何苑琳，鄭兆婉，周春霞,3，洪鵬志,3

（1.廣東海洋大學食品科技學院/廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室/廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心/廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心/廣東省海洋生物制品工程實驗室，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學化學與環(huán)境學院，廣東 湛江 524088；3.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學，遼寧 大連 116034）

皮膚光老化指的是由外部條件引起的皮膚老化，主要由慢性紫外照射所引起[1，2]。紫外線輻射是一種完全致癌物，輻射中的UVA 和UVB 均可誘導細胞凋亡，從而引起皮膚外觀表征和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。UVB 可直接造成細胞DNA 損傷生成嘧啶二聚體，較UVA 來講對表皮細胞的毒性更強，損傷程度更大，是導致人類皮膚癌的主要致癌物[3，4]。持續(xù)UVB 照射可誘導細胞產(chǎn)生氧化應激，通過NF-κB 信號通路導致基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達上調(diào)，從而使皮膚膠原蛋白的合成水平下降，最終表現(xiàn)為皮膚光老化[5]。

應對皮膚光老化的問題日漸受到重視，對抗光老化產(chǎn)品的原料選擇也成為熱題。湛江等鞭金藻（Isochrysis zhanjiangensis）廣泛分布于中國南部湛江灣地區(qū)，富含多不飽和脂肪酸[6]。在已有研究中，湛江等鞭金藻可生產(chǎn)生物柴油[7]、低碳烯烴[8]、巖藻黃素[9]等，但對其生理活性的研究較少。本實驗室前期從湛江等鞭金藻中提取獲得五肽（AYAPE）[10]，研究發(fā)現(xiàn)其具有較強的自由基清除能力和抗氧化性能[10]，從中提取的部分多肽還具有抑制酒精性肝病[10]和抗高血壓的生理活性[11]?；诖?，本研究將通過研究從湛江等鞭金藻中提取的多肽（AYAPE）對經(jīng)UVB 照射的HaCaT 細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶、人Ⅰ型前膠原和凋亡相關(guān)蛋白等的影響，以驗證AYAPE具備抗光老化活性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

人永生化角質(zhì)形成細胞HaCaT，上海澳音生物科技有限公司；MMP-1 ELISA 試劑盒、人Ⅰ型前膠原（PCI）ELISA試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；小鼠多克隆抗體p65（sc-8008）、p-p65（sc-136548）、β-Actin（sc-47778），美國Santa Cruz Biotechnology；Caspase-3（#14220）、Cleaved Caspase-3（#9661）、Caspase-9（#9508）、Cleaved Caspase-9（#20750）、羊抗鼠IgG-HRP（#7076）、羊抗兔IgG-HRP（#7074），美國Cell signaling Technology。

UVB 照射燈（荷蘭皇家飛利浦電子公司）；酶標儀（伯騰儀器公司）；倒置顯微鏡（廣州吉迪有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad 公司）；小型垂直電泳系統(tǒng)（Bio-Rad 公司）；化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 HaCaT 細胞培養(yǎng)及光老化模型的建立 采用完全培養(yǎng)基［含有體積分數(shù)10%的胎牛血清（FBS）］，終濃度為1 μmol/L 的青霉素和鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基），將HaCaT 細胞培養(yǎng)在37 ℃下含有體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中。將處于生長指數(shù)期的細胞接種在不同規(guī)格的培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng)，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS，濃度為0.01 mol/L，pH=7.4）清洗細胞后根據(jù)實驗需要將細胞分為5 組，空白組不經(jīng)UVB照射且不添加樣品，對照組和3 個樣品實驗組（10+UVB 組、20+UVB 組、50+UVB 組）中分別加入終濃度為0、10、20、50 μmol/L 的AYAPE 處理2 h，用PBS 清洗細胞3 次后采用40 mJ/cm2的UVB 照射處理細胞，培養(yǎng)24 h后用于實驗。

1.2.2 細胞活性測定 不同濃度的AYAPE對HaCaT細胞活力的影響：將細胞接種在96孔板中（200 μL/孔），在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2的條件下培養(yǎng)24 h，將細胞分為空白組、10 組、20 組、50 組、100 組、150 組，并對其進行相應濃度的AYAPE（0、10、20、50、100、150 μmol/L）處理2 h，并培養(yǎng)24 h 后根據(jù)CCK-8 試劑盒說明書，向每孔加入10 μL 的CCK 溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min后，用酶標儀測定在450 nm處的光密度。

