山杏核殼黑色素提取及其金屬螯合物的螯合工藝優(yōu)化

高 莉，劉琳琳，劉盼盼，徐宏宇，王海賓，劉海英，楊 柳

（中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，山西太原 030051）

黑色素（melanin）是主要由吲哚或酚類化合物聚合而成的一類高分子聚合物，是目前已知生物色素中最廣泛的一類色素，在動(dòng)植物和微生物中廣泛存在[1?2]，因其抗氧化、抗輻射和抑菌等生物活性而廣泛用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域[3?7]。研究發(fā)現(xiàn)，原物質(zhì)與金屬螯合后，可改變甚至增強(qiáng)原物質(zhì)的一些生物活性，拓寬了原物質(zhì)的應(yīng)用范圍，且金屬與原物質(zhì)形成螯合物也有利于金屬離子在有機(jī)體內(nèi)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，目前主要研究的有黃酮金屬螯合物、透明質(zhì)酸金屬螯合物等[8?11]，有關(guān)黑色素金屬螯合物的研究較少。螯合金屬離子是黑色素重要的生物學(xué)功能之一[12?14]，黑色素含有C=O、-COOH、-NH 等大量帶負(fù)電的活性官能團(tuán)，既可作電子供體又可作電子受體[15?17]，且能為金屬離子提供多個(gè)非等效結(jié)合位點(diǎn)，可與帶正電的金屬離子形成穩(wěn)定的螯合物[18?20]。黑色素金屬螯合物不僅具有黑色素的功能性質(zhì)，還兼具金屬離子的生物活性，在性能和應(yīng)用研究方面更有協(xié)同增效作用，可充分發(fā)揮黑色素金屬螯合物的功能作用，還可降低金屬離子在機(jī)體及生物環(huán)境中富集造成的負(fù)面影響[20]。

目前已報(bào)道的提取黑色素的植物主要有花椒籽、黑木耳和黑芝麻等[1,21]，山杏是我國北方盛產(chǎn)水果之一，其核殼是山杏在制作食品過程中的主要廢料，資源蘊(yùn)藏量大，為避免資源浪費(fèi)，目前逐漸有研究將其中的生物活性成分—黑色素進(jìn)行提取并加以研究與利用[22]，李紅姣等[23]通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定了超聲波輔助提取山杏種皮黑色素的工藝為氫氧化鈉濃度0.33 mol/L、料液比1:10（g/mL）、提取溫度63.07℃，在此條件下黑色素得率為4.14%。

因此，本實(shí)驗(yàn)在提取山杏核殼黑色素的基礎(chǔ)上將其分別與Fe3+、Cu2+和Zn2+三種金屬離子配合，確定最佳制備工藝，之后對(duì)三種黑色素金屬螯合物進(jìn)行表征以初步了解其結(jié)構(gòu)，為山杏核殼黑色素及其金屬螯合物作為天然食品添加劑及金屬元素補(bǔ)充劑在醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山杏核殼 山西省杏仁加工廠；氫氧化鈉、濃鹽酸 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；纖維素酶、糖化酶 生物試劑，索萊寶公司；硫酸銅、氯化鋅、鋅試劑、銅試劑、硫酸亞鐵銨、氯化鐵 分析純，天津市北辰方正試劑廠。

400Y 高速粉碎機(jī) 永康氏柏歐五金制品有限公司；SB-5200 DTDN 超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；TDL-5-A 高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-3C 型酸度計(jì) 杭州奧利龍有限公司；ReadMax 1900 光吸收全波長酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技有限公司；UV-5200 紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；Perkin ElmerSpectrum Two 紅外光譜分析儀 天津市能譜科技有限公司；Tecnai G2 F20 S-TWIN TMP 掃描電鏡 FEI有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 山杏核殼黑色素的提取與純化 參考楊柳[24]的實(shí)驗(yàn)方案，采用堿溶酸沉法從山杏核殼中提取純化黑色素，以黑色素的得率（%）為指標(biāo)確定提取的最佳條件。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：稱取適量粉碎后的山杏核殼粉末，按料液比1:20 溶于2 mol/L 的NaOH 溶液中，靜置提取3 h 后離心除去固體，之后使用循環(huán)水真空泵對(duì)液體抽濾，將上清液用稀鹽酸溶液調(diào)pH至2.2，靜置沉淀2 h，再離心，除去上清液。向所得固體中加一定蒸餾水，調(diào)其pH 至5.00，加入適量纖維素酶，55 ℃水浴1 h 后離心去除上清液，再向所得固體中加一定蒸餾水，調(diào)其pH 至4.50，加入適量糖化酶，60 ℃水浴1 h 后離心去除上清液。對(duì)兩種酶處理后的固體按料液比為1:30 加入2 mol/L 的NaOH 溶液，超聲波輔助溶解30 min，酸沉后離心去除上清液，烘干后所得固體即為黑色素，4 ℃保存。

