王藝儒，索玉靜，傅建敏

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究所，經(jīng)濟(jì)林種質(zhì)創(chuàng)新與利用國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南 鄭州450003)

柿(DiospyroskakiThunb.)為柿科(Ebenaceae)柿屬(Diospyros)植物，有“木本糧食”之稱[1]。中國(guó)甜柿是我國(guó)原產(chǎn)完全甜柿(PCNA)的統(tǒng)稱，在果實(shí)硬食期即可自然脫澀，其自然脫澀機(jī)理以單寧的凝固效應(yīng)為主。中國(guó)甜柿與日本甜柿各自獨(dú)立起源，日本甜柿自然脫澀性狀受隱性單基因控制，而中國(guó)甜柿自然脫澀性狀呈顯性遺傳的特點(diǎn)，該特點(diǎn)使其在雜交育種中較日本甜柿更具潛力[2]。開(kāi)展雜交育種是獲得甜柿新種質(zhì)的重要手段，但對(duì)于柿育種而言，較長(zhǎng)的童期增加了育種成本，因此有必要開(kāi)發(fā)有效的分子標(biāo)記，在育苗階段將完全甜柿篩選出來(lái)，以節(jié)約時(shí)間和成本，提高種質(zhì)創(chuàng)新與育種效率。目前柿屬植物中僅有針對(duì)二倍體柿近緣種油柿和君遷子基因組的報(bào)道[3-5]，而對(duì)六倍體柿基因組的研究缺乏，這在一定程度上限制了柿重要性狀的分子輔助育種進(jìn)程。

DNA分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)對(duì)植物分子遺傳育種具有重要意義，因?yàn)榉肿訕?biāo)記具有穩(wěn)定遺傳、不受取材部位限制和不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)[6]。目前，分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析[7-8]、遺傳圖譜構(gòu)建[9]、基因定位[10]、分子標(biāo)記輔助育種[11]和品種純度鑒定[12]等研究中。在柿屬植物中報(bào)道過(guò)利用核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的氨基酸序列信息[13]、富集CT/AG的基因組文庫(kù)[14]和NCBI上的柿屬EST序列[15]開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)引物，但SSR引物數(shù)目較少。隨著轉(zhuǎn)錄組的發(fā)展，杜改改等[16]、張曉娜等[17]分別以‘禪寺丸’柿雌雄花芽和君遷子不同單株葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)其SSR和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位點(diǎn)進(jìn)行分析，一定程度上豐富了柿屬植物SSR和SNP的引物來(lái)源。

目前柿屬植物SSR分子標(biāo)記可用于品種鑒定的位點(diǎn)仍然偏少，而SNP和插入/缺失多態(tài)性(insenion-deletion，InDel)分子標(biāo)記尚未應(yīng)用于柿屬植物研究中，可用于鑒別中國(guó)甜柿的引物則更為缺乏。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法為尚無(wú)基因組的非模式物種基因功能及分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了便利[18]。本研究對(duì)中國(guó)甜柿品種小果甜柿5個(gè)發(fā)育期的果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR、SNP和InDel位點(diǎn)分析，以豐富中國(guó)甜柿的SSR、SNP及InDel數(shù)據(jù)，為開(kāi)發(fā)中國(guó)甜柿特異性分子標(biāo)記、品種早期鑒定和遺傳多樣性分析提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料為種植于中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究所原陽(yáng)基地(34°55′18″ N～34°56′27″ N，113°46′14″ E～113°47′35″ E)的中國(guó)甜柿傳統(tǒng)小果類型種質(zhì)(文中統(tǒng)稱為小果甜柿)。由于中國(guó)甜柿自然脫澀時(shí)間較晚，根據(jù)Guan等[19]建立的柿不同發(fā)育期描述規(guī)范，分別于果實(shí)生長(zhǎng)到最終大小的40%階段(07-24，花后70 d)、50%階段(08-24，花后100 d)和70%階段(09-14，花后120 d)及果實(shí)成熟期著色階段(10-04，花后140 d)、果實(shí)開(kāi)始成熟階段(10-24，花后160 d)采樣，共采樣5次，最后一次采樣時(shí)已完全脫澀。采集大小一致、無(wú)機(jī)械損傷及病蟲(chóng)害的柿果，迅速取3個(gè)果的赤道部果肉液氮速凍，作為1次生物學(xué)重復(fù)，共3次重復(fù)。

