響應(yīng)曲面法優(yōu)化漳州芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵桑葉粉營養(yǎng)品質(zhì)的研究

姜文強，繆凌鴻,，高 亮，朱悅潔，林 艷，羅晨皓，錢琳潔，陳士友，張維娜，施大林，劉 波,，沈懷舜,，戈賢平,

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫 214081；2中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室，江蘇無錫 214081；3江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫 214063）

0 引言

桑葉是桑樹的主要產(chǎn)物，除了具有豐富的蛋白質(zhì)含量(14%～28%)和較高的氨基酸含量(34.7%)，還具有1-脫氧野尻霉素(DNJ)和黃酮、多酚、多糖等多種具有抗氧化和殺菌消炎作用的生物活性成分[1]。近年來桑葉粉作為飼料原料在水產(chǎn)動物上的研究逐漸增多，但桑葉粉中含有單寧、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，并具有粗纖維含量過高的問題。微生物發(fā)酵法能夠通過微生物產(chǎn)生的酶系將桑葉粉中的粗纖維、蛋白質(zhì)等難以消化的大分子物質(zhì)，分解為容易被機體吸收的小分子營養(yǎng)物質(zhì)，增強發(fā)酵產(chǎn)物對自由基的清除能力以及對鐵離子等諸多物質(zhì)的還原能力[2]。桑葉粉中的單寧、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子在發(fā)酵過程中也會被微生物消解，從而提高發(fā)酵產(chǎn)物的適口性[3]，提高水產(chǎn)動物的攝食率及生長性能[4-5]。有報道指出，在水產(chǎn)飼料中添加適量的發(fā)酵桑葉粉替代魚粉，不僅能夠有效改善印度囊鰓鯰(Heteropneustes fossilis)、南亞野鯪(Labeo rohita)和巴塔野鯪(Labeo bata)的生長性能和飼料消化率，還可以促進水產(chǎn)動物的脂質(zhì)代謝，提高抗氧化能力；但是隨著發(fā)酵桑葉粉添加量的增加，飼料營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率會有所下降[6-8]。因此，建立適用于桑葉粉的微生物發(fā)酵工藝是提高桑葉資源利用、開發(fā)水產(chǎn)新型飼料原料的重要手段之一。

微生物發(fā)酵工藝中，采用單菌株與混合菌株發(fā)酵桑葉粉均能夠提高其粗蛋白含量，且不同種菌株對于桑葉粉中的營養(yǎng)物質(zhì)和抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高與降解的作用各有不同[3]。例如，霉菌能夠更好地提高發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量，芽孢桿菌和霉菌對桑葉粉中的粗纖維具有較優(yōu)的處理效果，乳酸菌和酵母菌能夠更好地提高發(fā)酵桑葉粉中粗脂肪的含量[9]。此外，發(fā)酵工藝對桑葉粉品質(zhì)的改變也有重要影響。針對發(fā)酵菌株建立適用的發(fā)酵工藝，可以大大提高發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)。任元元等[3]研究發(fā)現(xiàn)，以枯草芽孢桿菌、米曲霉菌、釀酒酵母菌、植物乳桿菌等為發(fā)酵菌種，篩選、優(yōu)化桑葉粉的液態(tài)發(fā)酵工藝后，發(fā)酵桑葉粉可溶性蛋白含量可以提高176.52%，氨基態(tài)氮可以提高546.34%。梁貴秋等[10]采用優(yōu)化的試驗條件，以冠突散囊菌E6固態(tài)發(fā)酵桑葉茶6天后發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵產(chǎn)物中還原糖含量、氨基酸含量以及抗氧化能力均高于對照組。亦有研究表明，經(jīng)過酵母菌和芽孢桿菌混合菌種[11]或者是混合霉菌[12]發(fā)酵桑葉粉后，發(fā)酵產(chǎn)物中1-脫氧野尻霉素(DNJ)的含量均有所提高。因此，優(yōu)化桑葉粉的液態(tài)發(fā)酵工藝，對促進其在水產(chǎn)飼料領(lǐng)域中的開發(fā)利用具有重要意義。

