劉 馨 文 明 袁 陽(yáng)

貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025

禽流感病毒是威脅家禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一類重要病原，可造成家禽養(yǎng)殖業(yè)巨大經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球感染H5N1 型禽流感超1 000 例，感染H7N9 近3 000 例，死亡率高達(dá)40%[1]。因此，加強(qiáng)禽流感病毒的監(jiān)測(cè)和防治對(duì)保障家禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展及公共衛(wèi)生安全具有重要意義。目前，用于禽流感血清學(xué)檢測(cè)的方法包括血凝和血凝抑制試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)以及中和試驗(yàn)等，其中血凝和血凝抑制試驗(yàn)利用標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，被廣泛用于禽流感病毒的臨床檢測(cè)。畢節(jié)市作為貴州省西北部的一個(gè)生態(tài)養(yǎng)殖類大市，家禽養(yǎng)殖業(yè)正處于蓬勃發(fā)展階段[2]。本研究通過(guò)對(duì)畢節(jié)市中小型養(yǎng)禽場(chǎng)血清的抗體水平以及同一養(yǎng)禽場(chǎng)不同時(shí)間段進(jìn)行檢測(cè)，充分掌握畢節(jié)市中小型養(yǎng)禽場(chǎng)禽流感免疫數(shù)據(jù)，以期為后期指定免疫程序提供參考，有效提升養(yǎng)禽場(chǎng)的免疫程序合理性，為禽流感的預(yù)防和監(jiān)測(cè)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

16 家中小型養(yǎng)禽場(chǎng)血清樣本由畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供，其中，采集中型養(yǎng)殖場(chǎng)血清樣本均為10 份，小型養(yǎng)殖場(chǎng)血清樣本4～9份不等，共計(jì)140 份；2020年8月、2020年12月和2021年4月3 個(gè)季度月由畢節(jié)市A 場(chǎng)提供，不同時(shí)間段血清樣本數(shù)量分別為17、50 和60 份，共計(jì)127份。

1.2 方 法

1）樣品采集。翅靜脈采取2 mL/只雞全血，等量裝入離心管中2 000 r/min 離心5 min。待離心結(jié)束后，用滴管吸取上清液，按序標(biāo)號(hào)（注意避免溫度過(guò)低造成樣品呈果凍樣從而無(wú)法析出血清），置于-20 ℃冰箱內(nèi)待檢。

2）HA-HI 試驗(yàn)。HA 試驗(yàn)中取一次性96 孔V 型微量反應(yīng)板，于1～12 孔中依次分別加入0.025 mL PBS溶液；吸取0.025 mL 標(biāo)準(zhǔn)病毒原液加入第1 孔中，反復(fù)吹打數(shù)次混勻；從第1 孔吸取0.025 mL 病毒液加入第2 孔，吸取0.025 mL 加入第3 孔，重復(fù)上述操作，依此倍比稀釋至第11 孔，混勻后吸取0.025 mL 棄之。第12 孔留做空白對(duì)照；吸取0.025 mL PBS 依次加入；充分混勻紅細(xì)胞懸液，依次加入0.025 mL 體積分?jǐn)?shù)1%的雞紅細(xì)胞懸液；振蕩混勻，于2～8 ℃下靜置45～60 min 觀察結(jié)果。而HI 試驗(yàn)則利用相同原理倍比稀釋后吸取0.025 mL 4HAU 抗原依次于1～11 孔加入，于20～25 ℃室溫下靜置30 min；每孔依次加入0.025 mL 體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞溶液，震蕩均勻后靜置30 min 觀察結(jié)果，紅細(xì)胞將呈明顯紐扣狀沉淀。