1.2 柿果總RNA的提取

使用UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(B511321，上海生工)對(duì)小果甜柿各時(shí)期果實(shí)的總RNA進(jìn)行提取，用Merinton SMA4000紫外可見(jiàn)微量分光光度計(jì)和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量和完整性。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)組裝

總RNA質(zhì)量檢測(cè)合格后，委托北京諾禾致源構(gòu)建cDNA文庫(kù)并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。cDNA文庫(kù)質(zhì)檢合格后進(jìn)行Illumina測(cè)序，采用Trinity拼接獲得transcripts，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行Corset層次聚類，挑選其中最長(zhǎng)的一條參考序列unigene作為后續(xù)分析用。

1.4 SSR、SNP和InDel的分析方法

采用MISA軟件的默認(rèn)參數(shù)(https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/)對(duì)SSR位點(diǎn)進(jìn)行搜索，過(guò)濾掉單堿基類型SSR重復(fù)數(shù)<10、雙堿基類型重復(fù)數(shù)<6和三、四、五、六堿基類型重復(fù)數(shù)<5的SSR，分析各類型SSR重復(fù)基元的位點(diǎn)數(shù)、出現(xiàn)頻率、平均分布距離及其優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元、重復(fù)次數(shù)、序列長(zhǎng)度的分布特征。用軟件GATK3進(jìn)行SNP Calling和InDel Calling，過(guò)濾掉質(zhì)量值<40和距離<2的SNP及InDel，分析其位點(diǎn)類型、數(shù)量、發(fā)生頻率及位點(diǎn)數(shù)目分布特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 小果甜柿果實(shí)的總RNA質(zhì)量檢測(cè)

小果甜柿果實(shí)5個(gè)發(fā)育時(shí)期總RNA在1.5%瓊脂糖凝膠中的電泳結(jié)果如圖1所示，28S及18S條帶明亮且亮度比為2∶1，說(shuō)明RNA完整性合格；A260/A280均大于1.8(表1)，即RNA純度較高;表明RNA完整性、純度及質(zhì)量濃度均滿足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序要求，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1-1表示果實(shí)第1個(gè)發(fā)育期的第1個(gè)重復(fù)，其他依此類推

表1 小果甜柿果實(shí)的RNA純度及質(zhì)量濃度

2.2 小果甜柿轉(zhuǎn)錄組信息及SSR位點(diǎn)的數(shù)量

對(duì)小果甜柿果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，將 Trinity 拼接得到的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行Corset層次聚類,以得到最長(zhǎng)的Cluster序列，結(jié)果共獲得85 432條unigenes，含93 435 470個(gè)核苷酸，序列長(zhǎng)度介于301～16 015 bp，unigenes平均長(zhǎng)度為1 094 bp，將拼接轉(zhuǎn)錄本從長(zhǎng)到短排序，N50(累計(jì)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度不小于總長(zhǎng)50%時(shí)的長(zhǎng)度)為1 704 bp。運(yùn)用MISA軟件對(duì)全部unigenes進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)有42 427個(gè)SSR位點(diǎn)分布于26 928條unigenes上，發(fā)生頻率為31.52%，SSR位點(diǎn)的平均分布密度為0.45個(gè)/kb。其中有9 273條unigenes序列中含1個(gè)以上SSR位點(diǎn)，1 726條unigenes序列中含有復(fù)合型SSR位點(diǎn)。據(jù)此認(rèn)為小果甜柿轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點(diǎn)分布廣泛、位點(diǎn)豐富。

