陳柏安，劉東超,2，王思盼

(1.廣東海洋大學水產(chǎn)學院，廣東 湛江 524088；2.廣東省藻類養(yǎng)殖及應用工程技術中心，廣東 湛江 524025)

大型海藻具有效吸收水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中大量氮、磷等營養(yǎng)鹽的功能，學界將其作為生物濾器開展了養(yǎng)殖水環(huán)境的生物修復研究，取得較好效果[1]。不同種類的大型海藻對水中溶解氮的生物過濾效果不同[2]。海藻對氮源的吸收還受環(huán)境參數(shù)(光、鹽度、溫度、干燥和水運動)，海藻生物學特性、組織營養(yǎng)史、營養(yǎng)物質濃度及化學形態(tài)等因素的影響[3-5]。鹽度是影響藻類生長和分布的重要環(huán)境因子之一[6-7]，但僅見少量有關鹽度對大型海藻吸收氮營養(yǎng)鹽影響的研究，未見關于不同鹽度條件下大型海藻氮營養(yǎng)鹽吸收動力學的報道。

長莖葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）是一種生長速度快、經(jīng)濟價值高的可食用大型綠藻，其生存鹽度為20～50，在鹽度35 時生長速率最大，鹽度低于25 時光合作用受抑制[6]，鹽度對其生長發(fā)育有顯著影響[8]。在適宜NH4-N、NO3-N 比例的條件下，長莖葡萄蕨藻對NO3-N 有顯著的吸收和同化能力，有望有效控制水體硝酸氮濃度并將硝酸氮轉移到生物體中[9]。長莖葡萄蕨藻與魚蝦混養(yǎng)，對養(yǎng)殖水環(huán)境有顯著改善作用[10,11]。但該藻的氮營養(yǎng)生理學過程尚不明確，尤其是在不同鹽度和高濃度氮營養(yǎng)鹽條件下，該藻對不同化學形態(tài)氮鹽的吸收規(guī)律研究尚少。本研究分析在不同鹽度下長莖葡萄蕨藻對氨氮和硝態(tài)氮的吸收動力學特征，為構建以長莖葡萄蕨藻為生物濾器的水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

長莖葡萄蕨藻于2021 年4 月購自廣東省深圳市藍汀鼎執(zhí)生物有限公司，藻體用消毒海水沖洗，清除藻體上的附生生物及雜物，于室內盛有消毒海水的塑料箱中暫養(yǎng)7 d，培養(yǎng)條件為溫度（22±1）℃，照度（2 000±100）lx，光/暗周期12 h L/12 h D，營養(yǎng)鹽為0.5 mmol/L 的NaNO3溶液和0.1 mmol/L 的KH2PO4溶液，海水鹽度30±1。實驗前，選擇健壯、完整的長莖葡萄蕨藻藻體，仔細去除表面附著物后進行48 h的氮饑餓處理[12]。實驗用海水取自湛江霞山近岸海域，其本底氨氮質量濃度為0.04 mg/L，硝酸氮質量濃度為0.03 mg/L，活性磷質量濃度為0.02 mg/L，pH為8.06。海水經(jīng)濾袋過濾、消毒后，使用海藻吸收水體營養(yǎng)鹽12 h，儲存在水桶中備用。

1.2 實驗設計

實驗容器為2 L 的塑料桶，每桶加入2 L 實驗海水，各放入（10±1）g的處于N 饑餓狀態(tài)的新鮮長莖葡萄蕨藻。根據(jù)王海陽等研究[13]及本研究預實驗結果，長莖葡萄蕨藻在鹽度高于35 或低于25 時生長受抑制并出現(xiàn)部分藻體軟化現(xiàn)象，因此設置25、30和35 等3 個鹽度梯度，進行NH4+-N 和NO3–-N 吸收實驗。實驗海水的鹽度為30，用蒸餾水或自然海鹽調節(jié)鹽度。將單一氮源的NH4+-N（NH4Cl）或NO3–-N（NaNO3）分別添加入實驗海水中。根據(jù)預實驗結果，NH4+-N 和NO3–-N 均按終末質量濃度設置0、2、4、6、8、10、12 mg/L 等7 個梯度，每個梯度設置3 個重復。實驗海水中加入KH2PO4作為磷源，海水磷濃度達到4 mg/L，使海藻不會因缺磷而影響氮吸收[14]。各處理組均在光照培藻架上培養(yǎng)，照度為3 000 lx，溫度為（22±1）℃。根據(jù)預實驗結果，在0、1、2、3 h時測定海水氮營養(yǎng)鹽含量，用海水中的氮營養(yǎng)鹽下降量換算出氮營養(yǎng)鹽的吸收速率。實驗用藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.3 數(shù)據(jù)分析

