許可 馬冠英 張志剛

胃癌在我國是常見的消化道惡性腫瘤之一,死亡率較高,患者預(yù)后較差［1］。有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明,胃癌患者術(shù)后5 年生存率不到1/3［2］。miRNA 是一類非編碼小RNA,參與癌癥發(fā)展過程中的許多重要環(huán)節(jié)［3,4］。本研究探索miR-19a-3p 與胃癌之間的相關(guān)性,旨在為胃癌的診療提供新的思路及理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019 年10 月～2020 年10 月因胃惡性腫瘤就診于滄州市人民醫(yī)院,并經(jīng)外科手術(shù)后病理結(jié)果提示為胃腺癌的24例患者,其中男14例,女10 例,中位年齡68 歲。所有患者均可查到完整的臨床病理資料,包括性別、年齡、病史等。以癌灶處的組織為胃癌組織,距離癌灶5 cm 以上的胃組織為正常胃組織。

1.2 材料與試劑 PTEN 抗體試劑(上海杰浩生物技術(shù)有限公司)、miRNeasy 石蠟組織核酸純化試劑盒(QIAGEN)、miRCURY LNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(QIAGEN Sciences)、miRCURY LNA SYBR Green 染料法PCR檢測試劑盒(QIAGEN Sciences)、miR-19a-3p 引物：miRCURY miRNA PCR 引物(QIAGEN Science)。

1.3 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 將手術(shù)后的胃癌組織及正常胃組織標(biāo)本制備成蠟塊,miR-19a-3p 的提取使用5 μm 厚度的蠟卷2 片。PTEN 免疫組化染色使用白片1 張。

1.4 miR-19a-3p 的提取 將蠟卷用二甲苯及無水乙醇脫蠟后,使用miRNeasy 石蠟組織核酸純化試劑盒進(jìn)行miRNA 的提取及純化,將模板RNA 稀釋至5 ng/μl,按照說明書要求,在EP 管中按照如下要求配置逆轉(zhuǎn)錄體系：2 μl 5x miRCURY STBR Green RT Reaction Buffer,4.5 μl RNase-free water,1 μl 10x miRCURY RT Enzyme Mix,0.5 μl UniSp6 RNA spike-in,然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.5 qRT-PCR 檢測miR-19a-3p 的表達(dá)情況 按照1∶60 的倍數(shù),將590 μl 的RNaes-free 水加入到上一步中得到的cDNA 中,進(jìn)行稀釋。然后按照如下要求配置擴(kuò)增體系：5 μl 2x miRCURY SYBR Green Master Mix,1 μl RNaes-free水,1 μl miR-19a-3p PCR引物,3 μl稀釋后的cDNA模板。配置好后置于8聯(lián)管中,離心,放置于PCR 儀上,按如下步驟設(shè)置PCR 程序：95℃2 min,95℃ 10 s,56℃ 60 s(收集熒光信號),循環(huán)數(shù)40個(gè)。本實(shí)驗(yàn)采用的內(nèi)參為U6,用以計(jì)算miR-19a-3p 的相對表達(dá)量。miR-19a-3p 引物由凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司設(shè)計(jì)及合成(貨號：339306)。使用ΔCt 計(jì)算miR-19a-3p 表達(dá)量的相對值,即2-△△Ct。

1.6 PTEN免疫組化染色 使用Roche Hotline羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司免疫組化機(jī)進(jìn)行染色,染色結(jié)果由兩名高年資病理醫(yī)師進(jìn)行判讀,有疑問者請主任醫(yī)師會(huì)診。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-19a-3p 表達(dá)情況 采用qRT-PCR 檢測miR-19-3p 的表達(dá)情況,結(jié)果顯示：miR-19a-3p 在胃癌組織中表達(dá)量高于正常胃組織。見圖1。

圖1 miR-19a-3p 在胃癌及正常胃組織中的表達(dá)情況

2.2 臨床相關(guān)參數(shù)與miR-19a-3p 高表達(dá)的關(guān)系分析腫瘤最大徑＞50 mm、年齡≥66 歲、男性、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移均不是影響miR-19a-3p 高表達(dá)的單因素,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1,圖2,圖3。

