李文鳳,王曉燕,倉曉燕,張榮躍,單紅麗,盧文潔,王長秘,尹 炯,黃應(yīng)昆
(1云南省農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室,云南開遠 661699;2云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所,昆明 650205)
甘蔗白葉病是由16S rXI 組植原體引起的檢疫性甘蔗病害[1]。甘蔗白葉病1954年在泰國首次發(fā)現(xiàn)[2],現(xiàn)今在印度、巴基斯坦、越南等東南亞植蔗國家普遍發(fā)生、危害嚴重,給當?shù)卦斐删薮蠼?jīng)濟損失[3-5]。2013 年Li 等[6]首次檢測確定云南保山存在甘蔗白葉病,隨后云南臨滄和普洱主產(chǎn)蔗區(qū)也相繼發(fā)現(xiàn)甘蔗白葉病[7-9],其暴發(fā)流行趨勢明顯,已嚴重影響到云南蔗糖產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。
甘蔗屬宿根栽培無性繁殖作物,甘蔗白葉病植原體主要由蔗種帶病傳播,在臺灣和泰國,還可通過細針葉蟬(Matsumuratettix hiroglyphicus)和條紋閉顏葉蟬(Yamatotettix flavovittatus)進行田間自然傳播,其他葉蟬介體還沒有被證實[10-13]。植原體的傳毒媒介及其機理是防病的基礎(chǔ),目前云南蔗區(qū)甘蔗白葉病植原體的傳毒媒介及其機理尚不明確,不利于此病害的科學防控。
2019年,對甘蔗白葉病發(fā)病最嚴重的云南耿馬蔗區(qū)植原體昆蟲介體進行調(diào)查,共采到昆蟲介體14份進行種類鑒定。參照Hanboonsong等[11]的方法分別提取昆蟲介體DNA,使用植原體通用引物對P1/P7[14]和R16F2n/R16R2[15]進行Nest-PCR檢測、克隆、測序,以分析明確云南耿馬蔗區(qū)甘蔗白葉病植原體昆蟲介體及優(yōu)勢種群,旨在為云南甘蔗白葉病有效防控提供科學依據(jù)。
2019年5—6月,對甘蔗白葉病發(fā)病最嚴重的云南耿馬賀派和芒翁蔗區(qū)植原體昆蟲介體進行調(diào)查(北緯13°29′—23°36′,東經(jīng)99°22′—99°45′,海拔1100.00~1300.00 m)。選擇感病品種‘粵糖60 號’、‘新臺糖25號’、‘盈育91-59’、‘粵糖93-159’、‘新臺糖22號’發(fā)病嚴重地塊,采用尋集法和掃網(wǎng)法重點調(diào)查采集葉蟬、飛虱等植原體昆蟲介體,將采集到的昆蟲介體及時移入盛有75%酒精的離心管中保存,并記錄采集時間、地點,帶回實驗室進行種類鑒定。
參照Hanboonsong 等[11]的方法,使用動物基因組DNA提取試劑盒(生工生物公司)提取昆蟲介體DNA。
采用植原體通用引物對為P1/P7[14](P1:5’-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3’,P7:5’-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3’) 和 R16F2n/R16R2[15](R16F2n:5’-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3’,R16R2:5’-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3’),預(yù)期擴增產(chǎn)物長度為1240 bp,以抽提的昆蟲介體DNA 為模版,參照張榮躍等[8]的方法對各樣品進行Nest-PCR檢測。
隨機選擇陽性擴增產(chǎn)物,使用全式金回收試劑盒回收目的片段,并進行連接轉(zhuǎn)化、克隆、測序。所得序列在GenBank 中作BLAST 檢索對比,使用DNAMAN v6.0分析核苷酸序列。
從甘蔗白葉病發(fā)病最嚴重的云南耿馬蔗區(qū)采集到14 份昆蟲介體樣品,經(jīng)實驗室種類鑒定為大青葉蟬Tettigoniella viridis6 份(其中若蟲2 份)和條紋平冠沫蟬Clovia conifer8份(其中若蟲2份)(表1)。
