王和濤，劉羅羅

（1.青島酒店管理職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)教學(xué)部，山東 青島 266100；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018）

花椒（Zanthoxylum bungeanum）是重要的香料和藥用經(jīng)濟(jì)作物，為蕓香科花椒屬落葉小喬木［1，2］，在我國分布廣泛，大多在海拔1 200 m以下山坡，主要產(chǎn)于貴州、云南、四川等省份［3－5］。目前已形成四川茂漢、貴州六盤水、云南曲靖等全國聞名的種植基地［6，7］?；ń烦蟹枷阌汀⒍喾?、糖苷、生物堿、蛋白質(zhì)等多種活性成分外，還富含黃酮類化合物［8，9］。黃酮類化合物具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗病毒、防止動(dòng)脈硬化、延緩衰老等藥理活性［10－12］，已被廣泛應(yīng)用于藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域［13，14］。對(duì)花椒中黃酮進(jìn)行提取并開發(fā)成多種類型的功能食品及其他高附加值產(chǎn)品，有助于實(shí)現(xiàn)花椒資源的高值化利用［15，16］。

超聲波輔助提取法主要是利用其空化作用破壞植物細(xì)胞使提取物溶入提取液中，進(jìn)而提高提取效率，是一種操作簡單、便捷、能耗低的生物活性物質(zhì)提取方法［17］。目前，關(guān)于黃酮提取工藝優(yōu)化的研究報(bào)道較多：如楊爽等［18］采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化索氏提取薏米中黃酮；馬俊鵬等［19］采用正交試驗(yàn)優(yōu)選鐵力木花蕾總黃酮提取工藝；米智等［20］采用正交試驗(yàn)優(yōu)化苦蕎黃酮提取工藝。然而，利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取技術(shù)提高花椒中黃酮提取得率的研究還鮮見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)采用超聲波輔助法提取花椒中的黃酮，以乙醇濃度、料液比、提取溫度及提取時(shí)間為考察因素，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過Box－Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化其最佳提取工藝，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，旨在為花椒黃酮的高值化開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

花椒：市售，產(chǎn)地云南曲靖市，用研磨儀粉碎過80目篩后備用。

水為GB／T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定一級(jí)水；硝酸鋁、乙酸鉀、氫氧化鈉等（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（分析純）：濟(jì)南潤泰化工有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.0%，生產(chǎn)批號(hào)：C100001）：北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司；1，1－二苯基－2－苦肼基（1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl，DPPH）、維生素C（純度≥98.0%）：北京壇墨質(zhì)檢有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CLN－24L低溫組織研磨儀：上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；FA2204電子分析天平：上海衡平儀器儀表有限公司；UV－2601可見分光光度計(jì)：北京北分瑞利分析儀器（集團(tuán)）公司；80目標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)篩：上海過望化工有限公司；SCQ－1800F超聲波提取儀：上海聲彥超聲波儀器有限公司；H2500R－2高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；WB－502S超級(jí)電熱恒溫水浴鍋：廣東環(huán)凱生物科技有限公司；OE－45電熱鼓風(fēng)干燥箱：中科瑞捷（天津）科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花椒黃酮的提取 稱取適量花椒粉末置于圓底燒瓶中，加入適量石油醚（60～90℃），回流萃取3次，旋轉(zhuǎn)濃縮除去石油醚，殘?jiān)?0℃烘箱中干燥至恒重取出，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取上述殘?jiān)鼧悠?.0 g（精確至0.001 g）置于150 mL具塞三角瓶中，用75% ～95%的乙醇作為提取溶劑，按料液比1∶（10～30）g／mL加入提取溶劑，在提取溫度為40～80℃條件下置于超聲波提取儀中提取15～55 min，儀器工作頻率為40 kHz；提取液以4 500 r／min離心10 min，取上清液；按照相同條件重復(fù)1次，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸餾儀濃縮至1 mL，過C18SPE小柱進(jìn)行脫色處理，用無水乙醇定容至50 mL，得到花椒黃酮的提取液，待測。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取50 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，并超聲溶解，即得濃度為1.0 mg／mL貯備液，于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＞芪√J丁貯備液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加無水乙醇至總體積為15 mL，然后依次加入質(zhì)量濃度為100 g／L的硝酸鋁溶液1 mL、98 g／L的乙酸鉀溶液1 mL，搖勻后加水至刻度，再次搖勻，靜置60 min，即得標(biāo)準(zhǔn)工作液，其質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 mg／mL；用1 cm比色皿于420 nm處測其吸光度，以30%乙醇溶液為空白；以50 mL中蘆丁質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得y＝1.7879x＋0.06984，R2＝0.9999。

