基于在線生物監(jiān)測系統(tǒng)的氨氮脅迫下斑馬魚行為響應(yīng)

何雅琪 任宗明

(山東師范大學(xué)環(huán)境與生態(tài)研究院,濟南 250300)

傳統(tǒng)的水質(zhì)監(jiān)測方法包括經(jīng)典分析法、重量分析法和滴定分析法。其中滴定分析法包括酸堿滴定法、絡(luò)合滴定法、沉淀滴定法和氧化還原滴定法[1]。傳統(tǒng)監(jiān)測方法因存在操作相對復(fù)雜繁瑣、精確度較低及適用范圍受限的問題,已不能滿足當(dāng)下水質(zhì)監(jiān)測的需求。水生生物監(jiān)測方法基于生物結(jié)構(gòu)改變定量分析水環(huán)境的變化,可以實時精確掌握水質(zhì)變化趨勢[2],具有監(jiān)測污染時間長、敏感度更強、結(jié)果更全面和功能多樣化的特點[3]。生物監(jiān)測方法包括主動監(jiān)測和被動監(jiān)測[4],本研究使用的在線生物監(jiān)測系統(tǒng)屬于前者,基于受試生物應(yīng)對環(huán)境脅迫的行為響應(yīng),實現(xiàn)實時在線監(jiān)測水質(zhì)和評估污染狀況的目標[5,6]。以生物生理生態(tài)指標為劃分依據(jù),在線生物監(jiān)測方法主要分為 3 類[7]:(1)基于生物行為變化監(jiān)測;(2)基于生物新陳代謝變化監(jiān)測;(3)基于生物心電變化監(jiān)測?；谛袨樽兓脑诰€生物監(jiān)測是應(yīng)用于水質(zhì)監(jiān)測的方法之一,主要包括攝像示蹤監(jiān)測[8]、雙殼軟體類監(jiān)測[9]和四極阻抗監(jiān)測[10]等。攝像示蹤監(jiān)測通過攝像技術(shù)對水生生物的游動速度和軌跡等行為進行連續(xù)觀察并記錄,實現(xiàn)精準示蹤[8];雙殼軟體類監(jiān)測根據(jù)蚌類對環(huán)境脅迫的防御機制,雙殼閉合抵御外界污染物,在貝殼上安裝電磁感應(yīng)器對水質(zhì)進行監(jiān)測[9];四極阻抗監(jiān)測運用四極阻抗技術(shù),通過實時在線監(jiān)測傳感器內(nèi)受試生物的行為強度變化程度,進而對水環(huán)境進行分析,運用此技術(shù),更有利于實時評估水質(zhì),達到精準監(jiān)測水質(zhì)的目的[10—13]。

為應(yīng)對外界環(huán)境不斷變化,生物在發(fā)展進化過程中也形成一套自我保護機制,即生物內(nèi)穩(wěn)態(tài)機制(Homeostasis)。生物內(nèi)穩(wěn)態(tài)是指生物控制自身的體內(nèi)環(huán)境使其保持相對穩(wěn)定[14],具有內(nèi)穩(wěn)態(tài)機制的生物借助于內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定而相對獨立于外界條件,大大提高了生物的耐受范圍。行為適應(yīng)和調(diào)節(jié)是維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)最簡單高效的方法,生物通過行為調(diào)節(jié)將內(nèi)環(huán)境維持在耐受范圍之內(nèi),減少對外界環(huán)境的依賴[15]。調(diào)節(jié)過程主要有5個階段:無效應(yīng)、刺激、適應(yīng)調(diào)節(jié)、再調(diào)節(jié)和毒性效應(yīng)階段。假設(shè)生物處于外界環(huán)境壓力不斷增大,但不足以對生物體造成影響的條件下,為無效應(yīng)階段;當(dāng)環(huán)境壓力持續(xù)增大,超過生物最低抵抗閾值時,會本能地做出回避行為,生物逐漸適應(yīng)環(huán)境壓力,且行為活動逐漸穩(wěn)定,為適應(yīng)階段;若環(huán)境壓力持續(xù)增加,生物將再次適應(yīng)新的環(huán)境壓力,為再調(diào)節(jié)階段;當(dāng)環(huán)境壓力超過生物最大抵抗閾值,便會因毒性效應(yīng)發(fā)生死亡,為毒性效應(yīng)階段[16]。

