張皓哲,高春紅,李天鐸,馬建平,許 靜*

1.齊魯工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院,山東 濟(jì)南 250353;2.山東圣陽電源股份有限公司,山東 曲阜 273100

羥基自由基具有極強(qiáng)的獲得電子的能力,是一種活性氧,可與生物體內(nèi)的糖、蛋白質(zhì)、DNA、堿基、磷脂、有機(jī)酸等物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng),且反應(yīng)速率快,造成組織細(xì)胞的損傷[1]。人體在正常新陳代謝過程中即可產(chǎn)生羥基自由基,因此羥基自由基被認(rèn)為是毒性最大的自由基。如何清除羥基自由基是一件有重要意義的研究工作。

抗氧化劑可清除自由基,其可捕獲、中和自由基,從而清除自由基,降低自由基造成的組織細(xì)胞損傷,以實(shí)現(xiàn)保護(hù)細(xì)胞?？寡趸瘎┌ê铣尚灶惡吞烊活怺2-3]。合成的抗氧化劑其本身具有一定的毒副作用,例如人工合成的抗氧化劑丁基羥基茴香對人體內(nèi)呼吸酶的活性具有抑制作用,并且會增加肝微粒體酶活性,在多個(gè)國家被禁用[4]。而天然抗氧化劑因其對人體無毒副作用,而且具有高效抗氧化活性,并且來源廣泛,已成為研究熱點(diǎn)[5]。天然抗氧化活性成分主要有多酚類、維生素類等化合物。近年來,各種酚類抗氧化劑被用作魚肉和魚糜的抗氧化劑。維生素類抗氧化劑包括維生素C、維生素B1、維生素E和維生素A及其衍生物等。其中,維生素C又稱L-抗壞血酸,其能夠螯合金屬離子、清除自由基。高等植物是天然抗氧化劑最豐富的來源,例如水果、蔬菜、香料、草藥等[6-7]。

膠原也是一種天然抗氧化劑,并且來源廣泛、成本低廉、功效眾多,對人體無毒性無副作用。研究發(fā)現(xiàn),不同來源的膠原均具有一定的自由基清除能力[8]。張鑫[9]以牛鼻肉作為原料,利用熱水提取法、酶法和酸法三種不同的提取方法分別得到膠原,從清除羥基自由基、DPPH自由基(一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基)、ABTS自由基(2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽,游離氯的光譜試劑)的效果方面綜合評價(jià)膠原的抗氧化活性,結(jié)果表明,膠原的濃度與其抗氧化能力呈線性關(guān)系。熊明澤等[10]以鴻雁骨骼為原料,采用復(fù)合酶進(jìn)行酶解制備雁骨膠原,通過超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除能力測定,結(jié)果顯示,雁骨膠原的抗氧化活性與其濃度正相關(guān),當(dāng)?shù)孜餄舛葹? mg/mL時(shí),超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除率分別為59.21%、51.82%。上述研究表明,濃度是影響膠原抗氧化能力的一個(gè)關(guān)鍵因素。

張英等[11]研究了19種氨基酸對羥基自由基的抑制作用,研究結(jié)果表明,這19種氨基酸中,酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、賴氨酸(Lys)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)和天冬酰胺(Asn)等氨基酸對自由基的清除能力較強(qiáng)。氨基酸中,Try清除羥基自由基能力最強(qiáng),其次是Glu和Asp,最后是Lys,Gly和Asn。程勇杰等[12]研究發(fā)現(xiàn),羥基自由基清除能力和還原力均表現(xiàn)出了濃度依賴性,氨基酸含量與抗氧化性能具有正相關(guān)性,尤其是天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)和脯氨酸(Pro)這六種主要氨基酸含量與還原力具有顯著的正相關(guān)性。