長莖葡萄蕨藻吸收氮鹽速率(v)計算：

式中，Nt為培養(yǎng)th時水體的營養(yǎng)鹽濃度，V為取樣前水體的體積，m為實驗開始時藻體的鮮質量。

NH4-N 使用SmartChem 200 全自動間斷化學分析儀測定，NO3-N用鋅鎘還原-重氮偶氮法測定[15]。數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差(SD)表示，采用Graphpad Prism 7進行非線性回歸擬合并作圖，最大吸收速率（vmax）和米氏常數(shù)（Km）用米氏動力學方程擬合求得。使用如下公式計算米氏動力學方程[16]：

式中，v為吸收速率（μg·g-1·h-1），vmax為最大吸收速率（μg·g-1·h-1），ρs為介質中營養(yǎng)鹽質量濃度（μg/L），Km為半飽和常數(shù)（μg/L）。

用軟件SPSS 24 分析相同營養(yǎng)鹽形式下長莖葡萄蕨藻在不同鹽度下吸收動力學參數(shù)的差異以及相同營養(yǎng)鹽濃度下藻株不同氮源吸收速率的差異，若差異顯著則進行Duncan’s多重比較。顯著水平α=0.05。

2 結果

2.1 鹽度對長莖葡萄蕨藻硝態(tài)氮吸收的影響

圖1顯示，不同時間段的吸收曲線略有差異，但總的變化趨勢相似。在不同鹽度下，長莖葡萄蕨藻對NO3–-N 的吸收速率均隨培養(yǎng)介質中硝態(tài)氮濃度的增加總體上呈增加趨勢。表1 可見，隨著時間的增加，硝酸氮最大吸收速率（vmax）總體上呈下降趨勢，鹽度25、35 時，1 h 的硝酸氮最大吸收速率（vmax)顯著高于2、3 h（P<0.05），鹽度30 組1、2、3 h 的vmax分 別 為 (179.8±17.4)、(141.10±13.82)、(150.7±24.1)μg/(g·h)，平均值分別高于其他鹽度組，但差異不顯著（P>0.05）。在相同時段，鹽度對長莖葡萄蕨藻硝態(tài)氮吸收速率的影響不顯著（P>0.05）。長莖葡萄蕨藻在1 h 時，硝態(tài)氮濃度在4 mg/L 時吸收速率便趨于平緩，而在3 h 時，硝態(tài)氮濃度達到6～8 mg/L時，吸收速率才趨于平緩。

圖1 不同鹽度下長莖葡萄蕨藻硝態(tài)氮的吸收曲線Fig.1 Absorption curve for nitrate nitrogen in Caulerpa lentillifera at different salinities

2.2 鹽度對長莖葡萄蕨藻氨氮吸收的影響

圖2 顯示，在不同鹽度下，長莖葡萄蕨藻對NH4+-N 的吸收速率均隨培養(yǎng)介質中氨氮濃度的增加總體上呈上升趨勢。表1可見，在低鹽度下，長莖葡萄蕨藻對氨氮最大吸收速率較高，鹽度25 時，vmax為(435.2±57.2) μg/(g·h)，顯著高于鹽度35 時（P<0.05）。在高氮濃度下（12 mg/L），低鹽度組氨氮吸收速率相對于鹽度35 組有增加趨勢，培養(yǎng)1、2 h 時顯著高于鹽度35組（P<0.05）（圖2）。在各鹽度組，1 h的氨氮最大吸收速率顯著高于3 h（P<0.05），2 h時，鹽度25與鹽度30最大吸收速率無顯著差異（P>0.05），鹽度35 組顯著低于其他兩組（P<0.05）。在3 h時，各鹽度組長莖葡萄蕨藻的最大氨氮速率無顯著差異（P>0.05）。

表1 長莖葡萄蕨藻不同鹽度的氮鹽吸收動力學參數(shù)比較Table 1 Nitrogen uptake kinetics parameters of Caulerpa lentillifera at different salinities

圖2 不同鹽度下長莖葡萄蕨藻氨氮的吸收曲線Fig.2 Absorption curve for ammonia nitrogen in Caulerpa lentillifera at different salinities

2.3 不同鹽度下長莖葡萄蕨藻對硝酸氮和氨氮吸收動力學參數(shù)的比較

3 種鹽度下長莖葡萄蕨藻對NH4+-N 和NO3–-N的vmax和Km見表1。1 h 時，長莖葡萄蕨藻對氨氮與硝酸氮的vmax均呈現(xiàn)低鹽度>高鹽度趨勢，但大多數(shù)組別差異不明顯，僅在氨氮的vmax上低鹽度（25、30）顯著高于高鹽度組（35）。長莖葡萄蕨藻對硝酸氮吸收的半飽和常數(shù)總體上大于氨氮的半飽和常數(shù)，且在不同鹽度下，硝酸氮在不同時段的Km差異較大（P<0.05），而吸收時間和鹽度對長莖葡萄蕨藻氨氮吸收的半飽和常數(shù)無顯著影響（P>0.05）。

