周凱，劉超，孔寧，衣啟麟，楊傳燕

(大連海洋大學(xué) 遼寧省海洋動物免疫學(xué)重點實驗室，遼寧省海洋動物免疫學(xué)與疫病防控重點實驗室，大連市水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控重點實驗室，遼寧 大連 116023)

蝦夷扇貝Patinopectenyessoensis屬大型冷水性貝類，廣泛分布于日本北海道和本州北部海域、俄羅斯遠(yuǎn)東海域及朝鮮半島海域。自20世紀(jì)80年代引入中國以來，已成為中國北方沿海尤其是遼寧省重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類之一，為中國的海水養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益[1]。浮筏養(yǎng)殖和底播增殖是蝦夷扇貝的兩種主要養(yǎng)殖方式，其中，浮筏養(yǎng)殖扇貝個體由于受到網(wǎng)籠的保護(hù)，貝殼相對輕薄，附著物少，在適宜水層生長快，出肉率較同期底播貝高，經(jīng)濟(jì)效益更好[1]。但近年來受到種質(zhì)、環(huán)境病原及養(yǎng)殖模式等諸多因素影響，浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝年產(chǎn)量不穩(wěn)定，經(jīng)濟(jì)效益年際波動巨大[2]。因此，探究浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝產(chǎn)量年際波動的原因具有重要的現(xiàn)實意義。

雙殼貝類的生長、存活及病害發(fā)生受到環(huán)境因素和自身生理機(jī)能等綜合作用的影響[3]。海水溫度和溶解氧含量能夠通過調(diào)節(jié)貝類能量代謝及免疫相關(guān)蛋白的活性來影響扇貝的生長、存活等生產(chǎn)性狀[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，一定范圍內(nèi)的海水溫度升高會促進(jìn)貝類的生長，但劇烈的升溫會造成氧化應(yīng)激脅迫，降低機(jī)體免疫防御能力，影響貝類正常的生長發(fā)育及能量代謝過程，進(jìn)而導(dǎo)致貝類大規(guī)模死亡[6-7]。與海水溫度升高相對應(yīng)的是海水溶解氧含量的降低[8]，這會降低水生生物的呼吸代謝速率[9]，使其呼吸方式由有氧呼吸轉(zhuǎn)為無氧呼吸[10]，耐受不利環(huán)境的能力下降[8]，進(jìn)而對其生長、存活產(chǎn)生不利影響。高溫低氧等環(huán)境脅迫因子會提高貝類呼吸代謝過程中產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量，過量的ROS引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，對有機(jī)體脂類等大分子造成嚴(yán)重?fù)p傷[11-12]。

貝類能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等防御性分子來防止過量ROS對機(jī)體造成的損傷[13-14]。糖原是貝類進(jìn)行各種生命活動的主要供能物質(zhì)，其有效的代謝調(diào)控是貝類應(yīng)對高溫、低氧等不利環(huán)境條件的重要機(jī)制[15-16]。Samain等[17]研究表明，高糖原含量的牡蠣Crasostreagigas在夏季高溫期的死亡率較糖原含量較低的牡蠣顯著降低。由此推測，高溫低氧會引起貝類發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)糖原代謝產(chǎn)生的能量在生長及應(yīng)激反應(yīng)之間的重新分配，造成生長、存活等正常生理功能所需要能量的供應(yīng)不足，從而引起貝類死亡[18]。

基于以上假設(shè)，本研究中比較了2017年和2018年長?？h浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝生產(chǎn)性狀之間的差異，并從環(huán)境因子、能量代謝水平和免疫防御能力三方面解釋產(chǎn)生這種差異的原因，以期為浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝病害預(yù)警預(yù)報系統(tǒng)的建立和健康養(yǎng)殖提供數(shù)據(jù)支撐和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查站位

分別于2017年(3月25日、5月20日、6月20日和7月20日)和2018年(3月29日、5月20日、6月20日和7月20日)對長?？h浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝進(jìn)行每年4次調(diào)查，所取扇貝為同齡扇貝。調(diào)查站點位于大連市長海縣小長山島鎮(zhèn)東北方向蝦夷扇貝浮筏養(yǎng)殖海區(qū)(39°17′23″N、122°44′18″E)。調(diào)查站位距離海岸線約9 km，水深為15～20 m(圖1)。