氨基酸清除自由基機(jī)制一般是通過直接清除自由基、螯合或還原金屬離子阻止其催化過氧化物生成自由基。直接清除自由基是指通過電子轉(zhuǎn)移和能量轉(zhuǎn)移作用,直接清除自由基和活性氧分子[13]。目前普遍認(rèn)為,氫供體型氨基酸清除自由基主要是以下三類途徑[14]:(a)一步式氫原子轉(zhuǎn)移(one step H-atom transfer,HAT),即自由基從氨基酸上直接奪去一個(gè)氫原子;(b)分步式的電子轉(zhuǎn)移-質(zhì)子轉(zhuǎn)移(stepwise electron transfer-proton transfer,ET-PT),即氨基酸首先發(fā)生電子轉(zhuǎn)移生成其陽離子形式,然后再進(jìn)行質(zhì)子轉(zhuǎn)移完成整個(gè)清除自由基過程;(c)質(zhì)子缺失伴隨的電子轉(zhuǎn)移(sequential proton loss-electron transfer,SPLET),即氨基酸先失去一個(gè)質(zhì)子,然后伴隨著電子轉(zhuǎn)移完成清除自由基(圖1)。鄭淋[14]通過總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS)法和氧化自由基吸收能力(ORAC)法評價(jià)了48條含Try殘基的二肽抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)大部分二肽序列中的Try具有很強(qiáng)的自由基清除能力,推測這可能與其氨基酸形成氫鍵及荷電性質(zhì)有關(guān)。

螯合或還原金屬離子抑制自由基是指部分氨基酸可與金屬離子形成絡(luò)合物,或還原金屬離子,進(jìn)而減少金屬離子對氧化作用的催化活性。據(jù)研究,酸性氨基酸和堿性氨基酸能通過他們帶電荷的側(cè)臉基團(tuán)與金屬離子形成復(fù)合物[13]。Decker等[15]研究了肌肽與其組成氨基酸組氨酸相比抑制低密度脂蛋白(LDL)氧化的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn),肌肽和組氨酸都不是2,2′-偶氮雙(2-氨基丙烷)二鹽酸鹽促進(jìn)LDL氧化的強(qiáng)抑制劑,表明它們的主要抗氧化機(jī)制是通過銅螯合作用。

綜上所述,我們推斷膠原的抗氧化性源于其分子上的氨基酸。但是,膠原類型較多,其分子上氨基酸種類、含量均不同,此外膠原水解后其產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)也將影響游離氨基酸的含量。膠原清除自由基機(jī)制尚且模糊。本研究將比較膠原及其水解產(chǎn)物明膠的羥基自由基清除效率,研究分子構(gòu)象,闡述其清除自由基的機(jī)理,為進(jìn)一步研究膠原類產(chǎn)品的抗氧化性質(zhì)提供思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

硫酸亞鐵(A.R.):上海麥克林生化科技有限公司；過氧化氫(A.R.):上海麥克林生化科技有限公司；水楊酸(A.R.):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇(A.R.):天津市富宇精細(xì)化工有限公司；明膠(C.P.):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；膠原(B.R.):南京都萊生物技術(shù)有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

AR223CN電子天平:奧豪斯儀器(常州)有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:鄭州市予華儀器制造有限公司；DHG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV2800S型紫外可見分光光度計(jì):上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；L-8900氨基酸分析儀:日本日立公司；Chirascan圓二色譜儀:英國應(yīng)用光物理公司。

1.3 方法

本研究參考徐文匯等[16]的方法對膠原和明膠分別進(jìn)行羥基自由基的清除效果測定,設(shè)置測試膠原和明膠的質(zhì)量濃度梯度為:2、4、6、8、10、12 mg/mL,并比較膠原和明膠對羥基自由基的清除效果差異。參考熊明澤等[10]的方法對膠原和明膠的氨基酸種類及含量進(jìn)行測定。參考張震等[17]方法對明膠的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定。

1.3.1 膠原和明膠溶液的配制

依照設(shè)定的濃度梯度配置六組不同濃度的膠原和明膠溶液,每份體積分別為3.5 mL和7.0 mL,計(jì)算好溶質(zhì)質(zhì)量,精確稱取膠原或明膠并將其置于小試管中,計(jì)算好去離子水體積并移取置于小試管中,然后加入磁力攪拌器轉(zhuǎn)子室溫?cái)嚢?0 h,使樣品其完全溶解后,于-25 ℃環(huán)境的冰箱中保存。