3 討論

3.1 鹽度對大型海藻吸收氮鹽的影響

鹽度影響植物細胞內外的滲透壓，進而影響細胞水分及對N、P 的吸收。不同大型海藻中，鹽度對其吸收氮營養(yǎng)鹽的影響不盡相同。在冷水性海帶（Saccharina latissima）和掌狀海帶（Laminaria digi‐tata）對NO3–-N 吸收研究中，低鹽度（18）比高鹽度（34）分別增加47%和33%[17]。天然海水鹽度降低到一半時，齒緣墨角藻（Fucus serratus）對NO3–-N 的吸收增加40%，而墨角藻（Fucus vesiculosus）和掌狀海帶（L.digitata）則無顯著影響[18]。細基江蘺繁枝變種（Gracilaria tenuistipitatavar.liui）在較低鹽度下(10～30)對NH4+-N 的吸收速率大于高鹽度(40)[19]。本研究表明，在較高氮質量濃度（12 mg/L）條件下，長莖葡萄蕨藻對NH4+-N 的吸收速率呈現(xiàn)為低鹽度（25）高于高鹽度（35），而鹽度對硝酸氮的吸收速率無顯著影響。在實際應用中，長莖葡萄蕨藻生長海域鹽度多為35，本研究中該藻吸收氮鹽的最適鹽度略低于最適生長鹽度，這可能是因為在低鹽度條件下，藻體可快速吸收營養(yǎng)物質，用于生長和短期的滲透壓調節(jié)。Roleda 等[4]提出海水中高營養(yǎng)物濃度和低鹽度的交互作用可彌補低鹽度任何獨立負面影響的假設，本研究結果可為該假設提供一定佐證。

在實際生產(chǎn)中，養(yǎng)殖戶多利用原位海域養(yǎng)殖長莖葡萄蕨藻，陸基水體養(yǎng)殖一般采用室內工廠化水池（箱）的養(yǎng)殖方式[20]。實際應用時，可根據(jù)海水鹽度條件，單養(yǎng)長莖葡萄蕨藻或與適宜的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物混養(yǎng)。本研究雖有鹽度25 下氨氮吸收速率較高的結論，但在鹽度30 的條件下，長莖葡萄蕨藻對氮鹽亦有較高的營養(yǎng)鹽吸收性能，因此，本研究結果可為長莖葡萄蕨藻原位海域養(yǎng)殖或陸基池塘養(yǎng)殖提供參考。

在鹽度31 條件下，針葉蕨藻（Caulerpa sertular‐ioides）氨氮最大吸收速率為4.15 μmoL/(g·h)[21]，而本研究中長莖葡萄蕨藻的氨氮最大吸收速率可達(31.09±4.11)μmol/(g·h)[435 μg/(g·h)]，表明相近鹽度下蕨藻屬不同物種對氨氮吸收能力存在差異。

3.2 長莖葡萄蕨藻對氮鹽的吸收動力學特征

營養(yǎng)吸收動力學是一種推斷吸收機制的有效方法，可確定海藻的營養(yǎng)鹽吸收速率與營養(yǎng)鹽濃度的關系[4]，以此評估海藻在綜合養(yǎng)殖系統(tǒng)中的應用潛力。營養(yǎng)吸收動力學研究聚焦于營養(yǎng)鹽吸收過程中的吸收機制，若僅僅為被動擴散，吸收速率直接與電化學勢梯度(即外界營養(yǎng)鹽濃度) 呈線性關系，而易化擴散和主動傳遞則隨外界營養(yǎng)鹽濃度的增加表現(xiàn)出膜載體的飽和現(xiàn)象[22]。

海藻對NO3–-N 的吸收是需能的主動運輸過程，在植物代謝過程中受基因高度調控[23]。邵魁雙等[24]報道，緣管滸苔（Enteromorpha linza）和羽藻（Bryopsis plumosa）對NO3–-N 的吸收方式為主動運輸。長莖葡萄蕨藻對NO3–-N 有較強的親和力[9]。本研究表明，不同鹽度下，長莖葡萄蕨藻對NO3–-N的吸收速率隨硝酸氮濃度的升高而升高，當硝酸鹽達到一定濃度，吸收速率趨于穩(wěn)定，符合主動運輸?shù)娘柡臀談恿W規(guī)律。這與一般大型海藻對硝酸氮的吸收為飽和吸收動力學特征的結論一致。