式中：m0表示提取的黑色素的質(zhì)量，g；m 表示山杏核殼的質(zhì)量，g。

1.2.2 山杏核殼黑色素提取的單因素實(shí)驗(yàn) 固定堿濃度1.5 mol/L，提取時(shí)間5 h，酸沉pH2，離心轉(zhuǎn)速4000 r/min，超聲時(shí)間25 min，考察料液比（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25 g/mL）對(duì)山杏核殼黑色素得率的影響；固定料液比1:15 g/mL，提取時(shí)間5 h，酸沉pH2，離心轉(zhuǎn)速4000 r/min，超聲時(shí)間25 min，考察堿濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L）對(duì)山杏核殼黑色素得率的影響；固定料液比1:15 g/mL，堿濃度1.5 mol/L，酸沉pH2，離心轉(zhuǎn)速4000 r/min，超聲時(shí)間25 min，考察提取時(shí)間（1、3、5、7、9 h）對(duì)山杏核殼黑色素得率的影響；固定料液比1:15 g/mL，堿濃度1.5 mol/L，提取5 h，離心轉(zhuǎn)速4000 r/min，超聲時(shí)間25 min，考察酸沉pH（1、1.5、2.0、2.5、3.0）對(duì)山杏核殼黑色素得率的影響；固定料液比1:15 g/mL，堿濃度1.5 mol/L，提取5 h，酸沉pH2，超聲時(shí)間25 min，考察離心轉(zhuǎn)速（1000、2000、4000、6000、8000 r/min）對(duì)山杏核殼黑色素得率的影響；固定料液比1:15 g/mL，堿濃度1.5 mol/L，提取5 h，酸沉pH2，離心轉(zhuǎn)速4000 r/min，考察超聲時(shí)間（5、15、25、35、45 min）對(duì)山杏核殼黑色素得率的影響。每個(gè)水平重復(fù)三次。

1.2.3 響應(yīng)面法對(duì)山杏核殼黑色素提取工藝的優(yōu)化根據(jù)單因素結(jié)果確定響應(yīng)面因素及相應(yīng)水平，采用Design Expert 10.0 軟件進(jìn)行Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平編碼表見表1。始終固定提取5 h 和離心轉(zhuǎn)速6000 r/min 不變，以山杏核殼黑色素的得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察料液比、堿濃度、酸沉pH、超聲時(shí)間對(duì)山杏核殼黑色素提取的影響。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)Table 1 Response surface test factors and horizontal design

1.2.4 山杏核殼黑色素的紫外-可見光譜（UV-Vis）表征 山杏核殼黑色素溶于堿性溶液，以0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液為參照，200～800 nm 范圍內(nèi)掃描其光吸收情況。

1.2.5 山杏核殼黑色素的紅外光譜（FT-IR）表征 山杏核殼黑色素與適量溴化鉀混勻壓片，4000～400 cm?1范圍掃描其紅外光譜。

1.2.6 山杏核殼黑色素的掃描電鏡（SEM）表征 將山杏核殼黑色素置于貼了雙面導(dǎo)電膠的樣品臺(tái)上，噴金后觀察其表面形貌。

1.2.7 山杏核殼黑色素鐵螯合物的螯合工藝優(yōu)化采用溶液共沉淀法制備黑色素鐵螯合物[12]，將黑色素溶液與氯化鐵溶液共混，37 ℃避光反應(yīng)一段時(shí)間后離心取沉淀，水洗兩次后干燥即得黑色素鐵螯合物（制備黑色素鋅螯合物和黑色素銅螯合物的步驟同上）。以黑色素鐵螯合物結(jié)合效果為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)（根據(jù)紫外吸收峰變化情況判斷）。固定反應(yīng)pH5.5，避光反應(yīng)10 h，考察鐵離子濃度（2、3、4、5、6 mmol/L）三氯化鐵溶液對(duì)結(jié)合效果的影響；固定鐵離子濃度5 mmol/L 的三氯化鐵溶液，避光反應(yīng)10 h，考察反應(yīng)pH（3.0、4.0、4.5、5.5、6.5）對(duì)結(jié)合效果的影響；固定鐵離子濃度5 mmol/L 的三氯化鐵溶液，反應(yīng)pH5.5，考察避光反應(yīng)時(shí)間（6、8、10、12、24 h）對(duì)螯合效果的影響，各重復(fù)三次。

