超臨界CO2流體輔助中性γ-CD-MOF載小白菊內(nèi)酯工藝優(yōu)化與體外釋放評價

郭靜雯,何遠志,張永太,馮年平

(上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,上海 201203)

小白菊內(nèi)酯(Parthenolide,PTL)是一種天然倍半萜內(nèi)酯,主要提取自菊科、雛菊科、木蘭科植物,可從小白菊(Tanacetumparthenium)中大量提取[1]。小白菊作為傳統(tǒng)中草藥,可用于驅(qū)熱、驅(qū)蟲、鎮(zhèn)痛及治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎,PTL為其主要活性成分。PTL結(jié)構(gòu)中的反式α-亞甲基γ-正丁內(nèi)酯環(huán)及環(huán)氧結(jié)構(gòu)可與細胞特定蛋白的親核位點結(jié)合,調(diào)節(jié)細胞生長增殖狀態(tài),為其活性位點[2-3]。近年研究表明PTL單體具有抗血管動脈粥樣硬化、抗炎[4-5]、抑制腫瘤細胞增殖[2,6-8]及逆轉(zhuǎn)耐藥[9-10]等多種藥理活性。但PTL的溶解度和穩(wěn)定性均較差,限制了其作為藥物的開發(fā)應(yīng)用。

金屬有機骨架(Metal-organic frameworks, MOF)為金屬離子通過配位鍵作用與有機配體自組裝形成的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具有高孔隙率及高比表面積,三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可為藥物附著提供充足的空間,提高載藥效率并高效遞藥。作為藥物遞送載體,MOF可增大難溶性藥物的表觀溶解度和溶出速率[11-12],改善藥物生物利用度[13],提高藥物穩(wěn)定性[14],其尺寸與內(nèi)部孔徑的可調(diào)節(jié)性也有望實現(xiàn)藥物的控釋釋放[15],是一種極具潛力的納米載體。如以K+離子與γ-環(huán)糊精(γ-CD)自組裝形成的環(huán)糊精金屬有機骨架(γ-CD-MOF),具有良好的生物相容性[16]。

為除去CD-MOF網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中殘留的反應(yīng)物及有機溶劑,可采用超臨界CO2流體技術(shù)(Supercritical carbon dioxide Fluid,scCO2)置換CD-MOF孔隙內(nèi)雜質(zhì),最大化其載藥空間[17]。scCO2具有液體的優(yōu)良溶解性和氣體的易擴散性[18],使用scCO2流體技術(shù)輔助PTL載入CD-MOF,可加快PTL滲透進入載體的微孔結(jié)構(gòu)中,提升載藥效率[19],同時避免有機溶劑使用,具有良好的安全性。

本研究以K+離子與γ-CD制備γ-CD-MOF,中性化處理得Neu-γ-CD-MOF,作為PTL的載體,改善藥物的溶解性和穩(wěn)定性,優(yōu)化了scCO2法的載藥工藝,并對載PTL的Neu-γ-CD-MOF(PTL@Neu-γ-CD-MOF)進行系統(tǒng)表征,評價載體的體外釋藥行為。

1 材料

1.1 主要儀器

超臨界細微粒子裝置(ZSCF-300,南通睿智超臨界科技發(fā)展有限公司);高速離心機(MiniSpin plus,德國Eppendorf);臺式冷凍離心機(5810R,德國Eppendorf);激光粒度儀(Nano ZS90,英國Malvern);高效液相色譜儀(1260Infinity,美國Agilent);pH高精度測試筆(PH220,樂清Cnoble公司);萬分之一電子天平(BSA224S,德國Sartorius);十萬分之一電子天平(BT125D,德國Sartorius);X-射線衍射儀(Smartlab 9kW,日本理學(xué));傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet iS 5,美國Thermo);掃描電子顯微鏡(QUANTA FEG 250,美國FEI)。

1.2 試劑

小白菊內(nèi)酯對照品(O0920AS,大連美侖生物);小白菊內(nèi)酯原料藥(南京春秋生物工程);無水乙醇(分析純,G73537F,上海泰坦科技);甲醇(分析純,G75851C,上海泰坦科技);甲醇(色譜純,215927,賽默飛Fisher);二氯甲烷(分析純,G81014K,上海泰坦科技);乙腈(分析純,UN1648,德國Merck)乙腈(色譜純,20211123,北京沃凱生物科技);聚乙二醇20000(H2130299,上海阿拉丁試劑);γ-CD(80F14,廣州市泰龍生化科技);氫氧化鉀(20181212,國藥集團化學(xué)試劑)。

