骨髓涂片聯(lián)合活組織檢查漿細(xì)胞數(shù)量對(duì)漿細(xì)胞骨髓瘤的診斷價(jià)值

朱建鋒，郭 瑋，王志梅，王蓓麗*，潘柏申*

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032

2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血液科，上海 200032

漿細(xì)胞骨髓瘤（plasma cell myeloma，PCM）以骨髓中漿細(xì)胞克隆增殖為特征，表現(xiàn)為骨髓中漿細(xì)胞質(zhì)與量的異常。2014年國際骨髓瘤工作組（International Myeloma Working Group, IMWG）提出，除骨髓瘤相關(guān)事件（高鈣血癥、腎功能損傷、貧血和骨質(zhì)破壞）外，骨髓涂片（bone marrow aspirate, BMA）或骨髓活組織（bone marrow biopsy, BMB）檢查漿細(xì)胞數(shù)量≥10%作為PCM診斷的更新標(biāo)準(zhǔn)［1］。然而目前仍尚未統(tǒng)一骨髓液抽取的容量（0.3～3 mL），抽取骨髓液量不一致使得骨髓樣本出現(xiàn)不同程度的稀釋，同時(shí)骨髓中漿細(xì)胞不均勻或灶性分布、骨髓穿刺干抽等情況，影響了BMA漿細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。而BMB可避免這些情況，得到相對(duì)可靠的漿細(xì)胞數(shù)量，但BMB漿細(xì)胞計(jì)數(shù)尚缺乏客觀測量辦法［2］。以上情況使得兩者的漿細(xì)胞計(jì)數(shù)經(jīng)常出現(xiàn)不一致，而準(zhǔn)確的漿細(xì)胞數(shù)量對(duì)疾病診斷、療效及預(yù)后評(píng)估具有重要意義。本研究旨在評(píng)估BMA與BMB漿細(xì)胞數(shù)量在PCM診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2015年10月至2019年1月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院經(jīng)血液科確診的217例PCM患者。按BMA漿細(xì)胞比例分為＜10%組（n＝27）和≥10% 組（n＝190）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合PCM診斷（滿足a，另加b中任何1項(xiàng)），（a）骨髓單克隆漿細(xì)胞比例等于或超過10%，或活組織檢查證實(shí)漿細(xì)胞瘤，（b）PCM所致的1個(gè)或多個(gè)靶器官損傷，或漿細(xì)胞比例≥60%，或受累/非受累輕鏈比≥100，或MRI顯示1個(gè)以上部位受累；（2）同時(shí)進(jìn)行BMA與BMB檢查的患者。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（B2022-207），所有患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 檢查方法

1.2.1 試劑與儀器CX-31型光學(xué)顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；瑞-姬氏染色試液購自珠海貝索生物科技公司；骨髓活組織病理采用H-E染色與免疫組織化學(xué)染色法。Sysmex XN9000血細(xì)胞分析儀及配套試劑購自日本Sysmex公司，羅氏Cobas c702生化分析儀及配套試劑購自瑞士羅氏公司。

1.2.2 BMA與BMB檢查臨床醫(yī)生采集骨髓樣本后由檢驗(yàn)科工作人員床旁制備涂片，制作骨髓涂片8張，同步采集手指末梢血涂片3張。涂片自然干燥后，瑞-姬氏染色液染色，骨髓涂片在油鏡視野下計(jì)數(shù)200個(gè)有核細(xì)胞，計(jì)算漿細(xì)胞比例（%）與形態(tài)評(píng)估。BMA漿細(xì)胞按形態(tài)分為經(jīng)典型、淋巴樣漿細(xì)胞、分葉狀核漿細(xì)胞、間變型漿細(xì)胞和幼稚型漿細(xì)胞［3］。BMB樣本長度至少1.5 cm，福爾馬林固定，脫鈣切片樣本H-E染色進(jìn)行觀察。單克隆抗體CD19、CD45、CD38、CD138、CD56和CD117用于免疫組織化學(xué)染色。

1.2.3 血常規(guī)和生化項(xiàng)目檢測血常規(guī)項(xiàng)目采用Sysmex XN9000血細(xì)胞分析儀及配套試劑檢測，生化項(xiàng)目采用羅氏Cobas c702生化分析儀及配套試劑檢測，所有檢查步驟按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化程序操作。

1.3 觀察指標(biāo)收集患者基本資料：年齡、性別、臨床Durie-Salmon分期［4］。骨髓漿細(xì)胞比例與形態(tài)：BMA與BMB檢查。血液學(xué)指標(biāo)：血紅蛋白、血清鈣、尿素、肌酐、β2-微球蛋白、白蛋白。主要結(jié)局指標(biāo)為配對(duì)樣本BMA與BMB漿細(xì)胞數(shù)量分布關(guān)系，次要結(jié)局指標(biāo)為BMA不同漿細(xì)胞比例血液學(xué)指標(biāo)的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以x±s表示，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示。計(jì)量資料的組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)。SPSS 20.0 曲線估計(jì)繪制配對(duì)BMA與BMB漿細(xì)胞數(shù)量散點(diǎn)圖與擬合曲線，導(dǎo)出回歸方程。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料分析結(jié)果（表1）顯示：217例PCM患者納入本研究，其中男性134例，女性83例，男女比為2.6∶1，平均年齡為（64.8±9.9）歲。168例患者在診斷時(shí)進(jìn)行臨床Durie-Salmon分期。