1.3.3 花椒黃酮的測定 精密吸取待測樣品溶液1.0 mL，置于50 mL容量瓶中，按照1.3.2顯色反應(yīng)后測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算花椒黃酮提取得率：

式中：X為黃酮類化合物的得率，%；m為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出的樣品比色液中蘆丁質(zhì)量，mg；W 為樣品的質(zhì)量，g；d為稀釋比例。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 固定料液比1∶20 g／mL、提取溫度70℃、時(shí)間35 min，考察不同乙醇濃度（75%、80%、85%、90%、95%）對(duì)花椒黃酮得率的影響；固定乙醇濃度85%、提取溫度70℃、提取時(shí)間35 min，考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g／mL）對(duì)花椒黃酮得率的影響；固定乙醇濃度85%、料液比1∶20 g／mL、提取時(shí)間35 min，考察不同提取溫度（40、50、60、70、80℃）對(duì)花椒黃酮得率的影響；固定乙醇濃度85%、料液比1∶20 g／mL、提取溫度70℃，考察不同提取時(shí)間（15、25、35、45、55 min）對(duì)花椒黃酮得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）為自變量，以花椒黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box－Behnken試驗(yàn)原理［25］做四因素三水平曲面設(shè)計(jì)，應(yīng)用Design－Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及模型建立，對(duì)黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素、水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.3.6 花椒黃酮體外抗氧化活性研究 DPPH自由基清除試驗(yàn)：根據(jù)已報(bào)道的方法［21，22］，用95%乙醇配制0.2 mmol／L的DPPH溶液，分別在10支10 mL離心管中加入1.0 mL不同濃度的樣品提取液，再分別加入DPPH溶液4 mL，充分搖勻，于黑暗環(huán)境中反應(yīng)30 min，在517 nm處測定其吸光度。以相同質(zhì)量濃度的L－抗壞血酸（VC）作為陽性對(duì)照，用以下公式計(jì)算DPPH自由基清除率：

式中：SDPPH為DPPH自由基清除率，%；A0為1 mL蒸餾水＋4 mL DPPH溶液的吸光度；Ai為1 mL樣品＋4 mL DPPH溶液的吸光度；Aj為1 mL樣品＋4 mL無水乙醇的吸光度。

花椒黃酮對(duì)羥基自由基的清除能力：根據(jù)文獻(xiàn)方法［23，24］，分別在10支10 mL離心管中分別加入1.0 mL不同濃度的樣品提取液，再分別依次加入6 mmol／L的FeSO42.0 mL和6 mmol／L的水楊酸2.0 mL，混勻后再加入6 mmol／L的H2O22.0 mL啟動(dòng)Fetion反應(yīng)，35～40℃恒溫水浴35 min，靜置15 min后于510 nm處測定其吸光度。以相同質(zhì)量濃度的L－抗壞血酸（VC）作為陽性對(duì)照，用以下公式計(jì)算羥基自由基清除率：

式中：S羥為羥基自由基清除率，%；Ae為空白組吸光度；Ax為樣品組吸光度；As為去離子水代替H2O2測得的對(duì)照組吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)平行測定3次，使用Microsoft office 2016制圖，應(yīng)用Design－Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒總黃酮提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