有研究表明氨氮脅迫會抑制斑馬魚(Danio rerio)的繁殖行為,進而導(dǎo)致斑馬魚產(chǎn)卵量降低[17],氨氮脅迫下魚類會發(fā)生急性和慢性毒性效應(yīng),并受到外界環(huán)境的影響[18—20]。在本次實驗中假設(shè)氨氮脅迫對斑馬魚的行為響應(yīng)產(chǎn)生明顯的影響,基于在線生物監(jiān)測系統(tǒng)開展對照組(Control),氨氮脅迫組(NH3-N,0.15和1.5 mg/L)對斑馬魚行為響應(yīng)研究,探究氨氮脅迫下斑馬魚的行為響應(yīng)為本研究的核心目標。通過實時監(jiān)測獲取連續(xù) 15d 斑馬魚在氨氮脅迫下的行為數(shù)據(jù),對斑馬魚晝夜節(jié)律和行為響應(yīng)特征進行總結(jié),以期為環(huán)境脅迫下斑馬魚的行為響應(yīng)提供數(shù)據(jù)支撐,為提高在線生物監(jiān)測系統(tǒng)結(jié)果的精確性和突發(fā)性水質(zhì)監(jiān)測技術(shù)提供有效的支持和幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗裝置本次研究實驗裝置是在線生物行為監(jiān)測系統(tǒng)(OBBMS),該裝置由山東師范大學(xué)環(huán)境與生態(tài)研究院自主開發(fā)研制,由流水循環(huán)系統(tǒng)、生物傳感系統(tǒng)和監(jiān)測采集系統(tǒng)3部分組成(圖 1)。

采集監(jiān)測系統(tǒng)數(shù)字信號傳送至計算機通過快速傅立葉轉(zhuǎn)換(Fast fourier transform)成可視信號,并形成相應(yīng)曲線圖,在計算機系統(tǒng)中直觀展示(圖 1a)。行為強度是指斑馬魚運動能力的行為參數(shù)的強度,由系統(tǒng)直接檢測[22],系統(tǒng)每秒鐘記錄1次斑馬魚行為強度,每分鐘輸出1次行為強度的平均值,存儲為數(shù)值文件。行為強度值在[0—1]區(qū)間內(nèi),0 表示失去行為能力,1 表示行為的完整表達,通過行為強度的數(shù)值反映斑馬魚行為響應(yīng)變化[23]。

圖1 在線生物行為監(jiān)測系統(tǒng)Fig.1 Online biological behavior monitoring system

流水循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)置有蠕動泵、儲水槽和充氧泵(圖 1b)。蠕動泵可以根據(jù)實驗設(shè)計與需求控制水流速度,保持流水系統(tǒng)的循環(huán)。本次實驗水流速度控制在 2 L/h 左右,儲水槽內(nèi)放置實驗用水。充氧泵為流水系統(tǒng)提供充足的氧氣。三者結(jié)合實現(xiàn)自動化水流循環(huán),為斑馬魚提供基本生存環(huán)境。

生物傳感系統(tǒng)由4個生物傳感器組成,生物傳感器內(nèi)放置5尾斑馬魚(圖 1c)。生物傳感器下端為進水口,上端為出水口,設(shè)有兩組電極,一組為信號發(fā)射電極,發(fā)射低壓交流高頻電信號(電壓 0.5—5 V,頻率 100 Hz)形成電場;另一組為信號接受電極,接收傳感器內(nèi)斑馬魚行為對電場的干擾[21],利用信號濾除技術(shù)進行信號采集和處理,得到斑馬魚模擬行為學(xué)變化信號,結(jié)合模擬信號/數(shù)字信號轉(zhuǎn)換器(Analog-digital converters,A/D)將模擬電信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號[21]。

受試生物斑馬魚本次研究受試生物為斑馬魚,其易于大規(guī)模養(yǎng)殖,與人類基因高度相似,實驗操作簡單且對環(huán)境脅迫反應(yīng)靈敏[24,25]。近年來已有研究證明斑馬魚是一種具有晝夜節(jié)律的優(yōu)良模式生物[26]。斑馬魚具備的優(yōu)勢十分符合本次研究的要求,能夠達到預(yù)期實驗?zāi)繕?。實驗室具有?gòu)建完善的斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng),可以滿足本次實驗受試生物的需要;目前已經(jīng)具備體系完整的斑馬魚 OBBMS對水體環(huán)境進行評估,為本次研究提供技術(shù)支持。