1.3.2 自由基清除能力測定

羥基自由基能被水楊酸有效捕捉并生成有色物質(zhì),其混合液在530 nm附近有強(qiáng)吸收。但若加入具有對羥基自由基清除作用的物質(zhì),便會與水楊酸競爭,從而使有色產(chǎn)物生成量減少,進(jìn)而導(dǎo)致在530 nm處的吸光度開始降低。吸光度和自由基清除率成定量關(guān)系[11]。將膠原置于室溫環(huán)境自然解凍,將明膠置于40 ℃水浴鍋解凍,向不同試管中各加1.75 mL不同濃度的膠原溶液和9 mmol/L水楊酸、10 mmol/L硫酸亞鐵溶液和7.8 mmol/L的過氧化氫各0.25 mL。37 ℃下恒溫反應(yīng)30 min后通過紫外可見光分光光度計(jì)測得各混合液在530 nm處的吸光度,按式(1)計(jì)算羥基自由基的清除率。

清除率=[1 -(Ax-Ax0)/A0]× 100%, (1)

其中:

反應(yīng)體系(Ax)=樣品液+水楊酸+FeSO4+H2O2;本底(Ax0)=樣品液+水楊酸+FeSO4+雙蒸水;空白對照(A0)=雙蒸水+水楊酸+FeSO4+H2O2。

將計(jì)算得到的膠原對羥基自由基的清除率和明膠對羥基自由基的清除率進(jìn)行匯總,利用Origin繪制成圖表。

1.3.3 膠原和明膠的氨基酸含量測定

準(zhǔn)確吸取0.200 mL混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液,用pH 2.2的緩沖液稀釋到5 mL,此標(biāo)準(zhǔn)稀釋液濃度為5.00 nmol/μL,作為上機(jī)測定用的氨基酸標(biāo)準(zhǔn),用氨基酸自動(dòng)分析儀以外標(biāo)法測定樣品液的氨基酸種類和含量。

1.3.4 膠原和明膠的二級結(jié)構(gòu)測定

光學(xué)活性物質(zhì)對左旋圓偏振光和右旋圓偏振光的吸收率不同,當(dāng)平面偏振光通過具有手性的樣品之后會變成橢圓偏振光[12]。利用該原理,使用圓二色譜測定膠原和明膠分子的二級結(jié)構(gòu)。將膠原溶液和明膠溶液的質(zhì)量濃度稀釋至0.16 mg/mL,混合樣品在50 ℃下平衡1 h,同時(shí)在50 ℃下,取0.2 mL溶液于1 mm樣品池中通過圓二色譜儀(CD)對膠原和明膠的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行測量,測量溫度保持在50 ℃,氮?dú)獯祾吡魉贋?5 mL/min。在190～260 nm范圍內(nèi)記錄光譜,分辨率為0.2 nm,共掃描6次。

2 結(jié)果與討論

2.1 型膠原和明膠對羥基自由基的清除

本實(shí)驗(yàn)所使用的I型膠原來源于豬皮,明膠來源于I型膠原的水解產(chǎn)物。將I型膠原和明膠分別配置質(zhì)量濃度為2～12 mg/mL的I型膠原、明膠水溶液,按照實(shí)驗(yàn)步驟中敘述的方法,與硫酸亞鐵溶液、過氧化氫溶液和水楊酸溶液混合,測定混合液在530 nm的吸光度,結(jié)果如圖2所示,自由基的被清除能力隨著I型膠原和明膠的濃度增加(從2 mg/mL增加到12 mg/mL)而增加。I型膠原濃度為2 mg/mL時(shí)羥基自由基清除率為46%,12 mg/mL時(shí)羥基自由基清除率為53%;明膠濃度為2 mg/mL時(shí)羥基自由基清除率為81%,12 mg/mL時(shí)羥基自由基清除率為96%。研究結(jié)果表明,相比于I型膠原,明膠清除羥基自由基的能力更強(qiáng)。

2.2 羥基自由基清除機(jī)理探索

2.2.1 I型膠原和明膠分子上氨基酸分析

通過氨基酸分析儀對I型膠原和明膠進(jìn)行氨基酸組成成分分析,測定結(jié)果如表1所示。I型膠原分子中甘氨酸含量為27.36%,脯氨酸含量13.39%,酪氨酸含量1.86%,天冬氨酸含量4.19%,賴氨酸含量2.83%,谷氨酸含量7.28%,丙氨酸含量6.84%,組氨酸含量0.5%,精氨酸含量6.23%。

表1 膠原和明膠所含氨基酸種類及含量

明膠分子中甘氨酸含量21.74%,脯氨酸含量12.15%左右,酪氨酸含量0.59%,天冬氨酸含量5.28%,賴氨酸含量3.69%,谷氨酸含量10.78%,丙氨酸含量9.48%,組氨酸含量0.66%,精氨酸含量8.08%。

