最短,為13 min,于24 min到達(dá)擴(kuò)增的平緩期;在65.0 ℃時,在14 min曲線開始擴(kuò)增,于25 min達(dá)到擴(kuò)增平緩期;在61.5~64.0 ℃時,均在反應(yīng)15 min后開始擴(kuò)增,于30 min后達(dá)到擴(kuò)增平緩期。故選擇64.5 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。
圖6 不同反應(yīng)溫度茄科雷爾氏菌IMSA-LAMP檢測結(jié)果Fig. 6 Detection results of IMSA-LAMP for Ralstonia solanacearum at different reaction temperatures
茄科雷爾氏菌YZqk1純培養(yǎng)后,取1 mL 1×106CFU/mL的菌懸液,根據(jù)Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取總DNA,并利用超微量分光光度計進(jìn)行濃度測定,其DNA質(zhì)量濃度為2 ng/μL,10倍濃度梯度稀釋7次,DNA質(zhì)量濃度為 2 ng/μL~200 ag/μL,對應(yīng)菌為 1×106~1×10-2CFU/mL,將每個梯度作為模板進(jìn)行IMSALAMP檢測,并利用PCR進(jìn)行平行檢測作為對照。IMSA-LAMP檢測結(jié)果如圖7所示,茄科雷爾氏菌YZqk1 DNA 質(zhì)量濃度為 2 ng/μL~200 fg/μL(對應(yīng)菌為 1×106~1×102CFU/mL),均出現(xiàn)了擴(kuò)增曲線;而DNA 質(zhì)量濃度在 20 fg/μL~200 ag/μL(對應(yīng)菌為1×10~1×10-2CFU/mL)未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。因此,IMSA-LAMP對茄科雷爾氏菌最低DNA檢測質(zhì)量濃度為200 fg/μL,對應(yīng)菌為1×102CFU/mL。另外,PCR檢測到的桑樹茄科雷爾氏菌YZqk1最低DNA質(zhì)量濃度為 20 pg/μL,對應(yīng)菌為 1×104CFU/mL(圖8)。IMSA-LAMP檢測桑樹茄科雷爾氏菌具有良好的靈敏度,是PCR的100倍。
圖7 IMSA-LAMP對茄科雷爾氏菌靈敏度的檢測結(jié)果Fig. 7 Sensitivity test results of IMSA-LAMP for Ralstonia solanacearum
圖8 PCR對茄科雷爾氏菌靈敏度檢測結(jié)果Fig. 8 Sensitivity test results of PCR for Ralstonia solanacearum
將收集的24份疑似桑樹青枯病病樣提取DNA后,利用IMSA-LAMP法與PCR法進(jìn)行試驗,評估2種檢驗方法的檢測結(jié)果。IMSALAMP檢測結(jié)果如圖9所示,收集的疑似桑樹青枯菌病樣中,有21份樣本出現(xiàn)了“S”擴(kuò)增曲線(曲線2~22),廣西壯族自治區(qū)環(huán)江市及忻城市3份疑似桑樹青枯病病樣未出現(xiàn)擴(kuò)增現(xiàn)象(曲線23~25),檢出率為87.5%。同步進(jìn)行的PCR法,其中9份樣品為陽性,15份樣品為陰性(圖10),檢出率為37.5%,9份PCR檢測陽性的樣本在IMSALAMP法檢測結(jié)果中也為陽性,說明2種方法有一定的重復(fù)性,但I(xiàn)MSA-LAMP法的檢出率明顯高于PCR。
圖9 IMSA-LAMP對不同地區(qū)疑似桑樹青枯病病樣的檢測結(jié)果Fig. 9 Detection results of suspected mulberry bacterial wilt samples from different districts by IMSALAMP
圖10 PCR對不同地區(qū)疑似桑樹青枯病病樣的檢測結(jié)果Fig. 10 Detection results of suspected mulberry bacterial wilt samples from different districts by PCR