1.2 實驗設(shè)計

設(shè)置3組實驗,分別為對照組(Control),氨氮脅迫組(NH3-N,0.15和 1.5 mg/L),每組實驗設(shè)置4個平行實驗。

實驗步驟如下:①受試生物的選擇:在斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中,隨機抽取20尾健康狀況良好、體長35—45 mm斑馬魚,雌雄比例為1∶1,實驗 24h 前停止喂食。② 實驗用水:在養(yǎng)殖系統(tǒng)飼養(yǎng)缸內(nèi)備置實驗用水(斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中,設(shè)有曝氣水裝置和循環(huán)水裝置。將水體加入曝氣裝置充分曝氣 3d 以上,待殘留的氯完全消除,溶氧充分后,加入水箱,通過纖維棉、清水樹脂、生化棉和瓷環(huán)等材料過濾,紫外殺菌后通過潛水泵進入飼養(yǎng)缸,通過循環(huán)水裝置再次進行過濾消殺,并定期更換過濾材料及養(yǎng)殖用水)。水溫(26±0.5)℃,硬度(CaCO3)(250±25) mg/L,pH(7.8±0.2),每組實驗水量為 4 L。③藥品配置:氯化銨(NH4Cl,純度≥99.5%)購自中國標準樣品中心,按照 NH4+離子濃度配制成濃度為 1 g/L的母液,根據(jù)實驗需求稀釋至所需濃度,放置于儲水箱內(nèi)。④ 毒性暴露:儀器校準,開啟流水循環(huán)系統(tǒng),使液面與生物傳感器上沿齊平。實驗開始前生物傳感器內(nèi)不放置斑馬魚,啟動在線生物監(jiān)測系統(tǒng),1h后待水流穩(wěn)定,使用儀器自帶的校準程序進行校準。

校準后,每個生物傳感器內(nèi)放置5尾斑馬魚,穩(wěn)定運行后進行流水試驗,在實驗過程中,對水源進行避光處理,系統(tǒng)自動采集并記錄數(shù)據(jù)(實驗開始后30min的數(shù)據(jù)為準),第一天上午8:00開始采集數(shù)據(jù),光源放置在實驗裝置上方 2 m 處,強度在3000—4500 lx,光暗比為 16h∶8h。

每兩天對斑馬魚進行一次飽食投喂(9:30),喂食結(jié)束30min后更換全部實驗用水,每天定時用電動虹吸泵清除糞便。

1.3 分析方法

本研究所有的數(shù)據(jù)分析,圖表繪制等工作主要基于 Excel 2010、SPSS22.0 和 MATLAB 環(huán)境(The Mathworks,R2014a)完成。

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(Mean±SD)呈現(xiàn),利用 Excel 2010 對實驗數(shù)據(jù)進行初步處理,計算出光暗周期行為強度的平均值,通過行為強度平均值的變化評估斑馬魚的回避行為。再將初步處理后的數(shù)據(jù)通過 MATLAB 軟件進行 Autocorrelation 和SOM 分析。對實驗數(shù)據(jù)使用 SPSS22.0 進行顯著性差異分析。在光暗周期下斑馬魚的行為強度數(shù)值根據(jù)P值確定其統(tǒng)計學(xué)意義,當(dāng)P＜0.01 時表示光周期與暗周期行為強度值的差異性,并且具有統(tǒng)計學(xué)意義;在氨氮暴露條件下斑馬魚的行為強度數(shù)值P＜0.05,P＜0.001 表示實驗組與對照組行為強度值的差異性,并且具有統(tǒng)計學(xué)意義。

Autocorrelation 又稱為串行相關(guān)或交叉自相關(guān),它是一個查找重復(fù)模式的數(shù)學(xué)分析工具,用于數(shù)據(jù)周期性分析。運用 Autocorrelation分析 OBBMS所監(jiān)測的信號與信號之間在不同時間序列點的關(guān)聯(lián)程度,分析評價斑馬魚晝夜節(jié)律的周期性特征[9]。