不同濃度AYAPE（0、10、20、50、100 μmol/L）對UVB照射后HaCaT細胞活力的影響：將細胞接種在96孔板中（200 μL/孔），經(jīng)37 ℃、體積分數(shù)5%CO2的條件培養(yǎng)24 h，將細胞分為空白組、對照組、10+UVB組、20+UVB 組、50+UVB 組、100+UVB 組，對不同樣品組進行相應濃度的AYAPE 處理，2 h 后用40 mJ/cm2的UVB 照射細胞，培養(yǎng)24 h，根據(jù)CCK-8試劑盒說明書操作，測定細胞在450 nm處的光密度。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附測定分泌蛋白含量 將約1×106個細胞接種60 mm 培養(yǎng)皿中，細胞待培養(yǎng)后，經(jīng)AYAPE（0、10、20、50 μmol/L）處 理 和40 mJ/cm2UVB照射，培養(yǎng)24 h后，取其上清，在4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液。用BCA 蛋白定量試劑盒對上清液中的蛋白進行定量，確定終濃度為10 μg/mL。根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒說明書測定分泌蛋白MMP-1和Ⅰ型前膠原（PCI）的表達水平。

1.2.4 免疫組化染色測定核內(nèi)p53蛋白水平 在35 mm

培養(yǎng)皿中接種細胞，置于含有體積分數(shù)5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，經(jīng)AYAPE 和UVB 照射處理，并應激24 h 后，用預冷后的PBS 對細胞進行清洗，采用體積分數(shù)4%的多聚甲醛在4 ℃下將細胞固定30 min，用體積分數(shù)0.3%的聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）在4 ℃下對細胞通透30 min，再用體積分數(shù)5%牛血清白蛋白（BSA）在常溫下封閉1 h，加入含體積分數(shù)1%的BSA 的p53 抗體在4 ℃下孵育12～16 h，洗去一抗加入熒光二抗，避光孵育2 h，加入細胞骨架紅色熒光探針（Actin Red）孵育1 h，最后加入含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗淬滅熒光封片液，并在熒光顯微鏡下拍照記錄。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測胞內(nèi)蛋白表達 用不同濃度的AYAPE（0、10、20、50 μmol/L）處理和40 mJ/cm2UVB 照射HaCaT 細胞，24 h 后舍棄上清，PBS 清洗3 次，用含有體積分數(shù)1% 苯甲基磺酰氟（PMSF，蛋白酶抑制劑）的RIPA裂解液裂解細胞。裂解后的細胞蛋白經(jīng)4 ℃、12 000 r/min 條件離心10 min，收集上清。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，并確定蛋白終質(zhì)量濃度為20～40 μg/mL。使用體積分數(shù)10%的聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE膠）分離蛋白，將膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC）膜上，用含體積分數(shù)7%脫脂奶粉的TBST緩沖液（濃度為0.01 mol/L，pH=7.4）封閉2 h后，將目的蛋白對應的一抗與蛋白特異性結(jié)合，條帶在4 ℃中孵育12～16 h，用TBST緩沖液將一抗清洗后加入二抗，室溫中孵育2 h 后用TBST 緩沖液洗滌條帶，最后置于天能發(fā)光站中拍攝條帶。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Image J、Graphpad Prism 5.0、Excel、Power-Point和Photoshop 軟件進行數(shù)據(jù)處理、分析及制圖。所有實驗結(jié)果以平均值±標準差表示，顯著性差異使用單因素方差分析（one-way ANOVA 和t-test分析）。

2 實驗結(jié)果

2.1 AYAPE對HaCaT細胞活力的影響

CCK8實驗結(jié)果表明，在同一實驗條件下，用不同濃度的AYAPE處理HaCaT細胞，不同濃度的AYAPE對HaCaT 細胞均無明顯毒害作用，且不促進細胞增殖(P>0.05)（圖1），因此以100 μmol/L 為高濃度來進行下一步測定不同濃度AYAPE 對UVB 照射后HaCaT細胞活力的影響。

圖1 不同濃度AYAPE對HaCaT細胞活力的影響Fig.1 Effects of different concentrations of AYAPE on HaCaT cells viability

