秦榮秀，楊 漓，李桂珍，谷 瑤

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，南寧 530002）

0 引言

多穗石柯(Lithocarpus polystachyus)又名甜茶，廣泛分布于廣西壯族自治區(qū)平果、隆林、馬山、巴馬和龍州等地區(qū)[1-2]，其嫩葉可作為茶葉飲用，具有解暑、治療肺熱和咳嗽等作用[3]。多穗石柯是一種藥食同源性植物，其主要化學(xué)成分是黃酮類和三萜類。黃酮類中的根皮苷、三葉苷和3-羥基根皮苷是多穗石柯主要的甜味物質(zhì)，主要分布于多穗石柯葉片中[4-5]。根皮苷作為中國(guó)民間中藥的主要活性成分之一，具有降血糖、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等多種藥理作用[6]，已被證實(shí)可以作為SGLT2抑制劑，促進(jìn)葡萄糖從尿中排出[7-8]，其開發(fā)價(jià)值和臨床應(yīng)用前景廣闊。

目前，根皮苷的提取方法主要有醇提法[9]、堿性水提取法[10]、超聲輔助提取法[11]和微波輔助提取法[9]等。根皮苷的分離純化方法有萃取法[12]、大孔樹脂吸附法[13]、殼聚糖絮凝法[9]、聚酰胺層析柱分離法[12]和高效離心分配色譜法[14]等。朱珊等[15]利用水提蘋果枝，樹脂柱粗分離，中低壓柱色譜細(xì)分的方法制備出的根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品純度達(dá)到98%以上。袁健童等[16]采用70%的乙醇浸提，硅膠柱色譜梯度洗脫，制備色譜分離純化，獲得根皮苷純度98%以上的對(duì)照品。王慧瑩[9]采用微波輔助水提取法提取多穗柯根皮苷，并選擇ADS-7型大孔樹脂對(duì)根皮苷進(jìn)行進(jìn)一步純化，根皮苷得率的平均值為3.09%，純化后純度從21.93%增加到58.6%。趙斐文[17]以蘋果樹枝、葉為原料，70%甲醇為提取劑，得到根皮苷純度68%。陳陽[14]采用超聲輔助提取法從多穗柯葉中提取根皮苷，并用D-101型大孔樹脂分離純化，獲得根皮苷得率為3.83%，根皮苷純度由27.62%增加到72.37%。王代波等[18]采用微波輔助提取多穗柯根皮苷，根皮苷得率為1.392%。黃帥等[19]以60%乙醇為提取溶劑，采用回?zé)崽崛》ê统暡ㄝ腿》▽?duì)木姜葉柯老葉中的根皮苷進(jìn)行提取，得率分別為9.53%和8.72%。徐凱、豐金玉等[20-28]在根皮苷的提取和純化方面進(jìn)行了大量的研究，也取得了可喜的進(jìn)展，但采用萃取法分離得到的根皮苷得率和純度不高。筆者采用萃取法對(duì)多穗石柯根皮苷的提取和純化工藝進(jìn)行研究，并優(yōu)化工藝條件，以期獲得得率較高且根皮苷純度達(dá)到90%以上的工藝條件，為根皮苷的進(jìn)一步深入研究和工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

多穗石柯葉（葉齡超過6個(gè)月）采自廣西林科院老虎嶺種植基地；根皮苷（純度大于98%）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；液相用的甲醇和乙腈為色譜純；提取用的無水乙醇、乙酸乙酯、甲醇等為分析純。

中草藥粉碎機(jī)，天津泰斯特FY130；超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)KH-1000KDB；低溫高速離心機(jī)，德國(guó)SIGMA3-30K；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化RE-52AA；鼓風(fēng)干燥箱，蘇州德瑞普DRP-8803；高效液相色譜儀，Waters e2695；電子分析天平，瑞士普利賽斯，BJ210C；SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝流程 多穗石柯葉經(jīng)干燥、粉碎、研磨、過篩，密封保存?zhèn)溆?。稱取一定量的樣品，置于500 mL錐形瓶中，加入乙醇溶液浸泡、超聲、離心，收集上層液，加入乙酸乙酯分3次進(jìn)行萃取，收集萃取液進(jìn)行濃縮，濃縮液加入甲醇分3次純化萃取，萃取液濃縮，濃縮得粘稠狀物質(zhì)加水溶解，然后加入活性炭吸附、過濾，濾液結(jié)晶后再重結(jié)晶即得根皮苷產(chǎn)品。具體工藝流程見圖1。