2 方法與結(jié)果

2.1 小白菊內(nèi)酯含量測定

2.1.1 色譜條件 檢測波長:210 nm;色譜柱:Platisil ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-超純水(60∶40,v/v);流速:1 mL·min-1;進樣量:20 μL;柱溫:30 ℃;保留時間:8.2 min。

2.1.2 樣品配制 ①對照品溶液:稱取小白菊內(nèi)酯對照品約5.00 mg,精密稱定,置10 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容,搖勻得濃度約為500 μg·mL-1的儲備液,備用。②待測品溶液:稱取PTL@Neu-γ-CD-MOF粉末約5.00 mg,精密移取5 mL稀釋液溶解,即得。③空白MOF溶液配制:稱取Neu-γ-CD-MOF約5.00 mg,精密稱定,精密移取5 mL稀釋液溶解,得空白Neu-γ-CD-MOF溶液。④稀釋液配制:水∶乙醇 1∶1(v/v)混合渦旋即得。

2.1.3 線性與范圍 取適量儲備液稀釋配制成濃度分別為1、5、15、50、100 μg·mL-1的小白菊內(nèi)酯系列對照溶液。將配制的各濃度對照溶液離心(12 000 r·min-1,10 min),吸取上清于棕色液相小瓶中,經(jīng)HPLC檢測,記錄測得峰面積,根據(jù)峰面積(A)對小白菊內(nèi)酯濃度(C)進行線性回歸。

以PTL對照品濃度(C)為橫坐標(biāo),對相對應(yīng)的縱坐標(biāo)峰面積(A)進行線性回歸,回歸方程A=53.305C+21.281,r=0.999 9。相關(guān)系數(shù)表明PTL在1～100 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 專屬性與精密度 在上述色譜條件下,分別對100 μg·mL-1對照品、待測品及空白Neu-γ-CD-MOF溶液進行測定,考察分析方法的專屬性。結(jié)果表示Neu-γ-CD-MOF與溶劑均不干擾PTL含量測定,表明該方法的專屬性良好。

將小白菊內(nèi)酯儲備液加稀釋液稀釋得濃度為1、50、100 μg·mL-1的對照溶液,進行HPLC測定,重復(fù)進樣6次,記錄保留時間和峰面積并計算RSD。重復(fù)進樣的樣品峰面積以及保留時間的RSD值均小于3%,重復(fù)性良好,符合方法學(xué)驗證要求。

2.2 γ-CD-MOF的制備與激活

2.2.1 溶劑熱法制備γ-CD-MOF 以γ-CD∶KOH反應(yīng)摩爾比為1∶8稱量投料(γ-CD 6.48 g,KOH 2.24 g),超聲溶解于200 mL純水中,經(jīng)0.45 μm濾膜濾過,濾液加入120 mL甲醇,恒溫水浴50 ℃,澄清后繼續(xù)加熱20 min。取出后立即加入8 g·L-1的PEG2000甲醇溶液320 mL,靜置過夜。反應(yīng)液離心(4 000 r·min-1,5 min),棄上清,沉淀加入甲醇、無水乙醇洗滌各3次。

2.2.2 Neu-γ-CD-MOF的制備 沉淀加入醋酸5 mL,并加入無水乙醇至45 mL使之分散均勻,混懸液離心,下層沉淀加無水乙醇,洗滌3次,檢測pH應(yīng)為7.0±0.2,沉淀于50 ℃真空干燥箱內(nèi)干燥過夜。

2.2.3 scCO2流體技術(shù)干燥激活Neu-γ-CD-MOF scCO2流體技術(shù)激活Neu-γ-CD-MOF的制備干燥前步驟同溶劑熱法,用二氯甲烷(DCM)200～300 mL浸泡洗滌后的沉淀72 h,每24 h更換溶劑,浸泡后離心去上清,沉淀置于超臨界細微粒子裝置結(jié)晶釜中,在20 MPa壓力條件,50 ℃干燥6 h。

2.3 γ-CD-MOF理化性質(zhì)表征

2.3.1 粒徑分布 以甲醇分散γ-CD-MOF,配制成5 g·L-1混懸液,超聲10 min分散均勻,室溫(25 ℃)條件下,采用馬爾文激光粒度儀測定粒徑。

2.3.2 掃描電鏡觀察 將γ-CD-MOF均勻地涂布于導(dǎo)電膠表面,對樣品進行噴金處理,制樣后用掃描電子顯微鏡對樣品進行觀察分析,在適當(dāng)?shù)姆糯蟊稊?shù)下觀察樣品的形態(tài)。