圖1 2017年和2018年扇貝養(yǎng)殖調(diào)查站位Fig.1 Sampling sites of the surveys conducted in 2017 and 2018

1.2 方法

1.2.1 環(huán)境指標(biāo)的檢測 在調(diào)查站位使用YSI多參數(shù)水質(zhì)分析儀(550A-12)現(xiàn)場測定海水溫度和溶解氧(DO)含量。將YSI探頭浸入表層水下4 m，待示數(shù)穩(wěn)定后記錄溫度和溶解氧數(shù)據(jù)，重復(fù)測量4次，計算其平均值。

1.2.2 生產(chǎn)性狀指標(biāo)的測定與計算 在調(diào)查站位隨機(jī)抽取2籠浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝，從中隨機(jī)選取50只存活蝦夷扇貝置于冰袋之上帶回實驗室，分別使用游標(biāo)卡尺和電子天平測量其殼長(L，精確到0.01 mm)和體質(zhì)量(W1，精確到0.01 g)。解剖獲得其殼、閉殼肌、性腺、鰓和其余組織，在60 ℃下烘干72 h待其達(dá)到恒重后，使用電子天平分別稱量其質(zhì)量，記為W2、W3、W4、W5和W6(精確到0.01 g)。

肥滿度計算公式[19]為

肥滿度=(W3+W4+W5+W6)/W2×1 000。

其中：W2為殼干質(zhì)量(g);W3為閉殼肌干質(zhì)量(g)；W4為性腺干質(zhì)量(g)；W5為鰓干質(zhì)量(g)；W6為其余組織干質(zhì)量(g)。

分別在2017年5月20日和2018年5月20日隨機(jī)選取2籠扇貝，除去其中死亡和患病個體后裝入新的扇貝籠繼續(xù)養(yǎng)殖，分別在同年6月20日和7月20日計數(shù)這2籠扇貝存活、死亡和患病個體數(shù)目，并除去死亡和患病個體后重新裝入新的扇貝籠中繼續(xù)養(yǎng)殖。若存活個體貝殼內(nèi)側(cè)有褐色沉積即被認(rèn)定為患病個體。存活率(%)和患病率(%)計算公式為

患病率=N3/(N1+N2)×100%，

存活率=N1/(N1+N2)×100%。

其中：N1為存活個體數(shù)目；N2為死亡個體數(shù)目；N3為患病個體數(shù)目。

1.2.3 免疫及能量代謝指標(biāo)的檢測 在調(diào)查站位隨機(jī)選取15只健康蝦夷扇貝，解剖收集閉殼肌在液氮中凍存。將每5只扇貝的閉殼肌等質(zhì)量混合后測定其糖原含量、SOD活性、丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量及HSP70含量。

采用南京建成生物技術(shù)有限公司的相關(guān)試劑盒測定糖原含量、SOD活性和MDA含量，采用上海羽朵生物技術(shù)有限公司的HSP70試劑盒測定HSP70含量。采用蒽銅比色法[20]測定糖原含量，采用黃含量嘌呤氧化酶法[21]測定SOD活性，采用硫代巴比土酸法[22]測定MDA含量，采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法測定HSP70含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用Microsoft Excel 2013軟件和SPSS 19.0 軟件進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)分析。使用獨立樣本T檢驗分析相同月份生產(chǎn)性狀、環(huán)境指標(biāo)及生理指標(biāo)年際間差異的顯著程度。顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦夷扇貝養(yǎng)殖水體環(huán)境指標(biāo)的變化

2017年蝦夷扇貝浮筏養(yǎng)殖海區(qū)水溫分別在3月(3.63 ℃±0.15 ℃)、6月(20.39 ℃±0.20 ℃)和7月(23.83 ℃±0.72 ℃)顯著高于2018年同期(3.17 ℃±0.06 ℃、16.83 ℃±0.06 ℃、22.14 ℃±0.03 ℃)(P<0.05)，而在5月(9.30 ℃±0.10 ℃)則顯著低于2018年同期(10.57 ℃±0.06 ℃)(P<0.05)(圖2(a))。對溶解氧含量而言，2017年除了5月顯著高于2018年5月(P<0.05)外，在其余月份均顯著低于2018年同期(P<0.05)(圖2(b))。