SOM 是一種基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的聚類分析,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)只包含輸入層和隱藏層,隱藏層中的一個節(jié)點代表一個需要聚成的類,每一個數(shù)據(jù)在隱藏層中與其最匹配的節(jié)點聚合,節(jié)點產(chǎn)生向周圍逐漸衰減的聚合現(xiàn)象,最終實現(xiàn)聚類。對數(shù)據(jù)進行 SOM 處理,通過交互計算對斑馬魚的行為進一步分析,更直觀地觀察氨氮脅迫下斑馬魚的行為響應(yīng)。使用 Ward連接法,依據(jù)歐幾里德距離以樹狀圖的表現(xiàn)形式進行聚類分析[27],揭示 SOM 單元之間的關(guān)聯(lián)程度。

2 結(jié)果

2.1 對照組斑馬魚行為響應(yīng)

將15d(360h)斑馬魚行為強度(Behavior strength,BS)數(shù)值整理見表 1。對照組斑馬魚行為強度平均值(Average behavior strength values,AV) 0.69±0.13,光周期行為強度平均值(Average behavior strength values in light periods,AVL) 0.73±0.13,暗周期行為強度平均值(Average behavior strength values in dark periods,AVD) 0.66±0.14,光暗周期行為強度差異 [Differences between AVD and AVL,D(AVDAVL)] 10.61% 。分析數(shù)據(jù),斑馬魚 AVL 明顯高于AVD,說明斑馬魚光周期BS高于暗周期,反映出斑馬魚行為活動特點?；诎唏R魚BS數(shù)據(jù),繪制斑馬魚行為強度變化曲線圖(圖 2)。

圖2 對照組斑馬魚行為強度曲線Fig.2 The BS value curve of zebrafish in control

表1 實驗周期中斑馬魚的行為強度平均值Tab.1 The BS mean values of zebrafish during 360h exposure

分析行為強度變化曲線,光周期斑馬魚BS增加至第1個峰值后降低,當(dāng)進入暗周期時,BS逐漸降低至第1個谷值,隨后又逐漸上升,到達第2個峰值后逐漸下降,進而又逐漸上升,之后變化趨勢與第1天大致相同。

分析行為強度變化曲線的趨勢線,發(fā)現(xiàn)斑馬魚BS比較穩(wěn)定,強度值保持在 0.68 左右。在實驗周期中,除2d、3d 和 4d時暗周期BS降幅較小外,基本每個暗周期 BS 都出現(xiàn)了明顯的谷值,進入光周期后,BS 又逐漸升高到第2個峰值,周期性為 24h,這一現(xiàn)象證明斑馬魚行為響應(yīng)具有明顯的晝夜節(jié)律現(xiàn)象。

運用自相關(guān)分析晝夜節(jié)律的周期性(圖 3)。

通過以下方面對圖 3 進行分析:(1)斑馬魚BS正相關(guān)與負相關(guān)呈現(xiàn)周期性表達。(2)正負相關(guān)性的變化過程與實驗過程中光暗周期范圍一致,峰值交替出現(xiàn)的周期性為 24h。(3)自相關(guān)分析中正負相關(guān)峰值具有對稱性,波峰有規(guī)律的降低。

圖3 斑馬魚行為強度自相關(guān)分析Fig.3 Autocorrelation function applies to BS values of zebrafish

得出,對照組斑馬魚行為響應(yīng)具有晝夜節(jié)律現(xiàn)象,以 24h 為周期;每個周期中斑馬魚的 BS 變化整體較為規(guī)律,沒有明顯的波動現(xiàn)象。

綜上,得出以下結(jié)論:斑馬魚的行為響應(yīng)具有明顯的晝夜節(jié)律現(xiàn)象,光周期BS高于暗周期BS,強度差異為 10.61%。實驗周期中斑馬魚BS比較穩(wěn)定,強度值保持在 0.68±0.13 左右。斑馬魚晝夜節(jié)律周期基本穩(wěn)定在 24h 左右。

2.2 氨氮脅迫組斑馬魚的行為響應(yīng)

氨氮脅迫組15d(360h)斑馬魚BS的數(shù)據(jù)見表 1。

根據(jù)表 1數(shù)據(jù),氨氮脅迫組(NH3-N,0.15和1.5 mg/L)斑馬魚AV分別為 0.68±0.09和 0.64±0.09,AVL分別為0.71±0.09和0.70±0.09,AVD分別為0.66±0.09和0.59±0.09,D(AVD-AVL)分別為 7.6%和18.64%。