2.2 AYAPE對UVB照射的HaCaT細胞活力的影響

HaCaT 細胞經(jīng)UVB 照射后，細胞活力明顯下降，在低濃度的AYAPE 處理下，細胞活力明顯增加（P<0.001），而用高濃度的AYAPE對HaCaT細胞活力的保護效果則并不明顯（P>0.05）（圖2）。因此分別選取10、20、50 μmol/L 的AYAPE 作為后續(xù)實驗濃度。

圖2 不同濃度AYAPE對由UVB照射引起的細胞活力損傷保護效果Fig.2 Effects of different concentrations of AYAPE on UVBinduced cell viability

2.3 AYAPE 對UVB 照射的HaCaT 細胞中MMP-1釋放量的影響

酶聯(lián)免疫吸附測定實驗結(jié)果表明，HaCaT 細胞在40 mJ/cm2的UVB 下，MMP-1 蛋白的分泌增加，經(jīng)過AYAPE處理的HaCaT細胞所分泌的MMP-1蛋白含量明顯下降，并且在低濃度就呈現(xiàn)出顯著（P<0.001）的調(diào)節(jié)作用（圖3）。

圖3 AYAPE對細胞MMP-1蛋白的分泌水平影響Fig.3 Effect of AYAPE on MMP-1 protein secretion

2.4 AYAPE 對UVB 照射的HaCaT 細胞中Ⅰ型前膠原（PCⅠ）的影響

酶聯(lián)免疫吸附測定結(jié)果表明，經(jīng)過40 mJ/cm2的UVB 輻射的HaCaT 細胞中，PCI的含量明顯減少（P<0.05），AYAPE 的處理可增加細胞中PCI的含量，且含量接近空白組的水平（圖4）。

圖4 AYAPE對細胞Ⅰ型前膠原（PCⅠ）含量的影響Fig.4 Effect of AYAPE on UVB-induced PCIproduction

2.5 AYAPE 對UVB 照射的HaCaT 細胞中核內(nèi)p53蛋白的影響

通過染色細胞核與p53 蛋白，在熒光顯微鏡下觀察可以看出，HaCaT 細胞經(jīng)過UVB 輻射以后，核內(nèi)的p53 蛋白明顯增多，采用多肽AYAPE 處理的組別中，p53 蛋白含量明顯減少，并且20+UVB 組與50+UVB組的效果差別不大（圖5）。

圖5 AYAPE對核內(nèi)p53蛋白水平的影響Fig.5 Effect of AYAPE on intranuclear p53 protein expression

2.6 多肽AYAPE對NF-κB信號通路的作用

如圖6 所示，在經(jīng)UVB 照射的HaCaT 細胞中，AYAPE 顯著降低了NF-κB 信號通路中p65 蛋白的磷酸化水平。與不經(jīng)AYAPE處理的對照組相比，在AYAPE 處理濃度為10 μmol/L 和20 μmol/L 時表現(xiàn)為差異顯著（P<0.01），并在50 μmol/L 的高濃度下表現(xiàn)為差異極顯著（P<0.001）。

圖6 AYAPE對p-p65蛋白表達作用Fig.6 Effect of AYAPE on expression of p-p65 protein

2.7 AYAPE對UVB照射引起的HaCaT細胞凋亡的作用

通過蛋白質(zhì)印跡法，對HaCaT細胞內(nèi)Caspase蛋白含量進行測定。結(jié)果表明，經(jīng)過UVB照射細胞內(nèi)的Caspase-3蛋白和Caspase-9蛋白被激活，10 μmol/L的AYAPE對抑制Caspase-3蛋白激活沒有明顯影響（P<0.05），但被20 μmol/L和50 μmol/L的AYAPE所抑制（圖7）。對于Caspase-9蛋白，在10 μmol/L和20 μmol/L的AYAPE 處理下，被激活的Caspase-9 蛋白表達明顯的減少，并在50 μmol/L的時候抑制效果最強。

圖7 AYAPE對被激活的Caspase-3蛋白和Caspase-9蛋白表達作用Fig.7 Effects of AYAPE on expression of cleaved Caspase-3 and Caspase-9 protein