2 結(jié)果與分析

2.1 16 家中小型養(yǎng)禽場(chǎng)血清抗體水平

經(jīng)調(diào)查顯示（表1）：140 份受檢血清樣本中，H5亞型禽流感血清抗體陽(yáng)性為110 份，H7 亞型禽流感血清抗體陽(yáng)性為104 份；H5 亞型平均陽(yáng)性率為77.74%，H7 亞型平均陽(yáng)性率為73.66%。以群體免疫陽(yáng)性率達(dá)75%及以上者定義為合格，16 個(gè)中小型養(yǎng)禽場(chǎng)中，H5 亞型血清抗體5 個(gè)不合格，H7 亞型血清抗體6 個(gè)不合格，平均合格率分別為68.75%和62.5%。

表1 畢節(jié)市16 家中小型養(yǎng)禽場(chǎng)血清抗體水平

16 家中小型養(yǎng)禽場(chǎng)H5 亞型禽流感血清抗體水平陽(yáng)性率最高為100%，最低為0%，其中8 家養(yǎng)禽場(chǎng)抗體水平達(dá)100%，2 家抗體水平為0%（圖1）。H7 亞型禽流感血清抗體水平最高陽(yáng)性率為100%，最低為0%，其中有8 家養(yǎng)禽場(chǎng)抗體水平達(dá)100%，有2 家抗體水平為0%（圖2）。

圖1 16 家養(yǎng)禽場(chǎng)H5 亞型血清抗體陽(yáng)性率

圖2 16 家養(yǎng)禽場(chǎng)H7 亞型血清抗體陽(yáng)性率

140 份受檢血清樣本中，H7 亞型抗體效價(jià)為8的血清樣本共44 份，而抗體效價(jià)為1、9 和10 的血清樣本為0 份（表3）。

2.2 A 場(chǎng)不同時(shí)間點(diǎn)血清抗體水平

對(duì)2020年8月、2020年12月以及2021年4月的3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)共檢測(cè)血清樣本127 份。其中H5陽(yáng)性數(shù)為120 份，平均陽(yáng)性率為94.13%；H7 陽(yáng)性數(shù)為127 份，平均陽(yáng)性率為100%。以群體免疫達(dá)75%以上定義為合格，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 種高致病性血清亞型均為合格。其中，A 場(chǎng)H5 亞型血清抗體水平在2020年8月、12月2021年4月分別為94.1%、90.0%和98.3%，H7 亞型血清抗體呈穩(wěn)定狀態(tài)，在2020年8月、12月和2021年4月均為100%（表2）。

表2 A 場(chǎng)不同時(shí)間點(diǎn)血清抗體水平

3 討 論

對(duì)畢節(jié)市16 家中小型養(yǎng)禽場(chǎng)高致病性禽流感調(diào)查發(fā)現(xiàn)，H5 亞型血清抗體的平均陽(yáng)性率為77.74%，H7 亞型血清抗體的平均陽(yáng)性率為73.66%。以群體免疫比例為75%及其以上定義為符合標(biāo)準(zhǔn)，則H5 亞型血清抗體水平合格率為68.75%，H7 亞型血清抗體合格率為62.5%；畢節(jié)市16 家中小型養(yǎng)禽場(chǎng)H5 血清抗體分布中，HI 效價(jià)為8 的比例最高，為44%，HI 效價(jià)為5 最低，為3%。未發(fā)現(xiàn)HI 效價(jià)為1、9 和10 的存在；畢節(jié)市16 家中小型養(yǎng)禽場(chǎng)H7 血清抗體分布中，HI 效價(jià)為8 的比例最高，為31%，而HI 效價(jià)為0 僅次于8，占比為21%，HI 效價(jià)為2 最低，為2%。未發(fā)現(xiàn)HI 效價(jià)為1、9 和10 的存在；對(duì)A 場(chǎng)不同季節(jié)的血清學(xué)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，血清抗體水平隨檢測(cè)時(shí)間的變化而變化：冬季時(shí)期（12月）H5 亞型血清抗體水平最低，而春秋季時(shí)期（8月、4月）血清抗體水平較高。