1.2.8 山杏核殼黑色素銅螯合物的螯合工藝優(yōu)化以黑色素銅螯合物結(jié)合效果為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)（根據(jù)紫外吸收峰變化情況判斷）。固定反應(yīng)pH7.5，避光反應(yīng)6 h，考察銅離子濃度（2、3、4、5 mmol/L）硫酸銅溶液對(duì)結(jié)合效果的影響；固定銅離子濃度4 mmol/L 的硫酸銅溶液，避光反應(yīng)10 h，考察反應(yīng)pH（5.5、6.5、7.5、8.5、9.5）對(duì)結(jié)合效果的影響；固定銅離子濃度4 mmol/L 的硫酸銅溶液，反應(yīng)pH7.5，考察避光反應(yīng)時(shí)間（2、4、6、8、10 h）對(duì)螯合效果的影響，各重復(fù)三次。

1.2.9 山杏核殼黑色素鋅螯合物的螯合工藝優(yōu)化以黑色素鋅螯合物結(jié)合效果為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)（根據(jù)紫外吸收峰變化情況判斷）。固定反應(yīng)pH6.5，避光反應(yīng)6 h，考察鋅離子濃度（2、3、4、5 mmol/L）氯化鋅溶液對(duì)結(jié)合效果的影響；固定鋅離子濃度3 mmol/L 的氯化鋅溶液，避光反應(yīng)6 h，考察反應(yīng)pH（4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）對(duì)結(jié)合效果的影響；固定銅離子濃度3 mmol/L 的氯化鋅溶液，反應(yīng)pH7.5，考察避光反應(yīng)時(shí)間（2、4、6、8、10 h）對(duì)螯合效果的影響，各重復(fù)三次。

1.2.10 三種黑色素金屬螯合物螯合程度的比較3 份20 mL 的山杏核殼黑色素溶液（質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL）分別加入2 mL 4 mmol/L 三氯化鐵、硫酸銅和氯化鋅溶液，調(diào)pH 至6.5，避光反應(yīng)6 h。制作不同金屬離子標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過分光光度法測定溶液中金屬離子剩余濃度（即未與黑色素螯合的金屬離子濃度），進(jìn)而求出金屬離子螯合率。

式中：C0—溶液中金屬離子初始濃度，mg/L；Ce—反應(yīng)后溶液中離子的剩余濃度，mg/L。

1.2.11 山杏核殼黑色素金屬螯合物的紫外-可見光譜（UV-Vis）表征 三種黑色素金屬螯合物溶于堿性溶液，以0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液為參照，200～800 nm范圍內(nèi)掃描其光吸收情況得到其紫外光譜圖。

1.2.12 山杏核殼黑色素金屬螯合物的紅外光譜（FTIR）表征 三種黑色素金屬螯合物分別與適量溴化鉀混合壓片，4000～400 cm?1范圍掃描其紅外光譜。

1.2.13 山杏核殼黑色素金屬螯合物的掃描電鏡（SEM）表征 將三種黑色素金屬螯合物置于貼了雙面導(dǎo)電膠的樣品臺(tái)上，噴金后觀察其表面形貌，并利用能譜儀對(duì)其進(jìn)行元素掃描。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 山杏核殼黑色素的提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 隨著料液比從1:5 g/mL 增加到1:15 g/mL，山杏核殼黑色素的得率逐漸增大，這可能是因?yàn)榱弦罕鹊倪m當(dāng)增加使山杏核殼與堿溶液充分混合，提取量上升。但料液比從1:15 g/mL增加到1:25 g/mL 時(shí)，得率基本保持不變（如圖1a）。因此，從成本考慮，選擇最適料液比為1:15 g/mL。