3 討論

UVB 照射是引起皮膚光老化這種皮膚損傷最重要的環(huán)境因素，皮膚持續(xù)暴露在UVB下會產(chǎn)生氧化應激、脂質(zhì)過氧化甚至是細胞死亡，從而引起皮膚損傷[5]。膠原蛋白是哺乳動物中最豐富的蛋白質(zhì)，是維持皮膚緊致的主要結(jié)構(gòu)蛋白，皺紋和脆弱的萎縮性皮膚等皮膚老化跡象主要是由真皮結(jié)締組織中膠原纖維的斷裂所引起[12,13]。膠原蛋白是由前膠原蛋白在酶的作用下所形成的，其中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白可被由紫外線誘導產(chǎn)生的MMP-1 所降解[14]。皮膚在持續(xù)UVB 照射下，角質(zhì)細胞中的核因子κB（NF-κB）信號通路可被UVB激活，該通路中一個重要的亞基p65 發(fā)生磷酸化并大量表達，進入到細胞核中[15,16]。通過NF-κB 信號通路，在UVB 誘導下MMP-1 的表達會明顯增加[17]。本研究中，由UVB 輻射誘導的p-p65 蛋白高表達以及MMP-1 的高分泌，在低濃度AYAPE作用下蛋白表達及分泌已出現(xiàn)明顯下降，而Ⅰ型前膠原的表達則出現(xiàn)相反的趨勢。表明多肽AYAPE 可通過調(diào)節(jié)NF-κB 信號通路進而調(diào)節(jié)MMP-1的含量，使得Ⅰ型前膠原的表達水平得到恢復（圖3、4、6）。

細胞凋亡的調(diào)節(jié)涉及到凋亡小體和凋亡相關(guān)蛋白的表達[18]，p53蛋白是一種參與細胞凋亡的核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)DNA損傷引起的細胞周期停滯和細胞凋亡。經(jīng)UVB誘導后，p53基因會產(chǎn)生一個53 Ku的磷酸化蛋白（p53蛋白被激活），p53蛋白的激活與否可通過其在細胞核和細胞質(zhì)中的定位表示[19]。此外，大多數(shù)凋亡誘導信號都集中在激活的高度保守的半胱天冬酶（Caspase）家族[4]，其中Caspase-9 參與了p53基因所誘導的凋亡途徑，Caspase-9 蛋白可由Apaf-1/cytochrome c 途徑所加工并激活，進而激活Caspase-3 蛋白[20,21]。本研究結(jié)果表明，HaCaT 細胞經(jīng)過UVB 輻射后，p53 蛋白的核內(nèi)表達明顯增加，Caspase-3和Caspase-9蛋白也被激活。多肽AYAPE的處理下，減少了p53 的核內(nèi)表達和Caspase-9 的激活，從而使Caspase-3 的激活得到改善。這說明了AYAPE 對HaCaT 細胞的凋亡起到很好的抑制作用（圖5、7）。

本研究表明，HaCaT細胞在UVB的輻射下受到損傷，細胞活力出現(xiàn)了明顯的下降。多肽AYAPE對提升UVB 誘導的HaCaT 細胞活力有明顯的效果（圖2），其中一方面通過抑制NF-κB 信號通路的激活，減少了MMP-1 蛋白的分泌，提高Ⅰ型前膠原的表達，能夠直接改善膠原蛋白合成變慢和減緩其降解。另一方面則通過由p53依賴的細胞凋亡途徑，明顯抑制了凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3 和Caspase-9 的激活。這說明了多肽AYAPE 能夠通過減少膠原蛋白降解和抑制角質(zhì)細胞凋亡兩個途徑來起到抗光老化的作用。

研究證明從魚類[22]、植物[23]、動物[24]中獲得的多肽具有抗光老化活性。本研究所使用的多肽AYAPE也被證實其具備與其他來源的生物活性肽同樣的抗光老化活性。湛江等鞭金藻作為一種可廣泛獲得且目前利用低值化的海洋微藻，可為AYAPE解決皮膚光老化問題提供一個可靠且經(jīng)濟的原料選擇方向，AYAPE 是一種有研究價值和應用潛力的抗光老化海洋天然多肽。

4 結(jié)論

湛江等鞭金藻多肽AYAPE 通過NF-κB 信號通路、MMP-1的分泌、Cleaved Caspase-3 和Cleaved Caspase-9的蛋白表達，對由UVB照射引起的HaCaT細胞光老化現(xiàn)象有很好的抑制作用，為AYAPE應用于具有抗光老化活性的化妝品和護膚品或修復皮膚光損傷的治療藥物提供了理論依據(jù)。