本試驗旨在通過響應(yīng)面方法(response surface methodology，RSM)中Box-Behnken多因子試驗設(shè)計法對漳州芽孢桿菌(Bacillus zhangzhouensis)液體發(fā)酵桑葉粉的料水比、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和裝液量等參數(shù)進行評估，借助Design-ExpertV8.0.6綜合分析確定漳州芽孢桿菌發(fā)酵桑葉粉的最佳工藝條件，并通過分析比較桑葉粉發(fā)酵前后營養(yǎng)物質(zhì)的含量、抗氧化活性，以期為發(fā)酵桑葉粉作為水產(chǎn)植物性飼料原料提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 菌種JSSW-BP44，由江蘇省蘇微微生物研究有限公司分離保存，經(jīng)鑒定分類命名為漳州芽孢桿菌(Bacillus zhangzhouensis)，保藏編號為CCTCC No.2019989，保藏日期為2019年12月2日，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為武漢大學(xué)。試驗于2018年7月—2020年9月在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心進行。

1.1.2 桑葉粉 取新鮮桑葉粉（粗蛋白含量為14.029%）于60～65℃烘干至恒重，以2200 r/min的轉(zhuǎn)速粉碎桑葉4 min，經(jīng)60目過篩，獲得桑葉粉。

1.1.3 發(fā)酵桑葉粉 按照10%的濃度制備桑葉漿，調(diào)整其酸堿度為pH 7～8。將已裝罐的桑葉培養(yǎng)基在121℃條件下滅菌30 min，然后冷卻至室溫，備用（圖1）。將漳州芽孢桿菌JSSW-BP44的種子菌懸液接入裝有桑葉漿的發(fā)酵罐（Biotech-5JG，保興，中國上海）中，對照組接入等量無菌蒸餾水，再以180 r/min恒溫旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，得到發(fā)酵液。將發(fā)酵后的樣品，在無菌條件下倒入一次性無菌平板中，于-80℃冷凍后置于冷凍干燥機中干燥（Btp-9ele0x，Sp Scientific，美國）。

圖1 發(fā)酵桑葉粉制備流程

1.2 試驗方法

1.2.1 液態(tài)發(fā)酵桑葉粉工藝優(yōu)化單因素試驗 按照1.1.3的工藝流程制備發(fā)酵桑葉粉，以粗蛋白含量為響應(yīng)指標(biāo)。采用單因素輪換法依次考查料水比(7.5%、10%、12.5%)、發(fā)酵時間(24、48、72 h)、發(fā)酵溫度(30、35、40℃)、裝液量(10%、20%、30%)對發(fā)酵桑葉粉粗蛋白含量的影響[13]。發(fā)酵初始條件為料水比10%、發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度35℃、裝液量20%、接菌濃度107cfu/mL。

1.2.2 液態(tài)發(fā)酵桑葉粉工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗設(shè)計[14]，以料水比(A)、裝液量(B)、發(fā)酵時間(C)、發(fā)酵溫度(D)4個因素為自變量進行響應(yīng)面分析，優(yōu)化漳州芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵桑葉粉的工藝，響應(yīng)面試驗因素水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)曲面Box-Behnken試驗因素與水平

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 營養(yǎng)成分含量的測定 粗蛋白含量的測定采用凱氏定氮法(GB/T 6432—2018)。小肽含量的測定參考Enari等[15]的方法采用雙縮脲法進行，通過式(1)進行計算。

其中，X為樣品的吸光度值，Y為小肽含量。樣品中肽分子量分布的測定參考武萬興等[16]的方法。樣品中氨基酸的組成及含量的測定參考姜曼等[17]的方法。

1.3.2 抗氧化活性及抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的測定 類黃酮、總酚含量均采用北京索萊寶科技有限公司所售試劑盒（試劑盒編號BC1335、BC1345）的測定方法測定。DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力采用北京艾普希隆生物科技有限公司所售試劑盒（試劑盒編號G0128W、QZQ-2-G）的測定方法測定?？偪寡趸芰?T-AOC)、抑制超氧陰離子自由基、超氧化物歧化酶(SOD)均采用南京建成生物工程研究所所售試劑盒（試劑盒編號A015-1-1、A052-1-1、A001-4-1）的測定方法測定。單寧含量采用北京索萊寶科技有限公司所售試劑盒（試劑盒編號BC1395）的測定方法測定。