2.3 小果甜柿果實(shí)轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的重復(fù)基元類型與統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)小果甜柿轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點(diǎn)各堿基重復(fù)基元類型的數(shù)量及比例等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果(表2)顯示，SSR重復(fù)基元類型豐富，從單堿基到六堿基重復(fù)均有分布，但不同重復(fù)基元類型的SSR位點(diǎn)數(shù)目有較大差異，表現(xiàn)出隨重復(fù)基元類型的堿基數(shù)增多SSR序列數(shù)量減少的趨勢(shì)；以單堿基重復(fù)的SSR位點(diǎn)數(shù)量最多，含18 805個(gè)SSR位點(diǎn)；六堿基重復(fù)的SSR位點(diǎn)數(shù)最少，為130個(gè)；單堿基和六堿基重復(fù)SSR位點(diǎn)數(shù)分別占轉(zhuǎn)錄組總SSR位點(diǎn)數(shù)的44.32%和0.31%，2種類型在轉(zhuǎn)錄組unigenes中的出現(xiàn)頻率分別為22.01%和0.15%。單堿基重復(fù)的SSR平均分布距離最小，為4.54 bp；而六堿基重復(fù)的SSR平均分布距離最大，高達(dá) 657.17 bp。

表2 小果甜柿轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)基元類型及其基本統(tǒng)計(jì)信息

2.4 小果甜柿轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元的分布特征

對(duì)小果甜柿轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)基元數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)頻率最高的5類基元分別為A/T(17 356，占總SSR的比例為40.91%)、AG/CT(10 224，占比24.10%)、AT/AT(4 874，占比11.49%)、AC/GT(2 247，占比5.30%)和AAG/CTT(1 980，占比4.67%)(圖2)。分析不同SSR基序重復(fù)基元類型優(yōu)勢(shì)堿基的出現(xiàn)頻數(shù)表明，小果甜柿全部SSR位點(diǎn)共包含159種重復(fù)基元，單堿基重復(fù)至六堿基重復(fù)分別包含2，4，10，28，38和77類基元。其中，單堿基重復(fù)以A/T基元類型占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；雙堿基重復(fù)的優(yōu)勢(shì)基元類型為AG/CT；三堿基重復(fù)的優(yōu)勢(shì)基元類型為AAG/CTT；四堿基重復(fù)的優(yōu)勢(shì)基元類型為AAAG/CTTT(共123個(gè)，占比0.29%)；五堿基重復(fù)和六堿基重復(fù)的基元類型較多但數(shù)量少，優(yōu)勢(shì)基元類型分別為AAAAG/CTTTT(共27個(gè)，占比0.06%)和AAAAAG/CTTTTT(共16個(gè)，占比0.04%)。此外，在SSR位點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)了101個(gè)高等植物中少見(jiàn)的CG/CG重復(fù)基元和331個(gè)在雙子葉植物中不常見(jiàn)的CCG/CGG重復(fù)基元，分別占比0.24%和0.78%。

圖2 小果甜柿轉(zhuǎn)錄組中不同重復(fù)基元類型的SSR位點(diǎn)分布

2.5 小果甜柿轉(zhuǎn)錄組各基元類型重復(fù)次數(shù)分析

對(duì)小果甜柿轉(zhuǎn)錄組不同基元類型的重復(fù)次數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。由表3可知，從單堿基至六堿基重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)主要集中于5～20次，占總SSR位點(diǎn)總數(shù)的97.82%。單堿基和雙堿基重復(fù)SSR在10次及以上的重復(fù)次數(shù)均有分布，三堿基重復(fù)的SSR主要為5～16次重復(fù)，四堿基到六堿基重復(fù)的SSR主要分布在5～8次，并且6種重復(fù)基元類型的SSR數(shù)量均隨著堿基重復(fù)次數(shù)的增大而減小。