表1 PCM患者基線資料分析n＝217

2.2 配對(duì)BMA與BMB樣本漿細(xì)胞數(shù)量分布關(guān)系結(jié)果（表2）顯示：190例BMA漿細(xì)胞比例≥10%的患者中，BMB漿細(xì)胞比例＜10%占1.6%（3/190），BMB漿細(xì)胞比例≥10%占98.4%（187/190）；而BMA漿細(xì)胞數(shù)量＞60%時(shí)，所有BMB樣本漿細(xì)胞比例均≥10%（21/21），BMB漿細(xì)胞數(shù)量＜10%樣本為0，即BMA漿細(xì)胞數(shù)量＞60%時(shí)，按BMB漿細(xì)胞數(shù)量作為骨髓瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)，不會(huì)出現(xiàn)漏診情況。相反，對(duì)于27例BMA漿細(xì)胞比例＜10%的患者中，BMB漿細(xì)胞比例＜10%樣本占11.1%（3/27），其余24例（88.9%）BMB漿細(xì)胞比例≥10%。

表2 配對(duì)樣本BMA與BMB漿細(xì)胞數(shù)量分布關(guān)系n＝217

2.3 漿細(xì)胞數(shù)量與人群、臨床血液指標(biāo)的關(guān)系結(jié)果（表3）顯示：BMA漿細(xì)胞≥10%組β2-微球蛋白含量較BMA漿細(xì)胞＜10%組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而2組中血清鈣、肌酐、尿素、白蛋白結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 BMA不同漿細(xì)胞比例的2組相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

2.4 BMA與BMB漿細(xì)胞數(shù)量擬合曲線分析結(jié)果（圖1）顯示：BMA與BMB漿細(xì)胞數(shù)量分布散點(diǎn)圖，并擬合非線性曲線，得到回歸方程為y＝11.13·x0.39（R2＝0.17）。導(dǎo)出下面2組計(jì)算公式：

圖1 配對(duì)BMA與BMB漿細(xì)胞數(shù)量分布散點(diǎn)圖

（1）BMB漿細(xì)胞數(shù)量＝11.13×BMA漿細(xì)胞數(shù)量0.39；

（2）BMA漿細(xì)胞數(shù)量＝（BMB漿細(xì)胞數(shù)量÷11.13）2.56。

理論上，通過公式（1）可使用已知的BMA漿細(xì)胞數(shù)量來推導(dǎo)未知的BMB漿細(xì)胞數(shù)量，反之，通過公式（2）可以求得BMA漿細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果可以用于評(píng)判PCM初發(fā)患者或隨訪療效預(yù)后。

3 討 論

骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查漿細(xì)胞數(shù)量是診斷漿細(xì)胞疾病的重要標(biāo)準(zhǔn)。大多數(shù)情況下，獲得足量骨髓樣本便可以進(jìn)行顯微鏡檢查評(píng)估漿細(xì)胞數(shù)量。然而臨床上近20%患者骨髓中漿細(xì)胞呈局灶性分布特點(diǎn)，漿細(xì)胞分布不均對(duì)BMA漿細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確評(píng)估造成一定影響［5］。部分文獻(xiàn)［6］證實(shí)上述情況下BMA和BMB檢查時(shí)，得到的漿細(xì)胞數(shù)量存在著明顯差異且相關(guān)性差。也有研究［7-8］采用免疫組織化學(xué)CD138染色來提高漿細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。

本研究評(píng)估BMA在漿細(xì)胞腫瘤診斷中的應(yīng)用，尤其是與BMB結(jié)果進(jìn)行比較，評(píng)估2種方法的一致性和臨床相關(guān)性。本研究數(shù)據(jù)顯示BMA漿細(xì)胞≥10%組的190例患者中BMB漿細(xì)胞＜10%占1.6%，BMB漿細(xì)胞≥10%占98.4%；而BMA漿細(xì)胞＞60%時(shí)，所有患者BMB標(biāo)本顯示漿細(xì)胞≥10%，即BMA漿細(xì)胞＞60%時(shí)，可用BMA進(jìn)行骨髓瘤診斷，未出現(xiàn)漏診情況。本研究結(jié)果提示對(duì)于漿細(xì)胞在10%及以上的患者，2種方法在評(píng)估漿細(xì)胞數(shù)量時(shí)一致性較高；相反，在BMA漿細(xì)胞少于10%的27例樣本中，BMB漿細(xì)胞＜10%樣本占11.1%，而BMB漿細(xì)胞≥10%樣本仍占88.9%。若僅采用BMA漿細(xì)胞數(shù)量作為骨髓瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，則88.9%患者出現(xiàn)漏診，此時(shí)2種方法對(duì)PCM診斷的一致性不佳。通過BMA與BMB結(jié)果，對(duì)造成兩者差異的原因分析發(fā)現(xiàn)，14份BMA樣本存在骨髓小粒稀少或未見等情況；10份BMA樣本中漿細(xì)胞分布不均勻；9份BMA樣本中漿細(xì)胞體積較小，胞漿較少而呈淋巴樣漿細(xì)胞，可能被計(jì)數(shù)為淋巴細(xì)胞。這些可能是BMA與BMB漿細(xì)胞計(jì)數(shù)不一致的原因。