2.4 PTL@Neu-γ-CD-MOF的制備及載藥條件優(yōu)化

2.4.1 溶劑孵育法 分別稱取0.06、0.10、0.12 g小白菊內(nèi)酯原料藥溶解于2 mL無水乙醇中,得30、50、60 g·L-1藥物溶液,待藥物溶解后加入0.06 g Neu-γ-CD-MOF,置于磁力攪拌裝置水浴加熱50 ℃,轉(zhuǎn)速50 r·min-1條件下攪拌2 h,離心(12 000 r·min-1,10 min),沉淀置于烘箱中50 ℃干燥3 h,。采用HPLC法測定小白菊內(nèi)酯含量,計算載藥量。

2.4.2 scCO2技術(shù)輔助Neu-γ-CD-MOF載藥 稱取0.30 g的PTL原料藥溶解于10 mL無水乙醇后置于超臨界細微粒子裝置結(jié)晶釜內(nèi),加入scCO2干燥激活的0.60 g Neu-γ-CD-MOF,在20 MPa,50 ℃條件下載藥2 h,離心(12 000 r·min-1,10 min),沉淀置于烘箱中50 ℃干燥3 h。采用HPLC法測定小白菊內(nèi)酯含量,計算載藥量。

2.4.3 γ-CD包合物制備 采用飽和水溶液沉淀法制備PTL@γ-CD包合物。配制0.17 mol·L-1(近飽和)的γ-CD水溶液10 mL,將0.42 g PTL溶于少量無水乙醇中,緩慢滴入到γ-CD水溶液中,50 ℃水浴加熱,攪拌轉(zhuǎn)速為300 r·min-1,包合6 h后室溫放冷,置于4 ℃冰箱,沉淀析出,抽濾,用無水乙醇滴加洗滌濾餅3次,將濾餅放入50 ℃烘箱干燥即得。

2.4.4 PTL載藥量測定 精密稱取5.00 mg載藥樣品于10 mL容量瓶中,加入稀釋液溶解并定容,稀釋適當(dāng)倍數(shù)使之濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi),經(jīng)HPLC法測定,記錄測得峰面積。樣品總質(zhì)量記為W總,樣品中測得PTL的質(zhì)量記為WS,載藥量=WS/W總×100%。

2.5 PTL@Neu-γ-CD-MOF理化性質(zhì)表征

2.5.1 粉末X射線衍射 取一定量粉末平鋪于載玻片上進行CuKα靶衍射,儀器的管電壓與電流分別為40 kV,40 mA,掃描的角度范圍是340°,掃描的步長為0.02°,掃描的速度設(shè)置為每步0.1 s。

2.5.2 傅里葉紅外光譜 將樣品與溴化鉀按照1∶10(w/w)的比例混合,研磨成均勻粉狀,取適量于壓片器中進行壓片,測定樣品在波數(shù)為4 000～400 cm-1范圍內(nèi)的紅外吸收光譜。

2.6 表觀溶解度

分別稱取過量PTL原料藥以及PTL@Neu-γ-CD-MOF、PTL@γ-CD樣品,加入2 mL超純水使之達到過飽和狀態(tài),固定于氣浴搖床中,設(shè)置溫度為25 ℃,轉(zhuǎn)速100 r·min-1條件下振蕩72 h后取上清液過0.22 μm濾膜,濾液經(jīng)稀釋后用HPLC法測定PTL濃度,計算表觀溶解度。

2.7 體外釋放評價

2.7.1 溶出方法 裁剪透析袋(截留分子量8 000～14 000)至合適長度,置于500 mL含NaHCO310.00 g、EDTA 146.12 mg煮沸15 min,清洗干凈,置干凈去離子水中保存。根據(jù)載藥量精密稱取11.32 mg PTL@Neu-γ-CD-MOF、23.23 mg PTL@γ-CD、3.00 mg PTL原料藥置預(yù)先加入1 mL溶出介質(zhì)的透析袋中,裝入含釋放介質(zhì)30 mL的離心管中,置氣浴搖床,100 r·min-1,(37±0.5) ℃,于溶出開始后的0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24 h分別吸取2 mL(同時加入2 mL相同溫度的溶出介質(zhì)),經(jīng)0.45 μm濾膜濾過,采用HPLC法測定PTL濃度。繪制溶出曲線。