隨著氫氧化鈉濃度從1.0 mol/L 增至1.5 mol/L時(shí)，山杏核殼黑色素的得率的增長速度最快，繼續(xù)增加到2.5 mol/L 時(shí)，得率增幅較?。ㄈ鐖D1b）。因此，從成本考慮，選擇最適氫氧化鈉濃度為1.5 mol/L。

山杏核殼黑色素的得率隨提取時(shí)間的增加而平緩增加，且5 h 后增加速度更加緩慢，說明提取時(shí)間對(duì)山杏核殼黑色素得率的影響不大（如圖1c）。因此，選擇最適提取時(shí)間為5 h。

酸沉pH 為1 和1.5 時(shí)，山杏核殼黑色素的得率基本相同，逐漸增加到3.0 時(shí)，得率逐漸減少（如圖1d），這可能是因?yàn)殡S著pH 的增加，黑色素的溶解性逐漸增大，從而使沉淀的黑色素的質(zhì)量降低[25]。因此，從成本考慮，選擇最適酸沉pH 為1.5。

離心轉(zhuǎn)速從1000 r/min 到6000 r/min，山杏核殼黑色素的得率隨著離心轉(zhuǎn)速的增加基本呈現(xiàn)不變，達(dá)到8000 r/min 時(shí)，得率有下降趨勢（如圖1e）。這是由轉(zhuǎn)速過高時(shí)，雜質(zhì)與提取液的分離效果較差所導(dǎo)致的。因此，從成本考慮，選擇離心轉(zhuǎn)速為6000 r/min操作。

超聲時(shí)間從5 min 到25 min，山杏核殼黑色素的得率隨之增加，從25 min 到45 min，得率的增長幅度基本趨于平緩（如圖1f）。超聲提取使黑色素固體震碎程度更大，使堿溶液更加有效的和黑色素接觸，有助于黑色素溶解于堿溶液，但提取時(shí)間對(duì)得率的影響有限。因此，從成本考慮，選擇最適超聲時(shí)間為25 min。

圖1 山杏核殼黑色素提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Single factor test results of melanin extraction from apricot kernel shell

2.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)響應(yīng)面結(jié)果（表2），利用Design Expert 10 對(duì)山杏核殼黑色素的得率Y 與料液比X1（g/mL）、氫氧化鈉濃度X2（mol/L）、酸沉pH X3和超聲時(shí)間X4（min）之間進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到了一個(gè)回歸方程模型：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Program and experimental results of RSA

為檢測該方程的可靠性，對(duì)該方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

從表3 可知，該方程模型P值小于0.01，表明該二次回歸方程模型極顯著，同時(shí)失擬項(xiàng)不顯著，說明方程對(duì)實(shí)驗(yàn)的擬合較好，可用于黑色素得率的預(yù)測?；貧w方程是一個(gè)復(fù)雜的多項(xiàng)式方程，說明實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值有較復(fù)雜的影響。根據(jù)P值得出了各因素對(duì)山杏核殼黑色素得率的影響順序（超聲時(shí)間＞堿濃度＞酸沉pH＞料液比）；根據(jù)響應(yīng)面模型結(jié)果得出了提取的最佳條件（料液比1:10 g/mL，氫氧化鈉濃度1.58 mol/L，酸沉pH 為1，超聲時(shí)間35 min），此條件下得率為4.78%。考慮到實(shí)際操作的可行性，將提取條件調(diào)整為：料液比1:10 g/mL，氫氧化鈉濃度1.5 mol/L，酸沉pH 為1，超聲時(shí)間35 min，此條件下重復(fù)3 次得出得率為4.78%±0.23%，表示該預(yù)測模型是可行的。

表3 回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis of regression equation

2.2 山杏核殼黑色素的紫外-可見光譜表征分析

本研究提取的黑色素的紫外-可見光譜圖（圖2）的光密度對(duì)數(shù)值與波長的線性曲線斜率在?0.0015～?0.0030 之間（?0.0019），符合黑色素的特征[26]。另外，270～280 nm 處有一較弱肩峰，這是由水解殘留蛋白質(zhì)中的芳族氨基酸殘基對(duì)光的吸收引起的，此結(jié)果與李軍等[27]提取的山杏種皮黑色素的紫外-可見光譜一致。

圖2 山杏核殼黑色素的紫外-可見光譜圖Fig.2 UV-vis absorption spectra of melanin from apricot kernel shell