*表示同一月份不同年際間有顯著性差異(P<0.05),下同。Note:*means significant difference between different years in the same month(P<0.05),et sequentia.圖2 2017年和2018年蝦夷扇貝養(yǎng)殖海區(qū)水溫和溶解氧含量的變化Fig.2 Variation in the sea water temperature and dissolved oxygen concentration in Yesso scallop culture area in 2017 and 2018

2.2 蝦夷扇貝生長性狀的變化

從表1可見：在3、5月，浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝殼長的年際間無顯著性差異(P>0.05)；在2018年6、7月，蝦夷扇貝的殼長分別為2017年同期的104.4%、109.2%，年際間有顯著性差異(P<0.05)；在2018年3月，蝦夷扇貝的體質(zhì)量顯著低于2017年同期(P<0.05)，而在7月蝦夷扇貝的體質(zhì)量則顯著高于2017年同期(P<0.05)；在2018年5、6、7月，蝦夷扇貝的肥滿度顯著高于2017年同期(P<0.05)，而在3月，蝦夷扇貝肥滿度的年際間無顯著性差異(P>0.05)。

表1 2017年和2018年浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝殼長、體質(zhì)量及肥滿度的變化Tab.1 Variation in shell length,body weight and condition factor of Yesso scallop farmed in raft in 2017 and 2018

2.3 蝦夷扇貝能量和免疫代謝指標(biāo)的變化

2.3.1 糖原含量、SOD活性及MDA含量的變化

從表2可見：在2017年3、6月，蝦夷扇貝閉殼肌中的糖原含量顯著低于2018年同期(P<0.05)，而在5、7月，閉殼肌中糖原含量年際間無顯著性差異(P>0.05)；在2017年3、6、7月，蝦夷扇貝閉殼肌中的SOD活性顯著高于2018年同期(P<0.05)，而在5月，閉殼肌中SOD活性年際間無顯著性差異(P>0.05)；在2017年5、6月，蝦夷扇貝閉殼肌中的MDA含量顯著高于2018年同期，而在3、7月則顯著低于2018年同期(P<0.05)。

表2 2017年和2018年浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝閉殼肌中糖原含量、SOD活性及MDA含量的變化Tab.2 Variation in glycogen content,SOD activity and MDA content of adductor muscle in Yesso scallop farmed in raft in 2017 and 2018

2.3.2 HSP70含量的變化 從圖3可見，在2017年3、5、6月，浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝閉殼肌中的HSP70含量分別為(7.98±1.02)、(3.52±0.45)、(7.27±0.39)ng/g prot，顯著高于2018年同期(P<0.05)，2018年3、5、6月分別為(1.01±0.30)、(2.38±0.10)、(3.40±0.07)ng/g prot，而在7月,HSP70含量則顯著低于2018年同期(P<0.05)。

圖3 2017年和2018年浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝閉殼肌中HSP70含量的變化Fig.3 Variation in HSP70 content of adductor muscle in Yesso scallop farmed in raft in 2017 and 2018

2.4 蝦夷扇貝存活率和患病率的變化

從表3可見，2017年5—6月和6—7月，浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝存活率顯著低于2018年同期(P<0.05)，而扇貝患病率則顯著高于2018年同期(P<0.05)。

表3 2017年和2018年浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝存活率和患病率的差異Tab.3 Variation in survive rate and morbidity rate of Yesso scallop farmed in raft in 2017 and 2018

3 討論

3.1 環(huán)境因子對扇貝生長、存活的影響

貝類生長、存活等生產(chǎn)性狀受到環(huán)境因子與自身生理機(jī)能綜合作用的影響[23]。本研究中比較了2017年與2018年相同月份間水溫、溶解氧等環(huán)境因素，以及蝦夷扇貝能量代謝、免疫相關(guān)酶活性的變化情況，以期尋找不同年份間蝦夷扇貝生產(chǎn)性狀波動的原因。結(jié)果表明，浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝的殼長、體質(zhì)量等生產(chǎn)性狀在2018年顯著優(yōu)于2017年，同時在高溫期(6月和7月)，2018年浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝的存活率顯著高于2017年，患病率則顯著降低，因此，2018年浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝的生產(chǎn)狀況明顯優(yōu)于2017年。