1.4 統(tǒng)計分析

文中所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。試驗結(jié)果運用SPSS 20.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA)。在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，運用Design-Expert V8.0.6軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗和數(shù)據(jù)分析，所獲得的響應(yīng)面試驗結(jié)果采用Origin Pro 9.0軟件作圖。發(fā)酵前后桑葉粉品質(zhì)數(shù)據(jù)運用獨立樣本T檢驗分析進行顯著性分析。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 料水比、裝液量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對發(fā)酵桑葉粉粗蛋白含量的影響

由圖2A可知，料水比為10%時，發(fā)酵桑葉粉粗蛋白質(zhì)含量最高(17.78%)，顯著高于12.5%料水比組(P＜0.05)。裝液量對發(fā)酵桑葉粉粗蛋白含量的影響不顯著(P＞0.05)（圖2B）。當(dāng)發(fā)酵時間為48 h時，發(fā)酵桑葉粉粗蛋白含量最高；顯著高于72 h發(fā)酵時間組(P＜0.05)（圖2C）。發(fā)酵溫度為35℃時，發(fā)酵桑葉粉粗蛋白含量最高，顯著高于其余2個試驗組(P＜0.05)（圖2D）。根據(jù)單因素試驗結(jié)果獲得漳州芽孢桿菌發(fā)酵桑葉粉的最佳單因素，即料水比10%、發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度35℃、裝液量20%，以此作為響應(yīng)面初始條件進行Box-Behnken試驗設(shè)計及相關(guān)的優(yōu)化試驗。

圖2 料水比、裝液量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對發(fā)酵桑葉粉粗蛋白含量的影響

2.2 Box-Behnken試驗結(jié)果

2.2.1 模型的建立及顯著性分析 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以漳州芽孢桿菌為發(fā)酵菌株，粗蛋白含量為響應(yīng)值，將對發(fā)酵桑葉粉粗蛋白含量影響顯著的4個因素料水比(A)、裝液量(B)、發(fā)酵時間(C)、發(fā)酵溫度(D)作為考察因素，試驗結(jié)果與分析見表2。

表2 Box-Behnken試驗結(jié)果與分析

運用Design expert V8.0.6軟件對表2中得分進行擬合得回歸方程，如式(2)。

對上述回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面分析試驗結(jié)果方差分析

由表3可知，所建立模型的P＜0.05，顯著；失擬項P＞0.05，不顯著，表明模型具有較高可靠性，建模成功。經(jīng)方差分析，4個因素對于發(fā)酵桑葉粉粗蛋白含量影響的主次順序為A＞B＞D＞C，即料水比＞裝液量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間。其中一次項、交互項對結(jié)果影響不顯著(P＞0.05)，二次項A2、C2對結(jié)果影響顯著極顯著(P＜0.01)，B2對結(jié)果影響顯著(P＜0.05)。

2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果 為了更系統(tǒng)地分析各因素對于發(fā)酵桑葉粉粗蛋白質(zhì)含量的影響，使用響應(yīng)面法分析各個因素間的交互作用對粗蛋白質(zhì)含量的影響。等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強弱，高度越高等高線密度越大，兩因素交互作用越顯著，相互影響也較大。由圖3可知，料水比、裝液量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度間的交互作用均出現(xiàn)弧形關(guān)系，得到的響應(yīng)面結(jié)果都具有一個極大值點，并且料水比、裝液量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度間的兩兩相互反應(yīng)等高線呈橢圓形，對粗蛋白質(zhì)含量的影響較為顯著。