2.7.2 溶出介質(zhì) pH 7.4磷酸鹽緩沖液:取PBS磷酸鹽緩沖劑(含NaCl,Na2HPO4·12H2O,NaH2PO4·H2O),加去離子水溶解為1 000 mL。

3 結(jié)果

3.1 粒徑分布

粒徑及多分散系數(shù)值(PDI)見于表1。相比于二氯甲烷激活,scCO2激活所得γ-CD-MOF PDI更小,分散更均一。二氯甲烷活化γ-CD-MOF經(jīng)中性化處理組(二氯甲烷激活Neu-γ-CD-MOF)粒徑比未中性化組(二氯甲烷激活γ-CD-MOF)增大近1倍,而scCO2激活γ-CD-MOF經(jīng)中性化處理組(scCO2激活Neu-γ-CD-MOF)的粒徑比未中性化處理組(scCO2激活γ-CD-MOF)僅增加18.24%,提示采用scCO2活化有助于γ-CD-MOF晶體的分散和穩(wěn)定。

表1 不同干燥方式制備γ-CD-MOF的粒徑Table 1 Mean size of γ-CD-MOF prepared by different drying methods

3.2 掃描電鏡觀察

二氯甲烷激活與scCO2激活γ-CD-MOF的晶體均呈均一的立方體(圖1),與馬爾文粒徑儀測得結(jié)果相符,表明超臨界反應(yīng)釜內(nèi)20 MPa的高壓環(huán)境對其形態(tài)無影響,且scCO2激活γ-CD-MOF聚集成團塊的情況較輕,以馬爾文粒徑儀測得其PDI值明顯小于二氯甲烷激活組(表1),提示scCO2激活γ-CD-MOF的粒徑分布更均勻。

注：A.二氯甲烷激活Neu-γ-CD-MOF;B.scCO2激活Neu-γ-CD-MOF

3.3 Neu-γ-CD-MOF的制備及載藥條件優(yōu)化

3.3.1 載藥濃度考察 對Neu-γ-CD-MOF進行不同載藥濃度的載藥考察(50 ℃,2 h)，見表2,在常規(guī)載藥方法中,載藥濃度提高能增加載藥量,但達到一定載藥濃度后載藥量提升并不顯著,可能與載藥接近飽和有關(guān)。

表2 載藥濃度考察Table 2 Drug loading of Neu-γ-CD-MOF processed

3.3.2 scCO2技術(shù)輔助Neu-γ-CD-MOF載藥 載藥濃度相同(50 g·L-1)時,使用scCO2技術(shù)干燥激活制備的Neu-γ-CD-MOF與溶劑浸泡激活的Neu-γ-CD-MOF相比具有更高的載藥能力,scCO2輔助Neu-γ-CD-MOF載PTL的載藥量可以達到(26.58±0.43)%,顯著高于常規(guī)載藥以及環(huán)糊精包合(表3)。

表3 不同干燥方式制備Neu-γ-CD-MOF的載藥量Table 3 Drug loading of Neu-γ-CD-MOF processed

3.4 PTL@Neu-γ-CD-MOF納米粒理化性質(zhì)表征

3.4.1 粉末X射線衍射 粉末X射線衍射圖譜(圖2)可以看出,二氯甲烷激活Neu-γ-CD-MOF在4.1°、5.8°、7.1°、13.5°以及16.8°處有顯著的衍射峰,scCO2激活Neu-γ-CD-MOF也同樣具有上述衍射峰,且其在13.5°以及16.8°處的衍射峰顯著增強。說明scCO2激活Neu-γ-CD-MOF的晶體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且結(jié)晶性更好。

圖2 Neu-γ-CD-MOF激活前/后和scCO2載藥后XRD衍射圖譜Fig.2 XRD of PTL, Neu-γ-CD-MOF, scCO2 actived Neu-γ-CD-MOF, and PTL@Neu-γ-CD-MOF

PTL原料藥以穩(wěn)定的晶型存在,在9.6°、15.3°、17.14°以及19.1°有顯著的衍射峰,而載藥后PTL@Neu-γ-CD-MOF中PTL特征衍射峰消失,提示PTL以非晶態(tài)形式存在于Neu-γ-CD-MOF中,超臨界載藥后Neu-γ-CD-MOF的特征衍射峰依然存在,說明載藥過程中Neu-γ-CD-MOF結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