差異性方面,氨氮脅迫組(NH3-N,0.15 mg/L)與對照組相比,D(AVD-AVL)差異小于對照,氨氮脅迫組(NH3-N,1.5 mg/L)、D(AVD-AVL)大于對照。氨氮脅迫組(NH3-N,0.15 mg/L)與對照差異性P＜0.05,氨氮脅迫組(NH3-N,1.5 mg/L)與對照差異性P＜0.001,說明在有效氨氮濃度下,濃度越高,斑馬魚行為活動的抑制越顯著(P＜0.001)。

繪制氨氮脅迫組斑馬魚行為強度變化曲線圖(圖 4 和圖 5)。

圖4 氨氮脅迫組(NH3-N,0.15 mg/L)斑馬魚行為強度曲線Fig.4 The BS value curve of zebrafish under 0.15 mg/L ammonia nitrogen stress

圖5 氨氮脅迫組(NH3-N,1.5 mg/L)斑馬魚行為強度曲線Fig.5 The BS value curve of zebrafish under 1.5 mg/L ammonia nitrogen stress

從行為強度曲線整體分析,氨氮脅迫組(NH3-N,0.15 mg/L)的行為變化曲線趨勢線略低于對照組,氨氮脅迫組(NH3-N,1.5 mg/L)的行為變化曲線趨勢線明顯低于對照組,且氨氮脅迫組(NH3-N,1.5 mg/L)暗周期行為強度的谷值出現(xiàn)延遲現(xiàn)象,以上特點和表 1 中的數(shù)據(jù)都表明,氨氮脅迫對斑馬魚的行為響應(yīng)具有抑制作用,在有效氨氮濃度下,濃度越高,抑制作用越強。

氨氮脅迫組自相關(guān)分析結(jié)果(圖 6 和 圖 7)。

圖6 氨氮脅迫組(NH3-N,0.15 mg/L)斑馬魚行為強度自相關(guān)分析Fig.6 Autocorrelation function applies to BS values of zebrafish under 0.15 mg/L ammonia nitrogen stress

通過以下方面對圖 7 和圖 8 進行分析:

圖7 氨氮脅迫組(NH3-N,1.5 mg/L)斑馬魚行為強度自相關(guān)分析Fig.7 Autocorrelation function applies to BS values of zebrafish under 1.5 mg/L ammonia nitrogen stress

(1)以 24h 為周期,正相關(guān)峰值與負相關(guān)峰值交替出現(xiàn)。(2)由于存在氨氮脅迫,斑馬魚行為響應(yīng)晝夜節(jié)律發(fā)生變化。在氨氮脅迫組(NH3-N,0.15 mg/L)中,1d時負相關(guān)峰值明顯低于對照組,14d和15d 時未出現(xiàn)明顯的正負相關(guān)性。(3)與對照組相比,氨氮脅迫組(NH3-N,1.5 mg/L)正負相關(guān)性異常,對稱性紊亂且峰值逐漸降低等。

得出,氨氮脅迫組(NH3-N,0.15 mg/L)中斑馬魚晝夜節(jié)律現(xiàn)象依舊明顯,周期性未發(fā)生較大改變,基本維持在 24h 左右。在氨氮脅迫組(NH3-N,1.5 mg/L)中斑馬魚晝夜節(jié)律發(fā)生紊亂,周期性出現(xiàn)異常。

基于每小時AV分析行為響應(yīng)與氨氮脅迫之間的關(guān)系,進行 SOM 聚類分析(圖 8)。

圖8A與8B相比,集群 2、3、5 表示光周期,集群 1、4、6 表示暗周期。對照組與 圖 8A 表現(xiàn)出良好的相關(guān)性,集群 2、3、5 與行為強度較強的紅色區(qū)域相匹配,說明 BS 在光周期較劇烈,集群1、4、6與行為強度較弱的藍色區(qū)域相匹配,說明暗周期 BS 低于光周期。圖 8C 中集群 3 和 5、集群 4和 6 緊密度最高,集群 3 和 5 與集群 2、集群 4 和6 與集群 1 緊密度次之,集群 2、3、5 與集群 1、4、6緊密度最低,表明相同周期的集群緊密度更高,從聚類分析的角度說明斑馬魚的晝夜節(jié)律現(xiàn)象。氨氮脅迫組與對照組相比(圖 8D),在行為抑制方面,氨氮脅迫組(NH3-N,0.15 mg/L)藍色區(qū)域面積變大,氨氮脅迫組(NH3-N,1.5 mg/L)藍色區(qū)域面積較低濃度組更大,說明氨氮脅迫對斑馬魚BS存在抑制作用,在有效氨氮濃度下,濃度越高,抑制作用越強。在晝夜節(jié)律方面,氨氮脅迫組(NH3-N,0.15 mg/L)和 (NH3-N,1.5 mg/L) 中本應(yīng)為光周期的集群 5與集群 2出現(xiàn)行為強度較低的藍色區(qū)域,這可能是因為在氨氮脅迫下,斑馬魚的行為響應(yīng)出現(xiàn)周期性延遲。