圖3 各因素交互作用對發(fā)酵桑葉粉粗蛋白含量影響的響應(yīng)面及等高線

利用Design-Expert軟件對所得的回歸方程進行最優(yōu)條件分析，得出漳州芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵桑葉粉的最優(yōu)條件為料水比5.82%、裝液量11.69%、發(fā)酵時間60.89 h、發(fā)酵溫度33.73℃，在此條件下發(fā)酵液粗蛋白含量為17.814%。為便于實際操作，調(diào)整條件為料水比5.8%、裝液量11.7%、發(fā)酵時間61 h、發(fā)酵溫度34℃。在此條件下做3組平行試驗進行驗證，所得產(chǎn)物粗蛋白含量的平均值為17.456%，相對偏差為0.022%，產(chǎn)物的粗蛋白含量與模型預(yù)測值相對誤差為2.01%，預(yù)測精準(zhǔn)度較高，說明此模型可靠。

2.3 桑葉粉及發(fā)酵桑葉粉肽分子量的分布比較

由圖4可知，桑葉粉中桑葉蛋白主要由蛋白分子量＜1000 Da的小分子蛋白質(zhì)構(gòu)成，含量達97.62%。經(jīng)過漳州芽孢桿菌發(fā)酵后，發(fā)酵桑葉粉蛋白分子量＜1000 Da的蛋白質(zhì)含量為97.4%。發(fā)酵后產(chǎn)物中180～3000 Da的蛋白質(zhì)含量極顯著高于發(fā)酵前(P＜0.01)，而＜180 Da的蛋白質(zhì)含量極顯著低于發(fā)酵前(P＜0.01)。

圖4 桑葉粉及發(fā)酵桑葉粉肽分子量的分布比較

2.4 發(fā)酵前后桑葉粉營養(yǎng)成分和氨基酸組成的比較

由表4可知，桑葉粉在料水比為5.8%、裝液量為11.7%、發(fā)酵時間為61 h、發(fā)酵溫度為34℃的優(yōu)化試驗條件下，經(jīng)由漳州芽孢桿菌進行液態(tài)發(fā)酵后，發(fā)酵桑葉粉的粗蛋白含量由14.029%顯著提高到17.456%(P＜0.05)，粗脂肪含量較未發(fā)酵之前顯著提高147.3%(P＜0.01)；發(fā)酵產(chǎn)物中灰分和總能的含量較桑葉粉無顯著提高。桑葉粉和發(fā)酵桑葉粉共檢測到17種水解氨基酸，發(fā)酵桑葉粉氨基酸總量和必需氨基酸含量分別為11.26%和5.24%，均顯著高于桑葉原粉(P＜0.05)，其中必需氨基酸蘇氨酸(P＜0.05)、苯丙氨酸(P＜0.01)和非必需氨基酸絲氨酸(P＜0.05)、甘氨酸(P＜0.05)、丙氨酸(P＜0.01)的含量經(jīng)過發(fā)酵之后顯著提高。

表4 桑葉粉及發(fā)酵桑葉粉營養(yǎng)成分和氨基酸組成

2.5 發(fā)酵前后桑葉粉品質(zhì)的比較

由表5可知，優(yōu)化條件下液態(tài)發(fā)酵所得桑葉粉的小肽含量為235.46 mg/g，較發(fā)酵前顯著提高21.63%(P＜0.01)。發(fā)酵桑葉粉中單寧、類黃酮和總酚含量分別顯著降低34.70%(P＜0.01)、13.87%(P＜0.05)和8.99%(P＜0.01)，且總抗氧化能力(P＜0.01)、抗超氧陰離子活力(P＜0.01)、超氧化物歧化酶活力(P＜0.01)和DPPH自由基清除率(P＜0.05)均顯著提高。發(fā)酵桑葉粉對羥自由基的清除率較發(fā)酵之前提高14.49%(P＞0.05)。