3.4.2 傅里葉紅外光譜 傅里葉紅外光譜(圖3)表明PTL在1 754 cm-1和1 655 cm-1處具有特征紅外振動吸收,為PTL的不飽和羰基v(C=O)的伸縮振動,經(jīng)scCO2輔助載藥后PTL的特征紅外吸收峰完全消失,說明PTL成功包載于Neu-γ-CD-MOF空腔內(nèi)導(dǎo)致其特征伸縮振動消失;而Neu-γ-CD-MOF載藥后其特征吸收依然存在,說明在超臨界載藥過程中Neu-γ-CD-MOF結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

圖3 Neu-γ-CD-MOF、PTL以及PTL@Neu-γ-CD-MOF的FT-IR光譜Fig.3 FT-IR spectra of Neu-γ-CD-MOF, PTL,and PTL@Neu-γ-CD-MOF

3.5 表觀溶解度

表觀溶解度結(jié)果(表4)表明Neu-γ-CD-MOF對PTL具有增溶作用,其在水中的表觀溶解度比原料藥提高2.2倍;γ-CD包合物在水中對PTL原料藥僅增溶1.5倍。

表4 PTL原料藥、PTL@γ-CD及PTL@Neu-γ-CD-MOF在水中的平衡溶解度Table 4 Solubility of PTL, PTL@γ-CD,and PTL@CD-MOF in water

3.6 體外釋放評價

溶出曲線(圖4)顯示PTL@Neu-γ-CD-MOF納米粒在0.5 h釋放了24.93%,而原料藥組僅釋放了4.69%,表明納米載體顯著提高了PTL的釋放速率。24 h內(nèi)PTL@Neu-γ-CD-MOF組藥物的累積釋放度可達98.32%,PTL@γ-CD組累積釋放77.58%,而PTL原料藥組僅釋放44.80%。以上結(jié)果顯示,PTL@Neu-γ-CD-MOF比PTL@γ-CD和PTL具有更快的藥物溶出速率和更高的累積釋放度。

圖4 PTL@Neu-γ-CD-MOF、PTL@γ-CD、PTL在PBS中的溶出曲線Fig.4 In vitro dissolution curves of PTL@Neu-γ-CD-MOF,PTL@γ-CD, and PTL in PBS

4 討論

本研究利用scCO2流體技術(shù)激活γ-CD-MOF,并優(yōu)化其載藥工藝。使用中性化γ-CD-MOF為載體,可避免PTL受堿性MOF影響而降解。以載藥量為評價指標(biāo)對比了溶劑孵育法以及scCO2流體輔助法制備的PTL@Neu-γ-CD-MOF,scCO2流體輔助Neu-γ-CD-MOF載PTL的載藥量可以達到26.58±0.23%,顯著高于常規(guī)載藥以及環(huán)糊精包合物,顯示scCO2流體技術(shù)可利用其高溶解度及高擴散性加速PTL進入Neu-γ-CD-MOF的載藥微孔中。

采用掃描電鏡對scCO2激活前后的γ-CD-MOF進行表征,結(jié)果顯示采用scCO2流體技術(shù)激活更易得到單分散的γ-CD-MOF晶體,比溶劑激活法更高效且綠色無有機溶劑殘留,具有良好的生物相容性。FT-IR和PXRD圖譜中,PTL特征吸收峰與指示晶型的特征衍射峰在載入Neu-γ-CD-MOF后消失,表明PTL以非晶態(tài)存在于Neu-γ-CD-MOF中,同時載藥前后Neu-γ-CD-MOF晶型結(jié)構(gòu)無顯著變化,說明載藥過程不影響Neu-γ-CD-MOF的晶型,載藥后仍能保持完整的晶體結(jié)構(gòu)。

PTL原料藥在水中飽和溶解度為(549.02±0.69)μg·mL-1,以非晶態(tài)載入Neu-γ-CD-MOF,可解除PTL晶格能的束縛,同時MOF與PTL藥物形成包合物或納米團簇,對PTL具有一定的增溶作用,其在水中的表觀溶解度比原料藥提高2.2倍。體外釋放評價顯示PTL@CD-MOF納米粒溶出特征明顯優(yōu)于PTL@γ-CD及PTL原料藥。環(huán)糊精包合物可通過藥物PTL與環(huán)糊精之間形成絡(luò)合物,增強氫鍵作用而增溶,而Neu-γ-CD-MOF增溶機制為PTL藥物分子既可在Neu-γ-CD-MOF的雙環(huán)糊精分子中形成PTL的環(huán)糊精包合物,又可在γ-CD-MOF的空腔內(nèi)形成藥物納米團簇,凸顯了Neu-γ-CD-MOF的遞藥優(yōu)勢。