2.3 山杏核殼黑色素的紅外光譜表征分析

由圖3 可看出山杏核殼黑色素的紅外光譜是一系列寬而強(qiáng)的吸收峰，主要有以下特征：3458 cm?1和3167cm?1處的吸收峰是由于羥基（-OH）、吲哚的氨基（-NH2）或羧基（-COOH）伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的，同時(shí)該區(qū)域也屬于羰基（-C=O-）的伸縮振動(dòng)[28]，說明山杏核殼黑色素結(jié)構(gòu)中含上述基團(tuán)；2832 cm?1處小而尖的峰屬于烷烴結(jié)構(gòu)中的C-H 伸縮振動(dòng)，可能為-CH2CH3結(jié)構(gòu)[29]；1659 cm?1與1400 cm?1處屬于芳香環(huán)骨架C=C 鍵的振動(dòng)吸收[30]，說明其結(jié)構(gòu)中有苯環(huán)的存在，1659 cm?1與3458 cm?1處的強(qiáng)吸收峰共同指示羧酸根（-COOH）的存在[31]；綜上所述，山杏核殼黑色素存在-OH、-NH2、-COOH、C-H 和C=C 等官能團(tuán)。

圖3 山杏核殼黑色素的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectrum of melanin from apricot kernel shell

2.4 山杏核殼黑色素的掃描電鏡分析

由圖4 可看出，山杏核殼黑色素呈塊狀的立方體結(jié)構(gòu)，粒徑大小差異較大，為微米級(jí)，粒度范圍大致在1～5 μm 之間，且以5 μm 左右居多。

圖4 山杏核殼黑色素的SEM 圖Fig.4 SEM images of melanin from apricot kernel shell

2.5 山杏核殼黑色素鐵螯合物的螯合工藝優(yōu)化

山杏核殼黑色素鐵螯合物在250 nm 左右出現(xiàn)新的吸收峰，這可能歸屬于黑色素中的酚羥基與鐵離子螯合后產(chǎn)生的特征吸收峰；在330 nm 處漸出現(xiàn)較寬的吸收峰，說明DHI（5,6-二羥基吲哚）單元也參與了鐵離子的螯合[32]；且鐵離子濃度從2 mmol/L 到3 mmol/L，特征峰260 nm 處的吸光度呈上升趨勢，從3 mmol/L 到4 mmol/L，特征峰吸光度呈下降趨勢，5 mmol/L 處其在260 nm 處吸光值達(dá)到最大，之后6 mmol/L 又下降（圖5a），這說明，鐵離子濃度為5 mmol/L 時(shí)已經(jīng)為黑色素提供了足夠的鐵，使得在此反應(yīng)條件下的螯合效果最好。

隨著pH 從3.0 到4.5，其曲線在260 nm 處的吸光值逐漸下降，但在pH5.5 處出現(xiàn)最大值，6.5 處吸光值比5.5 處稍下降，雖然pH3.0 在260 nm 處吸光值較大，但在330 nm 處的吸收峰反而未出現(xiàn)，表明此條件下DHI 與鐵離子螯合情況不好，這可能是因?yàn)閜H 為3 時(shí)，溶液中大量水合氫離子會(huì)與金屬離子競爭反應(yīng)活性位點(diǎn)，還可能是因?yàn)槿芤撼蕪?qiáng)酸性，黑色素中的酚羥基、羧基、胺基等因質(zhì)子化而帶正電荷，與Fe3+之間產(chǎn)生較強(qiáng)的靜電斥力，使Fe3+很難靠近黑色素，導(dǎo)致螯合效果較差，隨著pH 的增大，螯合率提高，是因?yàn)槿芤旱乃嵝詼p弱，吸附劑中與水合氫離子螯合的活性部位逐漸暴露出來有利于Fe3+的螯合，pH 大于5.5 后呈下降趨勢，可能是因?yàn)槌^了鐵離子微沉淀上限，金屬離子會(huì)形成氧化物沉淀；pH 大于7.5 后，溶液中OH-與黑色素競爭Fe3+，使溶液中游離的Fe3+濃度變小，導(dǎo)致螯合率降低，因此，不再繼續(xù)探究。因此酸度對(duì)黑色素螯合Fe3+有較大影響，其最佳pH 為5.5（圖5b），本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與陳士國等[33]研究的結(jié)果一致，溶液酸堿度對(duì)黑色素鐵螯合物的螯合效果影響較大。