表5 桑葉粉及發(fā)酵桑葉粉品質(zhì)的比較

3 討論

3.1 液態(tài)發(fā)酵對桑葉粉營養(yǎng)成分的影響

提高植物蛋白源粗蛋白含量的方法通常有超聲波提取法、浸提法、酶解法和微生物發(fā)酵法等。微生物發(fā)酵植葉產(chǎn)物的粗蛋白、粗脂肪含量均能夠得到不同幅度的提高，這與發(fā)酵菌種、培養(yǎng)基組成以及發(fā)酵條件有關(guān)。例如，采用不同復(fù)合菌株發(fā)酵花生莖葉，其發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量可提高25.28%或50.22%[18-19]，用釀酒酵母菌或植物乳桿菌分別發(fā)酵青蒿葉和青蒿葉渣，其發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量可分別提高43.05%和85.30%，粗脂肪含量分別提高106%和87.73%[20]。湯小朋等[21]在用黑曲霉菌固態(tài)發(fā)酵木薯渣后發(fā)現(xiàn)，粗脂肪含量由7.89%提高到11.72%。本試驗中，由漳州芽孢桿菌在優(yōu)化的發(fā)酵條件下所制得的發(fā)酵桑葉粉粗蛋白和粗脂肪含量均得到顯著提高，說明由響應(yīng)面模型評估所獲得漳州芽孢桿菌的發(fā)酵條件適宜桑葉粉的液態(tài)發(fā)酵。在發(fā)酵過程中菌體蛋白的大量分泌，使得發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白和粗脂肪的含量得到提高[20]。并且相較于其他方法，微生物發(fā)酵法能夠分解原料中的大分子物質(zhì)，產(chǎn)生更多易于消化吸收的小分子物質(zhì)，諸如多肽、游離氨基酸等[22]。微生物發(fā)酵過程中還可以產(chǎn)生有機酸、益生元和芳香味物質(zhì)，降低抗?fàn)I養(yǎng)因子，增強抗氧化能力，提高原料適口性，促進動物的生長[23]。微生物發(fā)酵法在銀杏葉、辣木葉以及香蕉莖葉等飼料原料中的應(yīng)用多有報道，且大多為多菌種的混合發(fā)酵[24-26]。本試驗以漳州芽孢桿菌作為單一發(fā)酵微生物，利用其分泌的脂酶、蛋白酶、纖維素酶等將桑葉粉中難以消化的大分子蛋白分解為小肽（低聚肽，分子量180～1000 Da）和游離氨基酸（分子量＜180 Da），從而提高動物對發(fā)酵桑葉粉的消化利用[27-29]。相較于游離氨基酸，小肽能夠直接被腸道消化，不增加腸道負(fù)擔(dān)，不消耗機體的能量；并且能夠作為載體將營養(yǎng)物質(zhì)和微量元素輸送到機體的各個部位；且在抗氧化、降糖降脂等方面的生物活性高于大分子蛋白質(zhì)和游離氨基酸[30-32]。本試驗獲得的發(fā)酵桑葉粉中小肽含量顯著增加，說明桑葉原粉中的大分子蛋白在漳州芽孢桿菌的作用下可有效分解為小肽，進而被分解為游離氨基酸[33-35]。而到了發(fā)酵中后期，培養(yǎng)基中的漳州芽孢桿菌大量繁殖，游離氨基酸居于培養(yǎng)基中可利用氮源的首位[17]，可能導(dǎo)致發(fā)酵桑葉粉中游離氨基酸（肽分子量＜180 Da）所占比例低于桑葉粉。

原料氨基酸的配比和含量的高低是評價其蛋白質(zhì)品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)。棉粕經(jīng)復(fù)合芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵6天后，其產(chǎn)物中總游離氨基酸含量可提高9.98%[36]。米曲霉菌固態(tài)發(fā)酵大麥、少孢根霉菌固態(tài)發(fā)酵玉米和高粱所得的3種發(fā)酵產(chǎn)物的總氨基酸含量可分別增加1.71%、5.11%、2.44%[37]。豆粕經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵72 h后，總氨基酸含量可提高8.35%[38]。在氨基酸組成方面，發(fā)酵桑葉粉所測得17種氨基酸含量均高于桑葉粉，且總氨基酸和必需氨基酸含量較桑葉粉顯著提高6.71%和6.72%，說明漳州芽孢桿菌在桑葉粉發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的蛋白酶可將桑葉粉中的大分子蛋白降解為氨基酸，從而提高發(fā)酵桑葉粉中總氨基酸和必需氨基酸的含量[39]；另一方面也證明本試驗建立的發(fā)酵條件適用于液態(tài)發(fā)酵桑葉粉[40]。由于微生物參與了液態(tài)發(fā)酵過程，發(fā)酵桑葉粉中蘇氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸等氨基酸組成的變化可能歸因于原料發(fā)酵過程中的微生物代謝[5]。