將I型膠原和明膠分子中具有清除羥基自由基能力的的氨基酸進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn),相對含量差異不大。可以推斷,I型膠原和明膠分子中氨基酸的種類和相對含量不是影響其清除自由基能力的關(guān)鍵。

2.2.2 I型膠原和明膠的二級結(jié)構(gòu)分析

膠原是由3條多肽α鏈組成的三聚體分子,含有特征性重復(fù)序列(Gly-X-Y)n,X常為脯氨酸,Y常為羥脯氨酸。膠原的單體是前膠原經(jīng)過加工形成的膠原,其分子以α-螺旋結(jié)構(gòu)存在,如圖3所示[8]。

圖3 膠原結(jié)構(gòu)示意圖

明膠是膠原的水解產(chǎn)物,水解過程中膠原分子被無規(guī)切斷,其分子中包含α鏈、β鏈和γ鏈。對不同濃度的明膠溶液進(jìn)行了CD表征,并采用峰回歸計(jì)算方法和CONTIN擬合程序?qū)Χ壗Y(jié)構(gòu)含量進(jìn)行了計(jì)算,其結(jié)果如表2所示。水溶液中明膠分子二級結(jié)構(gòu)包含α-螺旋、β-回轉(zhuǎn)、β-折疊、β-反折疊,任意卷曲五種結(jié)構(gòu)。其中隨著明膠質(zhì)量濃度的從2 mg/mL增加到12 mg/mL,各指標(biāo)呈現(xiàn)增大趨勢,在質(zhì)量濃度為12 mg/mL時(shí)達(dá)到最大;其中,β-回轉(zhuǎn)、β-折疊、β-反折疊,任意卷曲四種結(jié)構(gòu)含量越多,表明分子越伸展,越有利于氨基酸暴露。

表2 明膠質(zhì)量濃度對其二級結(jié)構(gòu)的影響

CD結(jié)果表明,β-回轉(zhuǎn)、β-反折疊、β-折疊以及任意卷曲結(jié)構(gòu)含量總和遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于α-螺旋,表明明膠分子鏈處于較高伸展度,有利于氨基酸暴露,有利于清除自由基。明膠質(zhì)量濃度為12 mg/mL時(shí),上述結(jié)構(gòu)總和達(dá)到最大。結(jié)合文獻(xiàn)[13],繪制出膠原解螺旋成明膠的結(jié)構(gòu)示意圖,如圖4所示。

圖4 膠原分子向明膠分子轉(zhuǎn)變的結(jié)構(gòu)變化

由此可見,明膠分子的二級結(jié)構(gòu)松散,其中的氨基酸基團(tuán)大量暴露,這導(dǎo)致其溶液中游離的羥基自由基有很大機(jī)會可以和這些氨基酸基團(tuán)結(jié)合,從而被清除;而膠原的三條肽鏈聚合在一起,其中的氨基酸基團(tuán)暴露的相對較少,其溶液中游離的羥基自由基有很小機(jī)會可以和這些氨基酸基團(tuán)結(jié)合,限制了自由基的被清除機(jī)會。因此,明膠對羥基自由基的清除率明顯高于膠原對羥基自由基的清除率。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以豬皮中提取的I型膠原為研究對象,通過水解得到明膠。對比研究了膠原和明膠清除羥基自由基的能力,結(jié)果表明,膠原和明膠均對羥基自由基具有清除能力,且與濃度呈正相關(guān),該結(jié)論與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

明膠清除自由基的能力明顯優(yōu)異。通過分析I型膠原和明膠分子中氨基酸種類及含量,結(jié)果表明,這不是造成二者清除自由基能力差異的關(guān)鍵。繼續(xù)進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)研究,CD結(jié)果表明,明膠分子包含α-螺旋、β-回轉(zhuǎn)、β-折疊、任意卷曲四種結(jié)構(gòu),其中β-回轉(zhuǎn)、β-折疊、任意卷曲結(jié)構(gòu)含量總和遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于α-螺旋,表明明膠分子鏈處于較高伸展度,有利于氨基酸暴露,有利于清除自由基。膠原清除自由基的能力明顯弱于明膠。由于膠原的三條肽鏈聚合在一起,氨基酸基團(tuán)和自由基結(jié)合并清除自由基的機(jī)會被限制。