董志強(qiáng) 杜少波 陳曉文 謝惠春

摘 要：藏茵陳是藏族藥物歷史悠久的八珍藏藥之一，具有清熱、解毒、清肝利膽的功效。藏茵陳分為獐牙菜屬、花錨屬、扁蕾屬等，其中川西獐芽菜、橢圓葉花錨、濕生扁蕾分別為其屬中最具有代表性的植物，藥效佳，受到了越來越多的歡迎。近年來，藥用植物在分子水平生物合成機(jī)制與調(diào)控、分子標(biāo)記技術(shù)、次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑（基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)）等方面的研究已然成為現(xiàn)如今分子水平研究中最活躍、最熱點(diǎn)的領(lǐng)域。該文通過查閱近年文獻(xiàn)，從生物合成分子機(jī)制與調(diào)控、分子標(biāo)記技術(shù)、次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑（基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)）等方面對3種典型藏茵陳植物（川西獐芽菜、橢圓葉花錨、濕生扁蕾）的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述與展望，為其今后在分子水平上相關(guān)機(jī)制的研究提供參考。

關(guān)鍵詞：獐牙菜;川西獐芽菜;橢圓葉花錨;濕生扁蕾;分子調(diào)控機(jī)制

中圖分類號 R282 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2022）11-0013-04

Research Progress on Molecular Level of Typical Original Plants of Tibetan Wormwood（Swertia mussotii， Halenia elliptica D. and Gentianopsis paludosa）

DONG Zhiqiang? ?DU Shaobo? ?CHEN Xiaowen? ?XIE Huichun

（Key Laboratory of Medicinal Plant and Animal Resources of Qinghai-Tibet Plateau in Qinghai Province， Qinghai Normal Unversity， Xining 810008， China）

Abstract： Tibetan Herba Artemisiae Scopariae is one of the eight Tibetan medicines with a long history of Tibetan medicine， which has the effects of clearing away heat， detoxifying， clearing away liver and benefiting gallbladder. Tibetan Artemisia can be divided into Swertia， Anthurium and Flaveria， among which Swertia in western Swertia mussotii， Halenia elliptica D. and Gentianopsis paludosa are the most representative plants with the best efficacy， which have gained more and more popularity. In recent years， the research on molecular mechanism and regulation of biosynthesis in medicinal plants， molecular marker technology and biosynthetic pathway of secondary metabolites （based on transcriptome sequencing technology） have become the most active and hot fields in molecular level research. In this paper， the research progress of three typical Tibetan Artemisia plants （Swertia mussotii， Halenia elliptica D. and Gentianopsis paludosa） was summarized and prospected from three aspects， such as the research on molecular mechanism and regulation of biosynthesis， molecular marker technology， and biosynthetic pathway of secondary metabolites （based on transcriptome sequencing technology）， so as to provide reference basis for the related mechanism research at molecular level in the future.

Key words： Swertia; Swertia mussotii; Halenia elliptica D.; Gentianopsis paludosa; Molecular regulation mechanism

藏茵陳，藏藥名“桑蒂”“蒂達(dá)”，始載于藏醫(yī)藥書《四部醫(yī)典》，具有清熱解毒、清肝利膽的功效，在歷代的藏醫(yī)藥著作如《晶珠本草》《鮮明注釋》等均有記載[1]。廣義的藏茵陳主要包括獐牙菜屬Sweriat、花錨屬Halellia、扁蕾屬Gentianopsis等[2]。其中，川西獐芽菜、橢圓葉花錨、濕生扁蕾是其各自屬屬中最具有代表性的植物，是藏茵陳入藥原植物中的主要植物，有關(guān)它們的化學(xué)成分組成、藥理作用方面的研究文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)不勝數(shù)[3]。川西獐芽菜、橢圓葉花錨、濕生扁蕾均以全草入藥，味苦、性寒，均具有清熱利濕、平肝利膽作用，均是藏醫(yī)臨床治療肝膽疾病的常用藥物[4]。川西獐芽菜、橢圓葉花錨、濕生扁蕾的主要化學(xué)成分均為呫噸酮及其苷、裂環(huán)烯醚萜類、三萜類及黃酮苷等化合物，另外還含有齊墩果酸等，具有保肝、抗氧化、抗病毒、抗炎性反應(yīng)、降血糖、抗癌、抗腫瘤、抗纖維化等作用[5]。由于近年來傳統(tǒng)藏藥被認(rèn)為對治療相關(guān)疾病具有較好的療效，傳統(tǒng)藏藥的開發(fā)與利用具有巨大的上升空間，對其的研究與發(fā)展也受到了社會(huì)各界的廣泛關(guān)注[6]。