表3 小果甜柿轉(zhuǎn)錄組不同重復(fù)基元類型的SSR數(shù)量分布

2.6 小果甜柿轉(zhuǎn)錄組的SSR序列長(zhǎng)度分布

小果甜柿轉(zhuǎn)錄組中不同SSR 重復(fù)基元類型的序列長(zhǎng)度差異較大，介于10～74 bp，平均長(zhǎng)度為16.02 bp。SSR序列長(zhǎng)度差異最大的為單堿基重復(fù)(10～74 bp)，最小的為六堿基重復(fù)(30～54 bp)。如圖3所示，隨著SSR序列長(zhǎng)度的增加，SSR數(shù)量呈下降趨勢(shì)。以長(zhǎng)度為12 bp的SSR數(shù)目最多，為6 007個(gè)，占總SSR數(shù)的14.16%；長(zhǎng)度為29 bp的SSR數(shù)目最少，為24個(gè)，占比0.06%；序列長(zhǎng)度<12 bp的SSR位點(diǎn)數(shù)目為8 284個(gè)，占比19.52%；序列長(zhǎng)度為≥12～<20 bp的SSR位點(diǎn)數(shù)目為24 596個(gè)，占比57.97%；序列長(zhǎng)度≥20 bp的SSR位點(diǎn)數(shù)目為9 547個(gè)，占比22.50%。

圖3 小果甜柿轉(zhuǎn)錄組的SSR長(zhǎng)度分布

2.7 小果甜柿轉(zhuǎn)錄組SNP和InDel的特征分析

從小果甜柿轉(zhuǎn)錄組中共獲取了1 070 614個(gè)SNP位點(diǎn)，發(fā)生頻率為11.46 kb-1(表4)；其中轉(zhuǎn)換類型SNP位點(diǎn)包括C/T(335 486個(gè))和A/G(337 266個(gè))，發(fā)生頻率分別為3.59和3.61 kb-1；顛換類型SNP位點(diǎn)包括A/T(114 228個(gè))、A/C(94 711個(gè))、T/G(95 758個(gè))和C/G(93 165個(gè))，發(fā)生頻率分別為1.22，1.01，1.02和1.00 kb-1。轉(zhuǎn)換類型SNP的發(fā)生頻率遠(yuǎn)高于顛換類型SNP，比值為1.69，其中以C/T最高。共有6 570個(gè)unigenes(7.6%)僅包含1個(gè) SNP位點(diǎn)，含有更多SNP位點(diǎn)的unigenes數(shù)量表現(xiàn)出下降趨勢(shì)(圖4)。

表4 小果甜柿轉(zhuǎn)錄組中SNP位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)分析

在轉(zhuǎn)錄組46 175個(gè)unigenes中獲取了167 924個(gè)InDel位點(diǎn)，平均0.556 kb即出現(xiàn)1個(gè)InDel位點(diǎn)。InDel位點(diǎn)分布與SNP表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，即含有1個(gè)InDel位點(diǎn)的unigenes數(shù)目最多，為14 139個(gè)，占總unigenes數(shù)的16.55%，含有更多InDel位點(diǎn)的unigenes數(shù)量呈下降趨勢(shì)(圖4)。

圖4 小果甜柿轉(zhuǎn)錄組中的SNP和InDel位點(diǎn)分布

3 討 論

小果甜柿不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)轉(zhuǎn)錄組SSR數(shù)目較為豐富，共有42 427個(gè)SSR位點(diǎn)分布在26 928條unigenes上，出現(xiàn)頻率為31.52%，高于柿屬植物君遷子(10.41%)[17]。SSR的平均分布距離為0.45個(gè)/kb，即平均2.22 kb出現(xiàn)1個(gè)SSR位點(diǎn)，分布密度接近柿品種禪寺丸雌雄花芽(0.43個(gè)/kb)，遠(yuǎn)大于君遷子的0.20 個(gè)/kb[17]。這可能與分析方法、物種間差異、測(cè)序深度、拼接質(zhì)量和MISA軟件參數(shù)設(shè)置等相關(guān)[20]。小果甜柿轉(zhuǎn)錄組中豐富的SSR位點(diǎn)對(duì)柿屬植物親緣關(guān)系和遺傳背景的探索具有重要意義。