由圖1結(jié)合表2分析可知，花椒黃酮提取得率隨著乙醇濃度的增加呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，當(dāng)乙醇濃度為85%時(shí)達(dá)到最大值。原因可能是乙醇濃度為85%時(shí)，花椒黃酮的溶出趨于飽和；隨著乙醇濃度的繼續(xù)增加，花椒中其他脂溶性物質(zhì)、醇溶性色素溶出增多，這些成分會(huì)與花椒黃酮類化合物競爭乙醇－水分子結(jié)合體，從而使得花椒黃酮得率降低。因此選擇80%、85%、90%乙醇濃度進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

表2 黃酮提取工藝因素水平

圖1 單因素對(duì)黃酮得率的影響

料液比1∶（10～20）g／mL范圍內(nèi)，隨著乙醇比例增加花椒黃酮提取得率急劇增加。其原因可能是隨著乙醇比例的增大，花椒樣品與提取溶劑的接觸面積增大，這有利于花椒黃酮的溶出；隨著乙醇比例繼續(xù)增加，花椒黃酮提取得率趨于平緩，不僅會(huì)造成其他雜質(zhì)溶出，還會(huì)增加提取成本。因此選擇料液比1∶15、1∶20、1∶25 g／mL進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

花椒黃酮的提取得率隨著提取溫度的升高呈先增大后降低的趨勢，70℃時(shí)達(dá)到最大值。其原因可能是在一定的范圍內(nèi)提高提取溫度能降低提取溶劑與樣品的粘稠度，增加花椒黃酮在提取溶劑中的擴(kuò)散性和溶解度，有利于花椒黃酮溶出從而使提取得率升高。當(dāng)提取溫度過高時(shí)，高溫會(huì)造成花椒黃酮的破壞，從而使其提取得率降低。因此選擇提取溫度60、70、80℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

花椒黃酮提取得率隨著提取時(shí)間的延長呈先增加后降低趨勢，并在35 min時(shí)達(dá)到最大值。這表明提取時(shí)間為35 min時(shí)，花椒黃酮已趨于完全溶入提取溶劑中，繼續(xù)延長提取時(shí)間反而會(huì)使花椒黃酮長時(shí)間處于高溫浸泡中，導(dǎo)致其分子結(jié)構(gòu)破壞，同時(shí)伴隨花椒中其他雜質(zhì)的溶出，花椒黃酮提取得率下降。因此選擇提取時(shí)間25、35、45 min進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 回歸模型的建立及分析 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用響應(yīng)面法對(duì)花椒黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表3。對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為Y＝56.18＋0.37A－0.21B－0.74C＋0.59D＋0.64AB－0.51AC＋0.47AD＋0.57BC－0.78BD＋0.37CD－0.69A2＋1.01B2－0.88C2＋1.87D2。

表3 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

由表4可知，P模型<0.0001，表明回歸模型具有高度顯著性；P失擬項(xiàng)＝0.836＞0.05，說明模型構(gòu)建成功，試驗(yàn)以外的其他因素對(duì)黃酮提取得率影響較小；判定系數(shù)R2＝0.987，表明回歸方程的擬合度較好。根據(jù)F值的大小可知，4個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)黃酮得率的影響表現(xiàn)為提取溫度（C）＞乙醇濃度（A）＞提取時(shí)間（D）＞料液比（B）。其中，一次項(xiàng)A、C和二次項(xiàng)D2對(duì)黃酮得率的影響極顯著（P<0.01），一次項(xiàng)D和二次項(xiàng)A2及交互項(xiàng)AB、AC對(duì)黃酮得率的影響顯著（P<0.05），其余項(xiàng)影響不顯著。

表4 回歸模型的方差分析

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 為評(píng)價(jià)兩因素交互作用對(duì)黃酮得率的影響并確定各因素的最佳水平范圍，分別繪制4因素兩兩交互的響應(yīng)曲面圖，如圖2所示。曲面走勢越陡峭，表明兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著［25］?？梢钥闯?，乙醇濃度與料液比、乙醇濃度與提取溫度的交互作用顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面走勢陡峭。