隨著反應(yīng)時(shí)間從6 到8 h，260 nm 處吸光值呈上升趨勢，8 到10 h，260 nm 處吸光值呈下降趨勢，10 到24 h，260 nm 處吸光值呈上升趨勢，8 h 處吸光值最大，因此最佳反應(yīng)時(shí)間為8 h（圖5c）。這是因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間太短，黑色素與三氯化鐵反應(yīng)不完全，形成的螯合物還不穩(wěn)定，導(dǎo)致其螯合效果較差；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間太長，三價(jià)鐵可能會(huì)與溶液中的氫氧化鈉結(jié)合生成氫氧化鐵紅色沉淀，導(dǎo)致螯合效果降低，所以選擇反應(yīng)時(shí)間為8 h 最好。因此，黑色素鐵螯合物的最佳螯合工藝為鐵離子濃度5 mmol/L，pH5.5，反應(yīng)8 h。

圖5 不同鐵離子濃度（a）、反應(yīng)pH（b）、反應(yīng)時(shí)間（c）對(duì)山杏核殼黑色素鐵螯合物的制備影響Fig.5 Effects of different iron ion concentrations (a),reaction pH (b) and reaction time (c) on the chelating of iron melanin chelate in apricot kernel shell

2.6 山杏核殼黑色素銅螯合物的螯合工藝優(yōu)化

山杏核殼黑色素銅螯合物在260 nm 左右出現(xiàn)新的吸收峰，這可能歸屬于銅離子與黑色素兒茶酚基螯合形成的特征吸收峰[34]；由圖6a 可知，銅離子濃度從2 mmol/L 到4 mmol/L，特征吸收峰260 nm 處的吸光值呈上升趨勢，4 mmol/L 到5 mmol/L，吸光值整體呈下降趨勢，4 mmol/L 吸光值達(dá)到最大，這可能是由于Cu2+濃度增加后以較高的比例參與螯合，但銅離子濃度為4 mmol/L 時(shí)已經(jīng)為黑色素提供了足夠的銅，使得在此反應(yīng)條件下的螯合效果最好，配位比太小，不能形成穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，螯合物不穩(wěn)定；配位比太大，又會(huì)造成黑色素的浪費(fèi)。圖中曲線在217 nm 處均出現(xiàn)吸收峰，可能因?yàn)槠鋚H 的影響，導(dǎo)致山杏核殼黑色素酸性位點(diǎn)去質(zhì)子化，解離出更多螯合位點(diǎn)，也有可能是因?yàn)镃u2+以不同比例與兒茶酚基螯合的結(jié)果。

圖6 不同銅離子濃度（a）、反應(yīng)pH（b）、反應(yīng)時(shí)間（c）對(duì)山杏核殼黑色素銅螯合物的制備影響Fig.6 Effects of different copper ion concentrations (a),reaction pH (b) and reaction time (c) on the chelating of copper melanin chelate in apricot kernel shell

由圖6b 可知，pH 從5.5 到7.5，260 nm 處吸光值呈上升趨勢，且217 nm 處吸收峰漸增強(qiáng)，這是因?yàn)殡S著pH 增大，促進(jìn)黑色素酸性位點(diǎn)去質(zhì)子化，解離出更多結(jié)合位點(diǎn)，因而在217 nm 處吸收峰增強(qiáng)；從7.5 到9.5，260 nm 吸光值整體呈下降趨勢，217 nm處吸光值變化不大，這是因?yàn)殂~離子可能與溶液中的氫氧化鈉結(jié)合，導(dǎo)致螯合效果降低（圖6b）。

由圖6c 可知，隨著反應(yīng)時(shí)間從2 到6 h，260 nm處吸光值呈上升趨勢，6 到10 h，其特征峰吸光值呈下降趨勢，6 h 時(shí)其吸光值達(dá)到最大，這是因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間太短，黑色素與硫酸銅反應(yīng)不完全，形成的螯合物還不穩(wěn)定，導(dǎo)致其螯合效果較差，所以選擇反應(yīng)時(shí)間為6 h 最好。因此，黑色素銅螯合物的最佳螯合工藝為銅離子濃度4 mmol/L，pH7.5，反應(yīng)6 h。