許多因素與PCM預(yù)后相關(guān)，其中骨髓中漿細(xì)胞數(shù)量是骨髓瘤患者復(fù)發(fā)的一項(xiàng)預(yù)測因素［9］。本研究將PCM按照BMA漿細(xì)胞數(shù)量以10%切點(diǎn)為界分成2組，探討重要血液學(xué)指標(biāo)與漿細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMA漿細(xì)胞數(shù)量≥10%組β2-微球蛋白含量較骨髓涂片漿細(xì)胞＜10%組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但其他血液學(xué)參數(shù)如血清鈣、肌酐、尿素、白蛋白結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與BMA＜10%組中有88.9%患者BMB漿細(xì)胞數(shù)量仍≥10%，甚至有11.1%（3/27）患者漿細(xì)胞數(shù)量＞60%，這部分患者仍然是腫瘤高負(fù)荷患者，與BMA漿細(xì)胞≥10%組具有相似的臨床進(jìn)展或預(yù)后，因此不能單一采用BMA漿細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行患者預(yù)后或復(fù)發(fā)評(píng)估，而需聯(lián)合使用BMA與BMB漿細(xì)胞結(jié)果對(duì)PCM進(jìn)行預(yù)后評(píng)估。

文獻(xiàn)［10］報(bào)道，約4%PCM患者漿細(xì)胞數(shù)量低于10%，單憑BMA漿細(xì)胞數(shù)量不能完全準(zhǔn)確地診斷PCM。Scudla等［11］認(rèn)為，采用BMA漿細(xì)胞比例存在一定局限性，建議同時(shí)關(guān)注BMB必要性。IMWG也再次強(qiáng)調(diào)PCM診斷時(shí)可取BMA或BMB漿細(xì)胞數(shù)量高者為標(biāo)準(zhǔn)［1］。從表2中可知在診斷漿細(xì)胞腫瘤時(shí)，BMB漿細(xì)胞數(shù)量≥10%時(shí)，有88.9%（24/27）BMA漿細(xì)胞數(shù)量＜10%，顯示BMA漿細(xì)胞結(jié)果出現(xiàn)明顯低估。本研究結(jié)果提示同時(shí)進(jìn)行BMA與BMB檢查的重要性，兩者聯(lián)合運(yùn)用是診斷該疾病的前提條件，與Stifter等［12］的結(jié)論一致。

本研究對(duì)BMA與BMB漿細(xì)胞數(shù)量采用SPSS 20.0曲線估計(jì)繪制散點(diǎn)圖及擬合非線性曲線，得到回歸方程y＝11.13·x0.39（R2＝0.17）并導(dǎo)出 2個(gè)計(jì)算公式：（1）BMB漿細(xì)胞數(shù)量＝11.13×BMA漿細(xì)胞數(shù)量0.39和（2）BMA漿細(xì)胞數(shù)量＝（BMB漿細(xì)胞數(shù)量÷11.13）2.56，這與Gabriel等［13］研究結(jié)論基本相似，但本研究的實(shí)驗(yàn)回歸方程的判定系數(shù)偏低，可能與樣本量少有關(guān)。對(duì)無條件同步進(jìn)行BMA和BMB的情況下，可使用該計(jì)算公式通過一種方法得到的已知漿細(xì)胞數(shù)量初步估算對(duì)應(yīng)方法的漿細(xì)胞數(shù)量，從而為臨床診斷或療效、預(yù)后判斷提供依據(jù)。

綜上所述，對(duì)于漿細(xì)胞數(shù)量不高的患者，BMA與BMB結(jié)果一致性欠佳；漿細(xì)胞數(shù)量較高的患者，BMA與BMB一致性較好。但僅憑任一BMA或BMB漿細(xì)胞數(shù)量作為PCM診斷或療效標(biāo)準(zhǔn)，存在無法真實(shí)反映漿細(xì)胞負(fù)荷的風(fēng)險(xiǎn)。2種檢查應(yīng)相互補(bǔ)充使用，必要時(shí)可采用回歸方程進(jìn)行估算。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。