圖1 根皮苷提取純化工藝流程

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以多穗石柯葉為試驗(yàn)材料，根皮苷的得率和純度為考察指標(biāo)，分別考察不同粉碎程度、乙醇濃度、料液比、浸泡時(shí)間、超聲時(shí)間、離心時(shí)間和甲醇濃度7個(gè)因素對(duì)根皮苷得率和純度的影響。固定乙醇濃度為75%，料液比1:15，浸泡24 h，超聲20 min，離心15 min，甲醇濃度為50%，粉碎程度為10、20、30、40、50目；固定粉碎程度為30目，料液比1:15，浸泡24 h，超聲20 min，離心15 min，甲醇濃度為50%，乙醇濃度45%、55%、65%、75%、85%；固定粉碎程度為30目，乙醇濃度為75%，浸泡24 h，超聲20 min，離心15 min，甲醇濃度為50%，料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25；固定粉碎程度為30目，乙醇濃度為75%，料液比1:15，超聲20 min，離心15 min，甲醇濃度為50%，浸泡時(shí)間8、16、24、32、40 h；固定粉碎程度為30目，乙醇濃度為75%，料液比1:15，浸泡24 h，離心15 min，甲醇濃度為50%，超聲時(shí)間10、15、20、25、30 min；固定粉碎程度為30目，乙醇濃度為75%，料液比1:15，浸泡24 h，超聲20 min，甲醇濃度為50%，離心時(shí)間5、10、15、20、25 min；固定粉碎程度為30目，乙醇濃度為75%，料液比1:15，浸泡24 h，超聲20 min，離心15 min，甲醇濃度30%、40%、50%、60%、70%。

1.2.3 樣品制備 稱取1 g根皮苷產(chǎn)品，用少量甲醇溶解，定容到10 mL，渦旋混勻30 s，供液相色譜檢測(cè)。如果樣品濃度超過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線范圍，則將樣液用甲醇稀釋一定的倍數(shù)，使其濃度在線性范圍之內(nèi)。

1.2.4 樣品檢測(cè) 用高效液相色譜測(cè)定并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，色譜條件為Symmetry ShieldTM RP18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動(dòng)相為0.02%甲醇/水和乙腈；流速1.0 mL/min；柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm。進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相梯度洗脫，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫數(shù)據(jù)

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用分析天平準(zhǔn)確稱取根皮苷標(biāo)準(zhǔn)樣品0.05 g，用甲醇完全溶解后，定容到50 mL容量瓶中，得到濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0.5、2、4、6、8 mL的1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液溶于10 mL的容量瓶中，用甲醇定容到刻度搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液供測(cè)試，測(cè)得根皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖2 根皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以根皮苷標(biāo)準(zhǔn)液的濃度ρ為橫坐標(biāo)，HPLC峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，如式(1)。

1.2.6 計(jì)算方法 根皮苷得率(W)的計(jì)算如式(2)～(3)。根皮苷純度(P)的計(jì)算如式(4)。

式中，M0為提取前干葉子的質(zhì)量，g；L為標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；M1為根皮苷的質(zhì)量，g；m為純化后根皮苷的質(zhì)量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有指標(biāo)均重復(fù)測(cè)量3次，檢測(cè)結(jié)果以平均值表示。數(shù)據(jù)處理均采用Microsoft Office Excel 2007軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料粉碎程度對(duì)根皮苷的得率和純度的影響

由圖3可見，根皮苷原料的不同粉碎程度對(duì)得率和純度存在一定的影響。根皮苷的純度隨著目數(shù)的增大而增大，超過30目后純度變化不大；得率隨著目數(shù)的增大而增大，但超過30目后增大減緩。出現(xiàn)這種情況可能是根據(jù)菲克定律，植物原料越細(xì)，擴(kuò)散速度越快，但粉碎過細(xì)，植物細(xì)胞被破壞，可溶性高分子化合物即雜質(zhì)進(jìn)入溶媒中增加了提取液黏度，妨礙了溶媒進(jìn)入細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行提取。因此，在開展實(shí)驗(yàn)的時(shí)候選擇粉碎程度為30目。

圖3 原料粉碎程度對(duì)根皮苷得率和純度的影響

2.2 不同乙醇濃度浸提液對(duì)根皮苷純度和得率的影響

由圖4可以看出，不同乙醇浸提液濃度對(duì)根皮苷得率和純度有一定的影響，但對(duì)純度的影響不大。隨著乙醇浸提液濃度的升高，根皮苷的得率增加，乙醇濃度增加到75%時(shí)，根皮苷的得率為7.63%；當(dāng)濃度提高到85%的時(shí)候，根皮苷的得率僅提高到7.79%，增幅不大。說明乙醇濃度只有在一定范圍內(nèi)的增加才能增大根皮苷的溶出，并不是濃度越高越好。因此，選擇75%的乙醇濃度作為浸提濃度。

圖4 乙醇濃度對(duì)根皮苷得率和純度的影響

2.3 不同料液比對(duì)根皮苷純度和得率的影響

由圖5可以看出，不同料液比對(duì)根皮苷的得率和純度都有影響。隨著料液比的增大，根皮苷的純度先增大后降低，峰值出現(xiàn)在1:15附近。根皮苷的得率隨著料液比的增大而增大，在料液比超過1:15之后增加比較緩慢。說明在一定范圍內(nèi)增加溶劑量可以提高醇溶性根皮苷的溶出量，但繼續(xù)增加溶劑根皮苷的溶出率達(dá)到飽和或影響超聲波對(duì)樣品的作用，導(dǎo)致根皮苷的得率和純度增加緩慢或稍有降低。因此，在浸提過程中選擇料液比為1:15。