桑樹青枯病作為一種毀滅性的細(xì)菌性病害,被國家列為重點檢疫對象[27]。建立一種桑樹茄科雷爾氏菌快速有效的檢測方法,對預(yù)防桑樹青枯病的發(fā)生和擴(kuò)散具有重要的意義。桑樹青枯病病原檢測方法分為傳統(tǒng)分離技術(shù)及分子檢測技術(shù)。傳統(tǒng)分離技術(shù)主要是通過病樣組織分離病原菌的方式分離出桑樹茄科雷爾氏菌,但操作繁瑣,分離時間長,結(jié)果受人為影響大;隨著分子檢測技術(shù)的快速發(fā)展,核酸檢測技術(shù)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療診斷、動植物安全生產(chǎn)、食品安全及動植物檢疫等檢測中,大大提高檢測效率[28-30]。其中,LAMP是常見的核酸檢測技術(shù),本研究前期將LAMP技術(shù)應(yīng)用于蠶、桑病害的檢測研究,能有效檢測出蠶桑病毒、細(xì)菌及真菌等病原物[31-33]。而IMSA技術(shù)的優(yōu)點在于引物結(jié)合位點多,相較于LAMP技術(shù)擁有更高的靈敏度及特異性。Chen等[34]應(yīng)用IMSA法對牛奶樣品中金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus進(jìn)行檢測,靈敏度比LAMP方法高10倍;Liu等[35]對人畜共患病病原腸毒素大腸埃希菌(EnterotoxigenicEscherichia coli,ETEC)進(jìn)行了IMSA的檢測應(yīng)用研究,相比于熒光定量PCR、LAMP、交叉引物等溫擴(kuò)增技術(shù)具有更高的靈敏度。同樣地,本研究將LAMP反應(yīng)體系與IMSA引物設(shè)計原理相結(jié)合應(yīng)用于桑樹青枯病的茄科雷爾氏菌檢測,試驗結(jié)果顯示,IMSALAMP檢測技術(shù)明顯優(yōu)于PCR的檢測結(jié)果,本方法節(jié)約時間,且結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
果膠酶是一類分解果膠物質(zhì)的酶的總稱,在細(xì)菌生長和繁殖代謝過程中都能合成,而果膠裂解酶基因在青枯菌侵染植物過程中發(fā)揮了重要作用[36-37]。本研究在以NCBI登錄的茄科雷爾氏菌基因組分析的基礎(chǔ)上,以茄科雷爾氏菌果膠裂解酶基因(WP_197360060.1)序列為靶基因序列,進(jìn)行了引物設(shè)計與篩選,經(jīng)試驗結(jié)果比較確定引物組6為最終的檢測引物組。通過對茄科雷爾氏菌及桑源其他細(xì)菌的進(jìn)行IMSA-LAMP檢測,發(fā)現(xiàn)僅有茄科雷爾氏菌DNA樣本出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,表明本研究建立的IMSA-LAMP檢測技術(shù)特異性明顯。對反應(yīng)溫度及引物比例進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明外、莖、內(nèi)引物濃度比例為1∶4∶8,恒溫64.5 ℃的熒光定量PCR儀在45 min內(nèi)可完成檢測,該方法比常規(guī)PCR方法快60 min以上,反應(yīng)結(jié)果可通過熒光擴(kuò)增曲線出現(xiàn)的先后進(jìn)行快速判定,本研究建立的IMSA-LAMP法檢測茄科雷爾氏菌DNA最低質(zhì)量濃度達(dá)200 fg/μL,對應(yīng)的菌為1×102CFU/mL,比Okiro等[38]與李信申等[39]報道的青枯病LAMP檢測方法的靈敏度高10倍左右,是常規(guī)PCR檢測法靈敏度的100倍,同樣的結(jié)果在Gou等[40]使用IMSA檢測豬圓環(huán)病毒PCV3的應(yīng)用中得到佐證。
在對采自田間的24份疑似桑樹青枯病樣本檢測中,IMSA-LAMP檢測出21份樣本,3份樣本未檢測出桑茄科雷爾氏菌;同時利用PCR法對24份病樣進(jìn)行平行檢測,PCR僅檢測出9份,這9份樣本也同時印證了IMSA-LAMP的檢測結(jié)果。對于其他IMSA-LAMP檢測出而PCR未能檢測出的陽性樣本,我們分析有2種原因,一是說明IMSALAMP檢測方法更加靈敏,這個推測已經(jīng)在本研究純茄科雷爾氏菌模板檢測中得到驗證;二是說明導(dǎo)致桑樹青枯和枯萎癥狀的病原菌種類很多,本研究課題組已經(jīng)相繼在桑樹枯萎的病樣中分離出陰溝腸桿菌[25,41]、菠蘿泛菌[42]及克雷伯氏菌[43]。而陰溝腸桿菌、菠蘿泛菌及克雷伯氏菌作為機(jī)會性植物致病病原菌,在生產(chǎn)中導(dǎo)致植物枯萎的機(jī)理仍有待深入研究。綜上,本研究建立的茄科雷爾氏菌的IMSA-LAMP檢測方法準(zhǔn)確可靠,可用于大批量桑樹青枯病的快速分子診斷,為桑樹細(xì)菌病檢測和防疫提供了新技術(shù)支持。
致謝:試驗過程中得到華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院碩士研究生孟芳、王亞琴等的幫助,LAMP檢測試劑得到廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司張璜博士與林夢蝶實驗員的大力支持。