海藻對NH4+-N 的吸收速率隨時間和物種的不同而不同。海藻對氨氮的轉運包含兩個獨立的轉運系統(tǒng)，即氨氮在濃度低時通過被動擴散進入藻體細胞，以及通過藻體細胞上跨膜運輸?shù)鞍字鲃舆\輸進入藻細胞[25]。自然海水中氨氮濃度較低，海藻對NH4+-N 的吸收主要為主動運輸，但更多是主動運輸與被動運輸?shù)慕Y合[26]。部分大型海藻對氨氮的吸收速率隨著氨氮濃度和吸收表面積的增大呈線性增長，這表明部分海藻對氨氮的吸收屬于被動吸收[27]。對于大型海藻對氨氮的吸收是否遵循飽和吸收動力學，可能與海藻生長的地理位置、生理代謝活動和種間差異有關[28]。Taylor 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，新西蘭東北部的5 種海藻中，僅雞毛菜（Pterocladia capillacea）對氨氮吸收表現(xiàn)出飽和吸收動力學特征，Xiphophora chondrophylla、石莼（Ulvasp.)、紫菜(Porphyrasp.) 和滸苔（Enteronlorphasp.）的氨氮吸收速率與氨氮濃度則呈線性關系，而其他地區(qū)的Neoagardhiella baileyi、Gracilaria foliifera等海藻對NH4+-N 吸收表現(xiàn)出飽和吸收動力學的特征。本研究表明，長莖葡萄蕨藻對NH4+-N 吸收表現(xiàn)出飽和吸收動力學特征，這可能是因為長莖葡萄蕨藻分枝上有較多囊狀小球，比表面積較高，使長莖葡萄蕨藻在低氨氮濃度下也能通過主動運輸而較快吸收氨氮，而當胞內氨水平較高時，同化的氨會對攝取行為產(chǎn)生負反饋[29]。針葉蕨藻（Caulerpa sertulari‐oides）對NH4+-N 吸收亦表現(xiàn)出飽和吸收動力學特征[29]，與本研究結果一致，可能與兩者分布的地理位置相同有關。

3.3 不同鹽度下長莖葡萄蕨藻對兩種形式氮鹽的吸收利用

一般地，海藻主要利用硝態(tài)氮(NO3–-N)、氨氮(NH4+-N)和尿素等3種形式的氮。硝酸氮和氨氮是大型海藻最主要的氮源，氨氮比硝酸氮和亞硝酸氮更易吸收[30]。了解海藻對特定營養(yǎng)物的吸收模式和偏好是優(yōu)化綜合水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)結構的關鍵。研究表明，與NO3–-N 相比，許多海藻更優(yōu)先吸收NH4+-N[23]，然而，也有部分海藻在自然環(huán)境中優(yōu)先吸收其他形態(tài)的氮源。Li 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，中國黃海滸苔（Ulva prolifera）優(yōu)先利用海水中的硝酸氮，其次是氨氮。海藻對氨氮與硝態(tài)氮的偏好可能與營養(yǎng)鹽在海藻中的傳遞和同化方式有關。本研究表明，長莖葡萄蕨藻對氨氮的最大吸收速率和半飽和常數(shù)皆優(yōu)于硝態(tài)氮，說明長莖葡萄蕨藻會優(yōu)先吸收氨氮作為氮源，這與大多數(shù)海藻相似[32]，但也有研究表明長莖葡萄蕨藻在NH4+-N 與NO3–-N 共存時，更傾向于優(yōu)先選擇NO3–-N[9]，這可能與海藻的生長狀態(tài)和環(huán)境因子密切相關。硝酸氮的吸收和同化過程的耗能高于氨氮，氨氮進入藻細胞后可直接被同化，而硝酸氮進入后還需進行一系列的耗能還原反應方被利用[33]。進一步了解氨氮和硝酸氮在海藻中的吸收規(guī)律，對估計海藻氮吸收和提高海藻生產(chǎn)力有著重要意義。

4 結論

長莖葡萄蕨藻在不同鹽度下對硝態(tài)氮和氨氮的吸收符合飽和吸收動力學特征，其對氨氮、硝態(tài)氮的吸收速率隨著濃度的上升而逐步上升。長莖葡萄蕨藻對氨氮的最大吸收速率顯著高于硝態(tài)氮的最大吸收速率，是硝態(tài)氮的2.4 倍。不同鹽度（25～35）對長莖葡萄蕨藻硝態(tài)氮吸收無顯著影響，但對氨氮的吸收有顯著影響，在較低鹽度（25）下，氨氮的吸收速率較高。本研究明確長莖葡萄蕨藻對硝態(tài)氮和氨氮在不同鹽度下的吸收規(guī)律，可為長莖葡萄蕨藻作為水產(chǎn)養(yǎng)殖生物濾器，選擇適宜混養(yǎng)水產(chǎn)養(yǎng)殖動物，構建陸基綜合水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)提供理論依據(jù)。