近年來，藥用植物在分子水平上的研究成日益增多，尤其對于驗(yàn)證和探討發(fā)現(xiàn)藥用植物相關(guān)生物合成途徑以及相關(guān)次生代謝產(chǎn)物合成途徑中的關(guān)鍵酶、關(guān)鍵基因、關(guān)鍵蛋白等，通過對其分子調(diào)控機(jī)制的研究可以有效地揭示藥用植物中內(nèi)源合成機(jī)制以及調(diào)控系統(tǒng)，真正探討出關(guān)鍵化合物合成的機(jī)制與其必要的途徑，為合成重要的化合物提供基礎(chǔ)[7]。其中，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已成功應(yīng)用于動(dòng)物、植物、微生物等各類生物當(dāng)中，主要涉及疾病研究、關(guān)鍵基因發(fā)掘及基因剪切等方面[8]，以及利用pcr、western bolt等技術(shù)[9]驗(yàn)證相關(guān)通路的分子機(jī)制研究成為目前對藥用植物藥效分析及生物合成的分子機(jī)制的研究熱點(diǎn)，具有較大的發(fā)展?jié)摿Αζ渫诰蚬δ芑?、探究藥用植物有效成分生物合成的分子機(jī)制、開發(fā)新的藥用植物資源及分子輔助育種技術(shù)等都具有重要的意義[10]。本文通過查閱近年文獻(xiàn)，分別對3種藏茵陳入藥原植物（川西獐芽菜、橢圓葉花錨、濕生扁蕾）從生物合成分子機(jī)制與調(diào)控研究、分子標(biāo)記技術(shù)研究、次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑（基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)）3個(gè)方面的研究進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)梳理，為今后藏茵陳原植物的研究提供參考。

1 生物合成分子機(jī)制與調(diào)控

生物合成機(jī)制調(diào)控中活性成分在藥用植物中具有重要作用，其生物合成途徑解析的挖掘也已成為藥用植物研究的主要目標(biāo)之一。川西獐芽菜、橢圓葉花錨、濕生扁蕾的活性成分中的（口山）酮類、三萜類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類[11]均被公認(rèn)為對治療肝病、炎癥、腫瘤、癌癥等有著明顯的療效。目前，關(guān)于生物合成的通路及關(guān)鍵酶及關(guān)鍵基因等調(diào)控機(jī)制大多數(shù)源于上述幾種活性成分。