海水溫度及溶解氧含量是影響貝類生長、存活等生產(chǎn)性狀的重要環(huán)境因子[4-5]。作為一種冷水性貝類，蝦夷扇貝的生長適溫范圍為5～20 ℃，最適水溫約為15 ℃[24]。多項研究表明，海水溫度是影響蝦夷扇貝能量代謝和存活的重要因素[25]。本研究中，2018年5、6、7月，養(yǎng)殖海區(qū)水溫較2017年同期更接近于15 ℃，更有利于浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝的生長、存活。特別是2017年7月，養(yǎng)殖海區(qū)水溫達(dá)到(23.83±0.75)℃,顯著高于蝦夷扇貝生長適溫范圍，從而導(dǎo)致其生長、存活等受到嚴(yán)重影響。與海水溫度相似，溶解氧含量對蝦夷扇貝呼吸代謝的速率具有重要影響[26]。在2018年3、6、7月，養(yǎng)殖海區(qū)溶解氧含量顯著高于2017年同期，從而為蝦夷扇貝的有氧呼吸提供了充足的氧氣供應(yīng)，有利于蝦夷扇貝殼長、體質(zhì)量和存活率的提高。在2017年6、7月，浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝的弧菌病患病率顯著高于2018年。已有研究表明，海洋動物細(xì)菌性疾病的發(fā)生是不利環(huán)境因素導(dǎo)致的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)失衡，致病性微生物大量繁殖并入侵宿主的結(jié)果[27-28]。本實驗室未發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示，2018年6、7月蝦夷扇貝養(yǎng)殖海區(qū)致病性弧菌的豐度顯著低于2017年同期。由此推斷，2017年6、7月養(yǎng)殖海區(qū)高溫低氧的環(huán)境導(dǎo)致其致病性弧菌的暴發(fā)，進(jìn)而造成了2017年蝦夷扇貝患病率顯著高于2018年同期。

綜上，2018年浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝的生長態(tài)勢明顯優(yōu)于2017年同期，這可能與2018年適宜的水溫、較高的溶解氧含量等有利的環(huán)境條件密切相關(guān)。

3.2 生理狀態(tài)對扇貝生長、存活的影響

糖原是生物體內(nèi)重要的營養(yǎng)物質(zhì)，在有機(jī)體的多種生命活動中發(fā)揮著重要作用，可從能量和物質(zhì)供應(yīng)兩方面為扇貝的生長提供保障，對貝類的生長具有重要的促進(jìn)作用[29]。有研究表明，三倍體牡蠣(糖原含量為21.2 g/100 g干質(zhì)量)在繁殖季節(jié)的殼長和體質(zhì)量分別是二倍體牡蠣(糖原含量為14.5 g/100 g干質(zhì)量)的1.2倍和1.9倍[30]。由此推測，本研究中2018年蝦夷扇貝殼長和體質(zhì)量顯著高于2017年同期的一個重要原因是2018年3、6月較2017年同期具有較高的糖原含量。在糖原的分解代謝為扇貝生長和免疫反應(yīng)提供總能量一定的前提下，免疫反應(yīng)的增強(qiáng)會降低供生長利用的能量比例[31-32]。