3.2 液態(tài)發(fā)酵對桑葉粉品質(zhì)的影響

微生物發(fā)酵除可能影響發(fā)酵底物的營養(yǎng)和氨基酸組成外，對抗?fàn)I養(yǎng)因子和抗氧化還原物質(zhì)的含量也有一定影響。單寧是存在于植物中的一種次生代謝產(chǎn)物，是植物性蛋白源中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，其可與生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)及消化酶等結(jié)合，降低生物對植物蛋白的利用率[41]。研究發(fā)現(xiàn)，朱纓花粉在經(jīng)過羅伊氏乳桿菌、乳酸片球菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合發(fā)酵后，其單寧含量顯著降低30.20%～48.32%[42]。菜籽餅粕經(jīng)枯草芽孢桿菌等6種菌株復(fù)合發(fā)酵5天之后，其單寧降解率最高達到36.59%[43]。本試驗也獲得相似的結(jié)果，經(jīng)漳州芽孢桿菌發(fā)酵后的產(chǎn)物中單寧含量顯著降低34.71%，說明漳州芽孢桿菌在優(yōu)化的發(fā)酵條件下能夠通過酶促或非酶促等多種途徑來降解植物性原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子[4-5]?？偡雍皖慄S酮均是桑葉酚類物質(zhì)中的一種，具有很好的抑菌消炎、抗氧化活性和較強的自由基清除率[44-45]。桑葉粉在發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)的減少可能是發(fā)酵過程中會產(chǎn)生降解酚類物質(zhì)中不穩(wěn)定酚羥基的酶類；也有可能是發(fā)酵過程中培養(yǎng)基還原糖的含量和pH的變化等諸多因素會對其酚類物質(zhì)的含量產(chǎn)生影響[46]。雖然具有抗氧化活性的總酚和類黃酮含量降低，但是在本試驗中發(fā)酵桑葉粉的DPPH清除率、總抗氧化能力、抗超氧陰離子活力、超氧化物歧化酶活力均顯著提高。微生物在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的酶類不僅會作用于酚類物質(zhì)，也會對發(fā)酵產(chǎn)物中的多糖類化合物產(chǎn)生影響，可能使大分子葡萄糖苷類化合物轉(zhuǎn)化為小分子苷元，使得發(fā)酵桑葉粉的抗氧化能力得到提高[47]。另外，發(fā)酵產(chǎn)物中具有抗氧化活性的物質(zhì)除了酚類物質(zhì)與多糖類化合物外，發(fā)酵底物中所含的多肽類化合物經(jīng)酶水解之后肽鍵斷裂，部分具有抗氧化效用的氨基酸殘基暴露也會對發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化能力的提高起到一定的作用[27,40]。

4 結(jié)論

本試驗以桑葉粉為原料，選用漳州芽孢桿菌JSSW-BP44為發(fā)酵菌種，以發(fā)酵桑葉粉的粗蛋白含量為響應(yīng)值，通過單因素和響應(yīng)面試驗確定漳州芽孢桿菌發(fā)酵桑葉粉的最優(yōu)條件，分別為料水比5.8%、裝液量11.7%、發(fā)酵時間61 h、發(fā)酵溫度34℃。在優(yōu)化條件下發(fā)酵所得的產(chǎn)物粗蛋白、粗脂肪和小肽含量分別提高24.4%、147.3%和21.61%，抗?fàn)I養(yǎng)因子單寧含量降低34.71%。其必需氨基酸及總氨基酸含量顯著上升。此外，發(fā)酵桑葉粉DPPH自由基、羥自由基的清除率分別達到93.26%和81.84%，較發(fā)酵之前提高10.83%和14.49%，具有更強的抗氧化活性。總體而言，本研究獲得的漳州芽孢桿菌發(fā)酵條件適用于桑葉粉的液態(tài)發(fā)酵，通過該條件液態(tài)發(fā)酵所得的發(fā)酵桑葉粉具有更佳的營養(yǎng)價值、抗氧化活性以及適口性，為水產(chǎn)飼料植物型原料的開發(fā)提供了新的思路和理論依據(jù)。