杜曉煌[12]等用川西獐芽菜醇提活性物質(zhì)來驗(yàn)證肝細(xì)胞膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mrp4（multidrug resistance-associated protein4，Mrp4）、轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的調(diào)控作用，通過RT-qPCR、Western blot檢測大鼠肝臟細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mrp4、Mrp3及相關(guān)核受體在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化，均發(fā)現(xiàn)Mrp4、Mrp3、Nrf2的表達(dá)均增高，表示這種調(diào)控作用可能與Nrf2相關(guān)。Wu J[13]等通過對川西獐芽菜中環(huán)烯醚萜類中的獐芽菜苦苷成分進(jìn)行提取，驗(yàn)證其對缺氧-葡萄糖剝奪/復(fù)氧（OGDR）刺激的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的潛在神經(jīng)保護(hù)作用，通過Western blot方法對TLR4相關(guān)蛋白進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)提取物可以降低TLR4、MYD88、NF-KBp65和PARP1的表達(dá)，說明獐芽菜苦苷可以通過TLR4/PARP1/NF-KB途徑減輕ROS水平升高和抑制凋亡，從而保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞免受OGDR誘導(dǎo)的損傷。譚湘姍[14]等利用橢圓葉花錨化學(xué)成分中的1-羥基-2，3，5-三甲氧基（口山）酮（HM-1），探索其在大鼠肝臟微粒中的代謝途徑，通過采用大鼠肝臟微粒體溫孵體系，結(jié)合高效液相-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（LC/MSn-IT-TOF），對其產(chǎn)生的6個(gè)代謝產(chǎn)物通過肝藥酶細(xì)胞色素P450篩選的5個(gè)主要的CYP450酶亞型，即CYP1A2，2C9，2D6，2E1和3A4在HM-1中進(jìn)行抑制率情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)CYP450酶亞型均介導(dǎo)了HM-1在大鼠肝臟微粒體中的代謝，其中CYP2C6/11與CYP3A2最為明顯，推測其可能是參與HM-1在大鼠肝臟微粒體代謝的主要CYP450酶。王昕[15]等通過對橢圓葉花錨的總黃酮進(jìn)行提取，構(gòu)造肝纖維化大鼠模型肝星狀細(xì)胞（HSC），由于α-肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的高表達(dá)可以增強(qiáng)HSC的活化，造成肝纖維化及肝硬化，研究發(fā)現(xiàn)，橢圓葉花錨總黃酮提取物可以降低HSC激活標(biāo)志物α-肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)，造成HSC凋亡，這可能是抗肝纖維化的一條有效途徑。趙慧巧[16]等通過用濕生扁蕾的提取物來探討NF-KB信號通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制，利用Hoechst染色以及檢測NF-KB蛋白的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)一定濃度的濕生扁蕾提取物經(jīng)過處理后，在SW480細(xì)胞中，NF-KB的表達(dá)明顯下調(diào)，表明濕生扁蕾可能通過NF-KB信號通路來介導(dǎo)的腫瘤機(jī)制，造成腫瘤細(xì)胞凋亡。

2 SSR分子標(biāo)記技術(shù)

SSR分子標(biāo)記技術(shù)[17]在藥用植物基因組中散布著大量的串聯(lián)重復(fù)序列，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性、覆蓋面廣、易檢測、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位和分子標(biāo)記輔助育種、遺傳多樣性分析和品種及純度鑒定等方面得到了廣泛應(yīng)用。SSR分子標(biāo)記技術(shù)作為高通量測序技術(shù)提供前導(dǎo)性研究，也為驗(yàn)證相關(guān)次生代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵基因以及相關(guān)通路做鋪墊，起到了至關(guān)重要的作用[18]。