SOD是消除ROS最重要的酶之一，HSP70是HSP蛋白家族對熱應(yīng)激最敏感的蛋白，而MDA含量被認(rèn)為是反映脂類損傷程度的重要指標(biāo)。在機(jī)體能維持正常應(yīng)激生理功能的前提下，HSP70和MDA 含量升高代表著機(jī)體受到熱應(yīng)激和氧化損傷程度升高，而SOD活性升高提示機(jī)體內(nèi)存在大量ROS需要清除。本研究中，通過測定蝦夷扇貝閉殼肌中的SOD活性、HSP70含量及MDA含量，來反映免疫反應(yīng)強(qiáng)度及高溫等環(huán)境因素對其生物大分子損傷的程度。2017年各月份蝦夷扇貝閉殼肌中SOD活性顯著高于2018年同期，提示其對ROS的清除作用更強(qiáng)，免疫反應(yīng)強(qiáng)度更強(qiáng)。MDA作為脂質(zhì)過氧化損傷的產(chǎn)物，本研究中在2017年5、6月蝦夷扇貝閉殼肌中的MDA含量顯著高于2018年同期，這表明2018年5、6月蝦夷扇貝閉殼肌脂質(zhì)受到氧化損傷的程度顯著高于2018年同期。而在2018年7月，閉殼肌MDA含量顯著低于2018年同期，原因可能是2017年7月的高溫、低氧及弧菌病等因素導(dǎo)致蝦夷扇貝處于瀕死狀態(tài)，產(chǎn)生MDA的能力下降。2018年7月蝦夷扇貝閉殼肌MDA含量較2018年5、6月顯著升高，這表明2018年7月蝦夷扇貝受到的氧化損傷愈發(fā)嚴(yán)重。

高溫及低氧等環(huán)境條件下，生物體內(nèi)HSP70含量會升高以修復(fù)或者清除過量ROS損傷的蛋白質(zhì)[33]。本研究中，2017年3月—6月蝦夷扇貝閉殼肌中HSP70含量顯著高于2018年同期，推測2017年蝦夷扇貝閉殼肌免疫反應(yīng)強(qiáng)度更強(qiáng)，免疫反應(yīng)對能量的需求量更大。而2017年7月閉殼肌中HSP70含量顯著低于2018年，推測可能是2017年7月持續(xù)高溫已經(jīng)嚴(yán)重影響了蝦夷扇貝表達(dá)HSP70的能力，導(dǎo)致此時的蝦夷扇貝可能已經(jīng)處于瀕死狀態(tài)。這一推測與前面SOD 活性和MDA含量的結(jié)果相對應(yīng)，也可由2017年7月蝦夷扇貝的死亡率、患病率等指標(biāo)得到驗證。2017年5—7月和6—7月，蝦夷扇貝的存活率分別為79.18%±1.31%和65.87%±1.37%，患病率分別為3.55%±1.52%和65.22%±1.42%，這說明蝦夷扇貝的生理狀態(tài)不佳，蝦夷扇貝的正?？寡趸瘷C(jī)能受到嚴(yán)重影響，以至于受到高溫刺激后HSP70和MDA含量均不能再升高甚至出現(xiàn)下降的趨勢。當(dāng)然這些只是作者的推測，后續(xù)將會尋找新的證據(jù)來證明這種推測。根據(jù)本部分結(jié)果，作者認(rèn)為MDA及HSP70含量可以作為評價浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝健康狀態(tài)的重要指標(biāo)。

綜上，本研究中比較了2017年與2018年3、5、6、7月大連市長?？h浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝生長和存活等指標(biāo)之間的差異，并從環(huán)境和生理指標(biāo)等方面解析了這些差異出現(xiàn)的原因。研究結(jié)果表明，適宜的環(huán)境因素對浮筏養(yǎng)殖扇貝的健康生長具有重要的促進(jìn)作用。適宜的水溫、溶解氧能夠顯著提高蝦夷扇貝閉殼肌中糖原含量，亦不會造成扇貝機(jī)體強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，從而使其正常生理活動能夠獲得更充足的能量和物質(zhì)供應(yīng)，進(jìn)一步降低患病率，提高扇貝存活率。該研究結(jié)果將為長?？h和其他相似海區(qū)浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝的病害預(yù)警預(yù)報及健康養(yǎng)殖，提供一定的數(shù)據(jù)支撐和理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

1)2018年長?？h浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝的生長、存活等性狀顯著優(yōu)于2017年同期。

2)MDA及HSP70含量可以作為評價浮筏養(yǎng)殖蝦夷扇貝健康狀態(tài)的重要指標(biāo)，若與存活率、發(fā)病率等指標(biāo)結(jié)合，則具有更有效的評價意義。

3)適宜的水溫、較高的溶解氧含量等有利的環(huán)境條件有助于降低患病率，提高扇貝存活率。