圖2 兩兩因素交互作用對(duì)花椒黃酮得率的影響

2.3 最佳提取工藝的確定與驗(yàn)證

應(yīng)用Design－Expert 8.0.6軟件求解二次回歸方程可得花椒黃酮提取最優(yōu)工藝參數(shù)：乙醇濃度為85.24%，料液比為1∶19.89 g／mL，提取溫度為71.12℃，提取時(shí)間為35.15 min，預(yù)測花椒黃酮的提取得率為11.98%?？紤]到實(shí)際提取工作中的操作可行性，將工藝參數(shù)修正為：乙醇濃度85%，料液比1∶20 g／mL，提取溫度70℃，提取時(shí)間35 min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，花椒黃酮的實(shí)際提取得率為12.16%，該值與預(yù)測值基本相符，表明確定的黃酮提取工藝準(zhǔn)確有效。

2.4 抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力 DPPH是一種以氮為中心非常穩(wěn)定的自由基，在517 nm處具有較強(qiáng)的吸光度，通常用于檢測樣品的抗氧化能力。由圖3可知，花椒黃酮質(zhì)量濃度在0.01～1.0 mg／mL范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基的清除率隨著濃度的增加呈上升趨勢。0.2 mg／mL時(shí)，花椒黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率為55.12%，該濃度下VC對(duì)DPPH自由基的清除率為80.65%，相同質(zhì)量濃度下VC對(duì)DPPH自由基的清除效果明顯優(yōu)于花椒黃酮。經(jīng)Graphpad Prism 7計(jì)算得花椒黃酮和抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率即IC50值分別為0.0819、0.0315 mg／mL?？梢?，花椒黃酮對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力，但與VC相比能力較弱，可作為天然抗氧化劑應(yīng)用。

圖3 花椒黃酮粗提物對(duì)DPPH自由基的清除能力

2.4.2 羥基自由基清除能力 通過Fenton體系產(chǎn)生的羥基自由基與水楊酸混合后的產(chǎn)物在510 nm處有特殊吸收，加入自由基清除劑后，羥基自由基減少，與水楊酸的產(chǎn)物減少，吸光度降低。由圖4可知，花椒黃酮質(zhì)量濃度在0.01～1.0 mg／mL范圍內(nèi)對(duì)羥基自由基的清除率隨著濃度的增加呈上升趨勢。0.2 mg／mL時(shí)，花椒黃酮對(duì)羥基自由基的清除率為56.38%，而VC對(duì)羥基自由基的清除率為85.65%，清除效果明顯優(yōu)于花椒黃酮。經(jīng)計(jì)算得花椒黃酮和抗壞血酸對(duì)羥基自由基的半數(shù)清除率即IC50值分別為0.0376、0.0265 mg／mL。說明花椒黃酮提取物對(duì)羥基自由基具有一定清除能力。

圖4 花椒黃酮粗提物對(duì)羥基自由基的清除能力

3 結(jié)論

本研究采用超聲波輔助提取花椒中黃酮成分，并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，考察乙醇濃度、料液比、提取溫度及提取時(shí)間對(duì)花椒黃酮提取得率的影響。結(jié)果表明，由響應(yīng)面分析得到的二次模型擬合度較高，影響花椒黃酮提取得率的因素表現(xiàn)為提取溫度＞乙醇濃度＞提取時(shí)間＞料液比；最佳提取工藝為乙醇濃度85%、料液比1∶20 g／mL、提取溫度70℃、提取時(shí)間35 min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，花椒黃酮的實(shí)際提取得率為12.16%，與預(yù)測值11.98%基本相符，說明所得花椒黃酮提取工藝可靠有效，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

體外抗氧化活性研究表明，花椒黃酮對(duì)DPPH自由基和羥基自由基具有一定清除能力，其IC50值分別為0.0819、0.0376 mg／mL。盡管花椒黃酮的抗氧化活性遠(yuǎn)低于L－抗壞血酸，但在一定濃度下花椒黃酮具有抑制自由基生成的作用，因此，花椒黃酮粗提物有望開發(fā)為天然抗氧化劑。后續(xù)將進(jìn)一步分離鑒定花椒黃酮粗提物，為花椒黃酮的綜合開發(fā)與利用提供理論支撐。