圖5 料液比對(duì)根皮苷得率和純度的影響

2.4 不同浸泡時(shí)間對(duì)根皮苷純度和得率的影響

從圖6可以看出，不同浸泡時(shí)間對(duì)根皮苷得率和純度都有較大的影響。隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，根皮苷的純度先升高后降低，在浸泡時(shí)間為24 h左右達(dá)到最高值；根皮苷的得率隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，但超過24 h后增大放緩，根皮苷的溶出逐漸達(dá)到飽和。因此，選擇24 h為根皮苷提取的浸泡時(shí)間。

圖6 浸泡時(shí)間對(duì)根皮苷得率和純度的影響

2.5 不同超聲時(shí)間對(duì)根皮苷純度和得率的影響

從圖7可以看出，超聲時(shí)間對(duì)根皮苷的得率和純度都有一定的影響，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，根皮苷的得率和純度都是先增大，后期基本不變，得率和純度均在20 min左右達(dá)到最高值。出現(xiàn)這種情況的原因可能是隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，多穗石柯老葉中的根皮苷和其他醇溶性物質(zhì)被逐漸溶出，達(dá)到20 min時(shí)基本全部溶出。因此，在實(shí)驗(yàn)過程中選擇20 min為根皮苷的超聲時(shí)間。

圖7 超聲時(shí)間對(duì)根皮苷得率和純度的影響

2.6 不同離心時(shí)間對(duì)根皮苷純度和得率的影響

從圖8可以看出，不同的離心時(shí)間對(duì)根皮苷得率和純度的影響不大，得率和純度的最大值出現(xiàn)在15 min左右。因此，選擇15 min為根皮苷提取的離心時(shí)間。

圖8 離心時(shí)間對(duì)根皮苷得率和純度的影響

2.7 不同甲醇濃度對(duì)根皮苷純度和得率的影響

從圖9可以看出，隨著甲醇濃度的升高，根皮苷的得率和純度先升高后降低，但降低的幅度不大，得率和純度的最大值出現(xiàn)在甲醇濃度50%左右。因此，選擇甲醇濃度50%為根皮苷的純化濃度。

圖9 甲醇濃度對(duì)根皮苷得率和純度的影響

2.8 方法的穩(wěn)定性考察

在多穗石柯干葉粉過30目篩，乙醇濃度為75%，料液比1:15，浸泡24 h，超聲20 min，離心15 min，甲醇濃度50%等條件下，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，所得的根皮苷的得率和純度見表2，同時(shí)對(duì)根皮苷產(chǎn)品開展了加樣回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

由表2和表3可以看出，根皮苷的得率和純度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.36%和0.28%；加樣平均回收率為99.36%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.81%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)值不大，說明采用該方法進(jìn)行根皮苷的提取和純化可行，所得結(jié)果相對(duì)比較穩(wěn)定。

表2 根皮苷的純度和得率%

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3 結(jié)論

通過對(duì)多穗石柯老葉進(jìn)行干燥、粉碎、過篩、浸泡、超聲、離心、萃取、濃縮、純化等工序提取根皮苷產(chǎn)品，獲得根皮苷提取純化的最佳工藝條件為：多穗石柯干葉粉碎過30目篩，乙醇濃度為75%，料液比1:15，浸泡時(shí)間為24 h，超聲時(shí)間為20 min，離心時(shí)間為15 min，甲醇濃度為50%。在此工藝條件下開展穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，根皮苷的平均得率為7.63%，平均純度為91.10%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.36%和0.28%，表明方法的穩(wěn)定性較好。

4 討論

筆者開展了根皮苷的提取和純化工藝的改進(jìn)研究，從多穗石柯葉中提取的根皮苷得率為7.63%，平均純度為91.10%，均高于文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)。王慧瑩[9]提取的多穗柯根皮苷得率的平均值為3.09%，純度為58.6%。陳陽[14]提取多穗柯葉中根皮苷得率為3.83%，純度達(dá)到72.37%。獲得根皮苷純度比較高的有朱珊等[15]利用水提蘋果枝制備出的根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，純度達(dá)到98%以上，但未見有得率數(shù)據(jù)。獲得根皮苷得率比較高的有黃帥等[19]對(duì)木姜葉柯老葉中的根皮苷的提取，得率最高達(dá)9.53%，但未提及根皮苷的純度。

通過改進(jìn)工藝，根皮苷的得率和純度得到一定的提高，但改進(jìn)后的工藝流程長(zhǎng)、步驟較多、耗時(shí)較長(zhǎng)，在一定程度上增加了生產(chǎn)成本，故要想獲得根皮苷純度和得率高且工藝簡(jiǎn)單的生產(chǎn)工藝還有待進(jìn)一步研究。