2.7 山杏核殼黑色素鋅螯合物的螯合工藝優(yōu)化

由圖7a 可知，鋅離子濃度從2 到3 mmol/L，其整體吸光值呈上升趨勢，3 到5 mmol/L，其整體吸光值呈下降趨勢，3 mmol/L 處整體吸光值達(dá)到最大（包括特征吸收峰360 nm 和500 nm 處[35]），這可能是因?yàn)殇\離子濃度為3 mmol/L 時(shí)已經(jīng)為黑色素提供了足夠的鋅，使得在此反應(yīng)條件下的螯合效果最好。如圖7b 所示，pH 從4.5 到7.5，吸光值整體呈上升趨勢，7.5 到8.5，吸光值呈整體呈下降趨勢，在pH7.5處時(shí)，整體吸光值達(dá)最大，pH 大于7.5 后，溶液中OH-與黑色素競爭鋅離子，使溶液中游離的鋅離子濃度變小，導(dǎo)致螯合率降低。如圖7c 所示，反應(yīng)時(shí)間從2 到4 h，整體吸光值呈上升趨勢，4 到6 h，整體吸光值呈下降趨勢，6 到10 h，整體吸光值（包括特征吸收峰360 nm 和500 nm 處）呈上升趨勢。因此，黑色素鋅螯合物的最佳螯合工藝為鋅離子濃度3 mmol/L，pH7.5，反應(yīng)4 h。

圖7 不同鋅離子濃度（a）、反應(yīng)pH（b）、反應(yīng)時(shí)間（c）對(duì)山杏核殼黑色素鋅螯合物的制備影響Fig.7 Effects of different zinc ion concentrations (a),reaction pH (b) and reaction time (c) on the chelating of zinc melanin chelate in apricot kernel shell

2.8 三種山杏核殼黑色素金屬螯合物的螯合程度比較

相同條件下，黑色素鐵螯合物的螯合效果最好（63.86%），而黑色素銅螯合物與黑色素鋅螯合物的螯合率分別為5.59%與3.05%，這可能是因?yàn)樵谠撛O(shè)置環(huán)境下鐵離子與黑色素的螯合更牢固，Hong 等[36]總結(jié)得出黑色素與金屬離子間親和力的大小順序：堿金屬＜?jí)A土金屬＜Zn（Ⅱ）＜Cu（Ⅱ）、Fe（Ⅲ）和Mn（Ⅱ）。根據(jù)姚增玉[37]研究的山杏種皮黑色素金屬螯合物的性質(zhì)，其在形成過程，金屬離子易促進(jìn)黑色素酸性位點(diǎn)去質(zhì)子化，且銅離子比鋅離子的促進(jìn)作用強(qiáng)，與黑色素螯合也更牢固，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明在同一條件下銅離子比鋅離子的螯合率更高。

2.9 山杏核殼黑色素金屬螯合物的紫外-可見光譜分析

如圖8 所示，248 nm 處黑色素鐵螯合物的吸收峰主要是因?yàn)榉恿u基參與了鐵離子的螯合，340 nm處歸因于DHI（5,6-二羥基吲哚）單元參與了鐵離子的螯合，其結(jié)果與陳士國等[33]研究的魷魚墨黑色素鐵螯合物的紫外圖一致。270 nm 處黑色素銅螯合物的紫外吸收峰歸于黑色素的兒茶酚基與Cu2+的螯合。黑色素鋅螯合物的吸收曲線上有多個(gè)吸收峰，但除了在210～220、240～250 和340～350 nm 處的3 個(gè)吸收峰外，其他各吸收峰缺乏規(guī)律性。240 nm 處是由Zn2+與羧基螯合引起的，350 nm 處的吸收峰是由Zn2+與醌胺基螯合引起，其結(jié)果與姚增玉[37]研究的山杏種皮黑色素鋅螯合物的紫外圖一致。

圖8 山杏核殼黑色素金屬螯合物的紫外-可見光譜圖Fig.8 UV-visible spectrum of melanin metal chelates in apricot kernel shell