圖8 斑馬魚行為響應(yīng) SOM 聚類分析Fig.8 SOM profiles of behavior strength of zebrafish

綜上所述,可以得出以下結(jié)論:(1)氨氮脅迫下斑馬魚行為響應(yīng)最顯著的特點是行為活動遭到抑制。根據(jù)表 1 中的數(shù)據(jù)顯示,氨氮脅迫組(NH3-N,0.15 mg/L)BS 輕微抑制,氨氮脅迫組(NH3-N,1.5 mg/L) BS 抑制作用更強。(2)對照組和氨氮脅迫組斑馬魚行為響應(yīng)具有顯著的晝夜節(jié)律現(xiàn)象。自相關(guān)分析中正負相關(guān)峰值交替性出現(xiàn),總體表現(xiàn)出較為良好的對稱性且周期性為 24h,通過 SOM 聚類分析,大部分BS 的數(shù)據(jù)符合光暗周期的時間分布,說明了斑馬魚行為響應(yīng)具有晝夜節(jié)律現(xiàn)象。

本次研究的結(jié)果說明,在周期為 15d 的斑馬魚行為響應(yīng)實驗中,基于對 OBBMS采集的行為強度數(shù)據(jù)采取不同的分析手段,斑馬魚行為響應(yīng)表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律現(xiàn)象,周期為 24h 左右。在氨氮脅迫下斑馬魚行為強度遭到抑制,在有效氨氮濃度下,濃度越高,抑制作用越強,同時晝夜節(jié)律也出現(xiàn)時間節(jié)點延遲和聚類分析異常的現(xiàn)象。

3 討論

游動是魚類的重要行為之一,高度脅迫下魚類進行力竭游動,此時供能物質(zhì)為白肌的無氧糖,無氧糖酵解會加速氨的生成,致使機體內(nèi)氨含量增加,氨氮毒性作用進一步加強。張云龍等[28,30]對鯉和鯽的研究中發(fā)現(xiàn)氨氮脅迫下魚類游動能力降低,這可能是因為 NH4+的增加使魚類代謝方式發(fā)生變化,并且替代 K+造成肌肉細胞膜去極化,損傷肌肉組織。因此,游動和氨氮脅迫對魚類是兩個相互作用的因素,游動擴大了氨氮毒性,氨氮脅迫降低了魚類的游動能力。在本研究中,對照組斑馬魚 AV 為 0.69±0.13,氨氮脅迫組(NH3-N,0.15和 1.5 mg/L)AV分別為0.68±0.09和0.64±0.09,氨氮脅迫組 AV 低于對照組,表明氨氮脅迫降低了魚類的游動能力,且氨氮脅迫組(NH3-N,0.15 mg/L)與對照組差異性P＜0.05,氨氮脅迫組(NH3-N,1.5 mg/L)與對照組差異性P＜0.001,說明在有效氨氮濃度下,濃度越高,斑馬魚行為活動的抑制越明顯。

氨氮會影響魚類的生長發(fā)育、滲透壓平衡、行為活動等,并且會對魚類產(chǎn)生急性和慢性毒性效應(yīng)[19],處于氨氮脅迫下斑馬魚行為響應(yīng)最顯著的特點是行為活動遭到抑制,且在有效濃度下,濃度越高抑制作用越強,同時晝夜節(jié)律也出現(xiàn)時間節(jié)點延遲和聚類分析異常的現(xiàn)象。趙瑞彬[16]指出,行為活動遭受抑制是斑馬魚在環(huán)境脅迫下最顯著的現(xiàn)象,抑制現(xiàn)象在實驗組均有表現(xiàn),其中3組高濃度暴露實驗抑制程度(P＜0.001)比兩組低濃度暴露實驗(P＜0.05)更加顯著,行為活動受抑制的程度與環(huán)境脅迫有關(guān),在一定濃度范圍內(nèi)具有正相關(guān)關(guān)系,實驗組 SOM聚類分析中 BS 分布圖也有異?，F(xiàn)象,暗周期內(nèi)的聚類出現(xiàn)了行為強度較高的紅色部分,顯示出晝夜節(jié)律周期的延遲性,這與本研究結(jié)果一致。