如表1、圖1所示,14份昆蟲介體樣品中2號、3號、5號、8號、9號、10號共6份樣品為陽性,其余8份樣品為陰性。其中,10號樣品(大青葉蟬若蟲)巢式PCR擴增條帶粗且明亮樣品中有高含量甘蔗白葉病植原體為強陽性,3號、9號樣品(大青葉蟬若蟲、成蟲)和2號、5號、8號樣品(條紋平冠沫蟬若蟲、成蟲)巢式PCR擴增條帶細且弱暗樣品中有低含量甘蔗白葉病植原體為弱陽性。
圖1 14份昆蟲介體樣品甘蔗白葉病巢式PCR檢測電泳圖
表1 14份昆蟲介體樣品甘蔗白葉病巢式PCR檢測結(jié)果
測序結(jié)果顯示,2 號和10 號樣品2 個陽性擴增產(chǎn)物片段大小為1247 bp,序列間的核苷酸一致性為100%。BLASTN分析結(jié)果表明,本研究獲得的2條序列(Genbank 登錄號MT649297 和MT649298)與云南臨滄和斯里蘭卡甘蔗白葉病植原體分離物16S rRNA基因序列(Genbank 登錄號KR020691 和MN174860)的核苷酸序列一致性為100%。
國內(nèi)目前已報道的與植原體相關(guān)的病害有100余種[16],甘蔗白葉病是近年云南蔗區(qū)快速蔓延開來的植原體新病害,現(xiàn)已嚴重影響到云南甘蔗產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效和蔗農(nóng)增收。自然條件下,葉蟬、飛虱、木虱、蚜蟲、粉虱以及椿類等是植原體的傳毒媒介[17-18]。在中國臺灣和泰國,細針葉蟬(Matsumuratettix hiroglyphicus)和條紋閉顏葉蟬(Yamatotettix flavovittatus)自然傳播甘蔗白葉病植原體,其他葉蟬介體尚未得到證實[11-14]。研究表明噴施殺蟲劑對降低SCWL 的發(fā)生率效果不理想[19-21],甘蔗種莖用熱水處理不能有效清除種莖中的SCWL植原體[22]。而通過組織培養(yǎng)繁育健康甘蔗苗被認為是消除甘蔗體內(nèi)SCWL植原體最有效的方法,大量推廣使用甘蔗無病組培苗及其種莖控制SCWL 在泰國收到很好的效果[23]。目前云南蔗區(qū)甘蔗白葉病植原體傳毒媒介及其機理不明,不利于此病害的科學防控。本研究結(jié)果顯示,從甘蔗白葉病發(fā)病最嚴重的云南耿馬蔗區(qū)采集到的大青葉蟬(T.viridis)和條紋平冠沫蟬(C.conifer)2 種昆蟲介體均被檢測為陽性,是甘蔗白葉病植原體的自然攜帶者,說明2 種葉蟬可能為甘蔗白葉病植原體潛在昆蟲介體,而10號樣品大青葉蟬若蟲巢式PCR 擴增條帶粗且明亮樣品中有高含量甘蔗白葉病植原體呈強陽性,初步確定為優(yōu)勢種群,有待對其進一步作獲毒、持毒及傳毒期和傳毒方式、傳毒效率等傳毒特性測試驗證。本次調(diào)查,從甘蔗白葉病發(fā)病最嚴重的云南耿馬蔗區(qū)僅采到昆蟲介體14份樣品,種類單一、數(shù)量極低,這可能與多年來國內(nèi)蔗區(qū)推廣應(yīng)用吡蟲啉、噻蟲嗪及其復(fù)配制劑有效防控甘蔗綿蚜、葉蟬、薊馬等蟲媒介體有關(guān)[24-25],這在一定程度上也減緩了甘蔗白葉病植原體的田間自然傳播。研究結(jié)果豐富了甘蔗植原體病害相關(guān)理論和技術(shù)基礎(chǔ),有助于制定適用于甘蔗白葉病的綜合防控措施。本研究僅對云南耿馬局部蔗區(qū)和5—6月甘蔗生長早期進行調(diào)查,存在調(diào)查范圍和時期及重復(fù)性不足,應(yīng)擴大調(diào)查范圍、延長調(diào)查時期、增加調(diào)查次數(shù),并對蟲媒介體優(yōu)勢種群進行
獲毒、持毒及傳毒期和傳毒方式、傳毒效率等系統(tǒng)性傳毒特性測試,以期全面明確中國甘蔗白葉病植原體蟲媒介體及傳毒特性,揭示國內(nèi)甘蔗白葉病主要發(fā)生區(qū)蟲媒介體對病害發(fā)生流行的影響。
甘蔗白葉病是可造成甘蔗絕產(chǎn)絕收的一種植原體病害[1]。目前云南蔗區(qū)甘蔗白葉病植原體傳播方式主要是帶毒蔗種[26],主栽品種種莖的SCWL 陽性檢出率均在90%以上[27],在田間還存在大青葉蟬和條紋平冠沫蟬自然傳播,準確選擇無病健康蔗株作種苗和有效防控蟲媒介體尤為重要。建立甘蔗無病健康種苗繁育基地,加強甘蔗白葉病監(jiān)測,及時銷毀病株,病田避免宿根連作;同時,從切斷植原體自然傳播途徑入手,及時殺滅蔗園中的葉蟬等昆蟲傳播介體。