2.10 山杏核殼黑色素金屬螯合物的紅外光譜分析

可采用紅外光譜分析通過黑色素金屬螯合物紅外透過率的變化來確定黑色素對(duì)重金屬的螯合作用。由山杏種皮黑色素紅外光譜結(jié)果可知，山杏核殼黑色素中存在酚羥基、羧基和氨基，這些基團(tuán)均是與金屬離子螯合的潛在部位，金屬離子與其螯合實(shí)際上是與H+在競爭結(jié)合位點(diǎn)。由圖9 可知，3 種黑色素金屬螯合物的紅外光譜非常相似，黑色素與金屬離子Cu2+、Fe3+和Zn2+螯合后，其最基本的變化是1600～1700 cm?1、1200～1400 cm?1和1515 cm?1處吸收峰的變化。1515 cm?1處的變化可能是因?yàn)镃u2+、Fe3+和Zn2+與氨基的螯合，其主要限制了NH 基團(tuán)彎曲和CN 基團(tuán)的伸縮振動(dòng)。1210 cm?1處的變化可能是因?yàn)镃u2+、Fe3+和Zn2+與羰基或者鄰位醌羥基的螯合。1700 cm?1為COO-的對(duì)稱帶，表明羧基離子化并參與了金屬離子的螯合[38]。

圖9 山杏核殼黑色素金屬螯合物的紅外光譜圖Fig.9 FT-IR spectra of melanin metal chelates in apricot kernel shell

2.11 山杏核殼黑色素金屬螯合物的掃描電鏡和能譜分析

圖10（a、d、g）為三種山杏核殼黑色素金屬螯合物的掃描電子顯微鏡圖，從圖可看出三者微觀形態(tài)相似但與山杏核殼黑色素存在顯著差異。山杏核殼黑色素呈立方體塊狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)較明顯，表面無附著物，且形貌較規(guī)則；而黑色素金屬螯合物較聚集，呈片狀，形狀大多不規(guī)則，表面較粗糙，有些許顆粒狀凸起，上述結(jié)果可能是由于黑色素與金屬離子反應(yīng)后可能改變了本身的一些基團(tuán)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變動(dòng)，從而導(dǎo)致其表面形貌發(fā)生了改變[39?40]。

圖10 山杏核殼黑色素金屬螯合物的SEM（5000×）及EDS 圖Fig.10 SEM (5000×) and EDS of apricot kernel shell melanin metal chelates

圖10（b、e、h）EDS 元素分析結(jié)果顯示黑色素金屬螯合物中主要存在C、O 及相應(yīng)的金屬元素。黑色素鐵螯合物中鐵的含量大約為21.39%，Si 元素的存在可能是因?yàn)镾EM 使用玻璃基底，所以在樣品比較薄的區(qū)域掃譜，會(huì)有基底的Si 信號(hào)出來（圖10b）；黑色素銅螯合物中Cu 的含量大約為32.52%（圖10e）；黑色素鋅螯合物中Zn 的含量大約為10.85%（圖10h）；結(jié)果表明，黑色素金屬螯合物的合成條件是可行的。

3 結(jié)論

本文確定了山杏核殼黑色素的最佳提取工藝為料液比1:10（g/mL），氫氧化鈉濃度1.5 mol/L，酸沉pH 為1，超聲時(shí)間35 min。之后分別得出了黑色素鐵螯合物的最佳制備工藝為鐵離子濃度5 mmol/L，pH5.5，反應(yīng)8 h；黑色素銅螯合物的最佳制備工藝為銅離子濃度4 mmol/L，pH7.5，反應(yīng)6 h；黑色素鋅螯合物的最佳制備工藝為鋅離子濃度3 mmol/L，pH7.5，反應(yīng)4 h。相同條件下，黑色素鐵螯合物的螯合率最大，達(dá)63.86%。山杏核殼黑色素金屬螯合物的紫外圖顯示鐵離子主要和黑色素兒茶酚基螯合，銅離子主要和黑色素酚羥基螯合。山杏核殼黑色素金屬螯合物紅外光譜圖表明金屬離子（Fe3+、Cu2+和Zn2+）主要與黑色素的羰基、鄰位醌基和氨基螯合。掃描電鏡及能譜掃描結(jié)果表明三種黑色素金屬螯合物的成功制備。

黑色素特有的安全性、負(fù)電性、高比表面積等特性使其與金屬離子具有良好的螯合能力，制得的螯合物不僅具有黑色素的活性，還兼具金屬離子的生物活性，在性能和應(yīng)用方面更有協(xié)同增效作用，顯著提升了黑色素在食品、生物和醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用。本文為深入探究和開發(fā)黑色素及其金屬螯合物奠定了理論基礎(chǔ)，在改善生物機(jī)能及金屬元素補(bǔ)充劑[38]等方面有廣闊的應(yīng)用前景。