劉越[19]等利用MISA（MicroSAtelite）軟件對川西獐牙菜轉(zhuǎn)錄組序列68787條跨疊群（contigs）進(jìn)行簡單重復(fù)序列（SSR）位點(diǎn)的挖掘，發(fā)現(xiàn)5099條序列中含有5610個(gè)SSR位點(diǎn)，其中三核苷酸重復(fù)基源最高，其次為二核苷酸，SSR主要以5～10次重復(fù)為主，長度集中在12～30bp，結(jié)果發(fā)現(xiàn)川西獐牙菜轉(zhuǎn)錄組SSR的出現(xiàn)頻率高，重復(fù)類型豐富，表明川西獐芽菜SSR具有較高的可用性。Zhang[20]等利用磁珠富集法（FIASCO）開發(fā)了12個(gè)橢圓葉花錨的多態(tài)性微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA，亦稱SSR），這些引物在備檢的一個(gè)異型花個(gè)體上也表現(xiàn)出通用性。Yang等利用NGS Illumina技術(shù)得到橢圓葉花錨的轉(zhuǎn)錄組，其中32109單基因成催化功被掃描，形成了簡單重復(fù)序列（SSRs），并對其進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞成分組成、催化活性因子、結(jié)合因子以及細(xì)胞代謝過程中表現(xiàn)最為豐富。此外，還通過設(shè)計(jì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定其在8個(gè)種群40個(gè)個(gè)體樣本中的多態(tài)性差異，發(fā)現(xiàn)橢圓葉花錨親緣關(guān)系與地理距離之間存在顯著性差異，具有系統(tǒng)的地理結(jié)構(gòu)，還證明了橢圓葉花錨與滇黃芩具有親緣性關(guān)系，存在跨物種轉(zhuǎn)移的能力，為研究橢圓葉花錨與其近緣性物種的遺傳多樣性和種群歷史提供了有價(jià)值的資料。王久利[21]等利用SR search軟件檢測橢圓葉花錨得到5種類型的SSR（二、三、四、五、六核苷酸）位點(diǎn)共6201個(gè)，并成功設(shè)計(jì)其中3865個(gè)SSR引物，從中挑選出65對可對應(yīng)的引物。通過橢圓葉花錨的4個(gè)居群32個(gè)個(gè)體進(jìn)行pcr和聚丙烯酰氨凝膠電泳驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)其中14對引物能在絕大多數(shù)個(gè)體中擴(kuò)增，且13對具多態(tài)性，從而得到了橢圓葉花錨近緣類群的一個(gè)值得參考的數(shù)據(jù)庫。

3 次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑（基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)）

次生代謝產(chǎn)物[22]是藥用植物的重要組成部分，其種類繁多，主要包括含氮有機(jī)物、生物堿、萜類、酚類、黃酮類及有機(jī)酸等。藥用植物具有作用靶點(diǎn)多，組分復(fù)雜的特點(diǎn)，通過轉(zhuǎn)錄組測序解析次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑并挖掘關(guān)鍵酶基因，可為藥用植物活性成分的積累和高效利用提供科學(xué)依據(jù)。

李曉雪[23]等利用川西獐芽菜葉片cDNA為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到特異性片段，并將特異性片段與Peasy-Blunt Simple Clonging Vector連接，進(jìn)行高通量測序，通過序列對比及生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析驗(yàn)證了7-脫氧馬錢子酸羥化酶（SmDL7H）被成功克隆，7-脫氧馬錢子酸羥化酶（SmDL7H）是川西獐牙菜裂環(huán)烯醚萜合成途徑中關(guān)鍵酶，它的成功克隆為研究裂環(huán)烯醚萜類化合物合成途徑奠定基礎(chǔ)。Li WJ[24]等通過川西獐芽菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆DXS2基因（基因庫編號MH535905），命名為SmDXS2。因?yàn)?-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶2（DXS2）是MEP途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，在植物萜類生物合成中起到重要作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，克隆的SmDXS2蛋白與龍膽DXS2蛋白同源，與預(yù)期大小一致，為研究環(huán)烯醚萜類化合物合成及代謝通路做鋪墊。Liu Y[25]等通過高通量技術(shù)對川西獐芽菜根、莖、葉、花的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，進(jìn)行GO和KEGG在內(nèi)的注釋數(shù)據(jù)庫的BLAST搜索，通過qRT-PCR驗(yàn)證了39個(gè)編碼環(huán)烯醚萜生物合成關(guān)鍵酶的候選轉(zhuǎn)錄本在不同組織中的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在川西獐芽菜不同部位的基因存在較大的表達(dá)差異性，其中7DLGT基因的表達(dá)水平與其他基因顯著不同，它的低表達(dá)可能說明其是在裂環(huán)烯醚萜代謝途徑中的限速酶，SLS基因與川西獐芽菜中的2個(gè)同源SLS基因表達(dá)模式不同，但是否具有功能差異還不得而知，為進(jìn)一步挖掘調(diào)控藥用成分次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶基因奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論與展望