潘宏偉[30]通過探究[0.52 μg/L(0.1TU),2 μg/L(10%地表水)]溴氰菊酯(DM)對斑馬魚腦和心臟中毒蕈堿受體(M1)、乙酰膽堿酯酶(AChE)及前動力蛋白 2(PK2)表達的影響,研究 DM 對斑馬魚行為響應(yīng)的機制。發(fā)現(xiàn)實驗組中斑馬魚腦和心臟中的AChE 大部分高于對照組,可能會造成乙酰膽堿含量降低,進而導(dǎo)致斑馬魚的 AV下降,且 DM 干擾斑馬魚腦和心臟中 PK2 的正常表達,影響行為節(jié)律信號輸出,進而擾亂斑馬魚的晝夜節(jié)律。潘宏偉探究 DM 對斑馬魚的行為影響及內(nèi)在機制,為本次研究結(jié)果提供理論依據(jù)。

現(xiàn)實中水體污染物種類不單單為一種,多種污染物的聯(lián)合暴露的毒性效應(yīng)尚不明確。王余江等[31]發(fā)現(xiàn)視黃酸的存在對因四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)和十溴聯(lián)苯醚(BDE-209)暴露引起的斑馬魚運動行為異常起到恢復(fù)作用,李佳妮等[32]研究得出2 μmol四溴雙酚A(TBBPA)對斑馬魚有較強的毒性作用,但是TBBPA 聯(lián)合50 μg/mL Anti-IntegrinαVβ3 抗體(LM609)顯微注射的斑馬魚胚胎的毒性作用減弱,說明LM609在一定程度上削弱了TBBPA 對斑馬魚的神經(jīng)行為毒性影響。目前關(guān)于氨氮的聯(lián)合暴露對水生生物的毒性效應(yīng)進展較少,因此探究氨氮與多種污染物的聯(lián)合暴露成為后續(xù)斑馬魚行為研究的方向。

由于水體突發(fā)污染事件頻發(fā),水質(zhì)在線生物監(jiān)測系統(tǒng)的發(fā)展與使用引起世界各國高度關(guān)注。近年來,我國在線水質(zhì)監(jiān)測系統(tǒng)和管理體系發(fā)展迅速,開發(fā)了基于四級阻抗技術(shù)的生物安全預(yù)警系統(tǒng)(BEWS),并在生產(chǎn)生活中應(yīng)用廣泛,在全國七十多個水廠和環(huán)境監(jiān)測站運行,為保障城市居民飲水安全做出重大貢獻。韓國在國內(nèi)5 條主要河道干流安裝水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)(AWAMNs),在50 個 AWAMNs 監(jiān)測站點中有 39 個應(yīng)用OBBMS,且計劃進一步增加 AWAMNs 的數(shù)量。在線生物監(jiān)測系統(tǒng)具有運行經(jīng)濟性、技術(shù)先進性、監(jiān)測實時性和結(jié)果精確有效性等特點,在處理水體應(yīng)急污染事件,維護社會秩序、保證供水安全及社會經(jīng)濟持續(xù)健康發(fā)展等方面,將會發(fā)揮越來越重要的作用[20]。

綜上所述,本次研究運用基于四級阻抗技術(shù)的在線生物監(jiān)測系統(tǒng),探究0.15和1.5 mg/L氨氮脅迫下斑馬魚行為響應(yīng),斑馬魚行為響應(yīng)表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律現(xiàn)象,周期為24h左右。在氨氮脅迫下斑馬魚行為強度遭到抑制,在有效氨氮濃度下,濃度越高,抑制作用越強,同時晝夜節(jié)律也出現(xiàn)時間節(jié)點發(fā)生延遲和聚類分析異常的現(xiàn)象。本研究是對氨氮脅迫下斑馬魚行為響應(yīng)的初步研究,探究氨氮對斑馬魚的內(nèi)在機制成為后續(xù)研究的方向。