圖2 miR-19a-3p 表達(dá)情況與胃癌分級的關(guān)系(引用自UALCAN 數(shù)據(jù)庫：http://ualcan.path.uab.edu//cgi-bin/ualcan-res-mir.pl)

圖3 Kaplan-Meier 生存曲線(引用自http://kmplot.com/analysis/index.php? P=service&cancer=pancancer_mirna)

表1 臨床相關(guān)參數(shù)與miR-19a-3p 高表達(dá)的關(guān)系分析(n)

2.3 PTEN 免疫組化染色結(jié)果 PTEN 免疫組化染色結(jié)果：陰性與背景色顏色一致,弱陽性時(shí)呈棕色,較背景色稍深,中陽呈中等棕褐色,強(qiáng)陽呈棕褐色。本實(shí)驗(yàn)PTEN 免疫組化染色結(jié)果提示：低分化胃癌明顯呈弱陽或陰性,中-高分化胃癌及正常胃組織呈中陽或強(qiáng)陽性,提示胃癌分化程度越低,PTEN染色越呈陰性。見圖4。

圖4 PTEN 免疫組化染色

2.4 PTEN 免疫組化染色結(jié)果與miR-19a-3p 高表達(dá)的關(guān)系 在低分化胃癌中,miR-19a-3p 高表達(dá)且PTEN 免疫組化染色為陰性7 例,陽性2 例,miR-19a-3p 低表達(dá)且PTEN 免疫組化染色為陰性者0 例,陽性者4 例。結(jié)果顯示：miR-19a-3p 在胃癌組織中高表達(dá),而胃癌分化越差,PTEN 免疫組化染色越呈陰性。

3 討論

隨著醫(yī)療技術(shù)和醫(yī)療手段的迅速發(fā)展,胃癌的治療效果及患者的生存質(zhì)量有了很大的提高,血液中的腫瘤標(biāo)記物的等指標(biāo)有了明顯降低［5］。通過本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-19a-3p在胃癌組織中表達(dá)高于正常胃組織,但其表達(dá)量與臨床相關(guān)參數(shù)無顯著相關(guān),因此并未得到miR-19a-3p 可能作為胃癌診斷的生物學(xué)標(biāo)記物的可靠證據(jù)。

miRNA 在人體中廣泛表達(dá),參與癌癥發(fā)展的多個(gè)進(jìn)程［6］,是近年來的一大研究熱點(diǎn)。多種研究表明,不同種類的miRNA 在胃癌中表達(dá)上調(diào)或下調(diào),從而影響胃癌的疾病進(jìn)程,如miR-214［7］,miR-301［8］,miR-1301［9］,miR-335［10］等。miRNA 也在多種腫瘤性及非腫瘤性疾病中起作用,如食管癌［11］,宮頸癌［12］,阿爾茲海默癥［13］等。miRNA 作用廣泛,可與其他種類非編碼RNA 共同調(diào)節(jié)人體的生物學(xué)機(jī)能［14］。

PTEN 基因是人體內(nèi)除了P53 以外存在最為廣泛的抑癌基因,其活性的喪失可能與多種癌癥的發(fā)生相關(guān)［15］。PTEN 基因與惡性腫瘤的預(yù)后及復(fù)發(fā)也有一定的相關(guān)性［16］。而miRNA 可通過多種機(jī)制,如PTEN/PI3K/AKT 通路或直接與PTEN 結(jié)合,從而使PTEN 基因上調(diào)或下調(diào),進(jìn)而抑制或促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生［17］。

由于2019年新冠疫情的爆發(fā),給標(biāo)本收集帶來了一定的難度,致使本次實(shí)驗(yàn)收集的標(biāo)本數(shù)量較少,地域相對集中,實(shí)驗(yàn)結(jié)果的個(gè)體差異性較大。對于miR-19a-3p 及PTEN 基因在胃癌中作用機(jī)制的研究并未得到明確的發(fā)現(xiàn)及證實(shí),后續(xù)將進(jìn)一步增加樣本量,繼續(xù)探討miR-19a-3p 及PTEN 基因與胃癌的關(guān)系,以及二者聯(lián)合作為診斷胃癌的分子標(biāo)記物及治療靶點(diǎn)的可能性。