SSR序列可反映物種進(jìn)化水平，并對(duì)基因功能產(chǎn)生重要的影響[16,21]。本研究中小果甜柿果實(shí)轉(zhuǎn)錄組SSR種類豐富，以單堿基至三堿基為主。單堿基重復(fù)為小果甜柿的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元，其數(shù)量占總SSR位點(diǎn)的44.32%，與已報(bào)道的禪寺丸柿[16]、黑果枸杞[22]和紅松[23]等一致。SSR重復(fù)基元的種類及數(shù)量多，可在一定程度上反映該物種進(jìn)化水平較高[24-25]。小果甜柿的SSR位點(diǎn)中單堿基至三堿基中優(yōu)勢(shì)堿基重復(fù)基元出現(xiàn)頻率最高的分別為A/T、AG/CT和AAG/CTT，與君遷子和禪寺丸柿一致，與其他植物如冬瓜[26]也一致，但與苦楝[27]和大花序桉[28]分別在二和三堿基重復(fù)的優(yōu)勢(shì)堿基不一致，這可能與物種特異性或搜索條件有關(guān)[16,29]。此外，在小果甜柿SSR位點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)了101個(gè)高等植物中少見(jiàn)的 CG/CG 重復(fù)基元，其數(shù)量遠(yuǎn)高于黑果枸杞[22](5個(gè))、杜仲[29](1個(gè))和短絲木犀[30](13個(gè))。還發(fā)現(xiàn)了331個(gè)單子葉植物常見(jiàn)而雙子葉植物中不常見(jiàn)的 CCG/CGG 重復(fù)基元，這些重復(fù)基元的出現(xiàn)可能具有代謝調(diào)控、抗逆性和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理功能。

多態(tài)性是SSR的一個(gè)重要考察指標(biāo)[31]。SSR基元重復(fù)次數(shù)與序列長(zhǎng)度影響SSR位點(diǎn)的多態(tài)性，長(zhǎng)度≥20 bp時(shí)，多態(tài)性較高[32]。本研究中，小果甜柿SSR序列長(zhǎng)度介于10～74 bp，其中序列長(zhǎng)度為12～20 bp的SSR數(shù)量最多，占比57.97%。單堿基和雙堿基類型基元的重復(fù)次數(shù)最多，可能具有更高的多態(tài)性。序列長(zhǎng)度≥20 bp的SSR位點(diǎn)有9 547個(gè)，占比22.50%，高于禪寺丸柿[16]，這類SSR位點(diǎn)具有潛在較高的多態(tài)性，在后續(xù)鑒別中國(guó)甜柿的SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)中具有較大的應(yīng)用潛力。

SNP和Indel位點(diǎn)在基因組中分布廣泛[33]。本研究從小果甜柿轉(zhuǎn)錄組中共檢測(cè)到1 070 614個(gè)SNP位點(diǎn)，平均每kb出現(xiàn)11.46個(gè)SNP位點(diǎn)；還檢測(cè)到了167 924個(gè)InDel位點(diǎn)，平均0.556 kb出現(xiàn)1個(gè)InDel位點(diǎn)。轉(zhuǎn)換和顛換的SNP位點(diǎn)比例理論上應(yīng)為0.5，而本研究中轉(zhuǎn)換類型與顛換類型SNP比值為1.69，這種現(xiàn)象叫做轉(zhuǎn)換偏差，最先在水稻[34]中有相關(guān)報(bào)道。出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能與進(jìn)化過(guò)程中的選擇相關(guān)，表明轉(zhuǎn)換可能并非隨機(jī)出現(xiàn)的[35]。

柿樹(shù)童期較長(zhǎng)，水肥條件適宜的條件下，最快3年才能夠開(kāi)花結(jié)實(shí)，本研究利用不同發(fā)育時(shí)期小果甜柿果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了SSR、SNP和InDel位點(diǎn)及其特征，為后續(xù)中國(guó)甜柿特異性分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了數(shù)據(jù)及理論基礎(chǔ)，對(duì)中國(guó)甜柿及其雜交后代的早期鑒別具有重要意義。