本文從生物合成分子機(jī)制與調(diào)控、分子標(biāo)記技術(shù)、次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑（基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)）等方面梳理了國內(nèi)外近年來在3種上的典型藏茵陳植物（川西獐芽菜、橢圓葉花錨、濕生扁蕾）研究成果。結(jié)果顯示，生物合成分子機(jī)制與調(diào)控有助于得到新的功能基因和代謝通路，為天然藥物來源新途徑，種質(zhì)資源鑒定、保存、擴(kuò)大與優(yōu)良種質(zhì)選育提供分子基礎(chǔ)。SSR分子標(biāo)記的開發(fā)，通過構(gòu)建藥用植物指紋圖譜，為分子標(biāo)記輔助育種，種質(zhì)資源收集、鑒定與評價(jià)提供技術(shù)支撐。次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑可以通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)了解其次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑的分子機(jī)制及其合成所需的關(guān)鍵酶基因，為進(jìn)一步研究次生代謝調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，推動(dòng)了藥用植物次生代謝工程的發(fā)展。但也存在不足之處，其中川西獐芽菜在分子水平上的相關(guān)研究進(jìn)展均超過了橢圓葉花錨及濕生扁蕾，這可能與川西獐芽菜被廣泛認(rèn)為是藏茵陳的正品有關(guān)。但隨著野生資源被破壞嚴(yán)重，無法得到有效保護(hù)，導(dǎo)致其瀕臨滅絕，而通過對其基源性植物的開發(fā)與探索，也能取得不錯(cuò)的成果，解決燃眉之急。其中，橢圓葉花錨在轉(zhuǎn)錄組測序方面也只有相關(guān)分子標(biāo)記的研究，而濕生扁蕾更甚，在轉(zhuǎn)錄組測序方面上幾乎沒有文獻(xiàn)報(bào)道，但其在治療結(jié)腸癌方面有著顯著療效，這些都說明3種典型藏因陳植物（川西獐芽菜、橢圓葉花錨、濕生扁蕾）在分子水平的研究都具有局限性，應(yīng)當(dāng)在其后的研究中多多探討，尤其是在轉(zhuǎn)錄組測序方面，可以通過測序藥用植物不同部位、不同地點(diǎn)、不同海拔等系列條件，尋找差異表達(dá)基因，從而進(jìn)一步確定驗(yàn)證相關(guān)生物合成以及次生代謝物的關(guān)鍵基因、關(guān)鍵蛋白等，結(jié)合新興的蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)研究，實(shí)現(xiàn)高通量與高效率的結(jié)合，助力傳統(tǒng)中藏藥的現(xiàn)代化進(jìn)程。

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基金項(xiàng)目：科技部“第二次青藏高原綜合科學(xué)考察研究”生命地球化學(xué)循環(huán)與環(huán)境健康專題（2019QZKK0606）;青海省重大科技專項(xiàng)青海生態(tài)環(huán)境價(jià)值評估及大生態(tài)產(chǎn)業(yè)發(fā)展綜合研究（2019-SF-A12）;青海省科技廳青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（2020-YJ-Y40）;基于道地演變的5種多基源中藏藥材品質(zhì)評價(jià)及轉(zhuǎn)錄組研究（2017-ZJ-774）;中國科學(xué)院2018年度“西部之光”人才培養(yǎng)引進(jìn)項(xiàng)目（人字[2018]99號）。

作者簡介：董志強(qiáng)（1996—），男，河南三門峽人，碩士研究生，研究方向：生態(tài)學(xué)。

通訊作者：謝惠春，男，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：青藏高原動(dòng)植物資源。? 收稿日期：2021-12-21