王瀟瀟，伍 宏，陳思衡，甘立軍

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南京 210095)

高等植物根系的生長發(fā)育在其生長過程中起著非常重要的作用，植物根系類型可大致分為兩類：擬南芥等雙子葉植物所具有的直根系和水稻等單子葉植物所具有的須根系[1,2]。須根系主要由種子根、側(cè)根與不定根組成。水稻萌發(fā)時(shí)形成一條種子根，隨著幼苗的發(fā)育產(chǎn)生數(shù)目較多的不定根，主根和不定根都可以在中柱鞘上發(fā)育出側(cè)根，以便更多地吸收水與養(yǎng)分[3-6]。

黃腐酸(fulvic acid, FA)與腐殖酸(humic acid, HA)是土壤腐殖質(zhì)(humus, HS)的主要成分[7-8]。FA具有良好的水溶性，且在酸、堿條件下均可溶解[9]。早期在擬南芥和番茄上的研究表明，F(xiàn)A可通過調(diào)控生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來促進(jìn)根的伸長生長和側(cè)根發(fā)生。Schmidt等[10]向無菌培養(yǎng)基中添加FA后，野生型擬南芥的根毛數(shù)量和長度增加，而生長素相關(guān)的突變體則無此效應(yīng)。Canellas等[11]用FA處理野生型番茄后其側(cè)根數(shù)量增加，但FA不能促進(jìn)生長素響應(yīng)缺陷突變體dgt的側(cè)根發(fā)生。通過GUS染色的方法研究擬南芥?zhèn)雀鹗键c(diǎn)的IAA響應(yīng)也發(fā)現(xiàn)，外源施加FA可以引起與IAA處理相同的轉(zhuǎn)錄活性，且可被IAA抑制劑如2-(對-氯苯氧)-異丁酸(p-chlorophenoxy isobutyric acid, PCIB)抑制。這些證據(jù)均表明，外源FA可能通過影響生長素信號通路來調(diào)控植物的根系生長和發(fā)育。

目前關(guān)于FA對植物生長的促進(jìn)作用在水稻中的研究尚少。水稻為單子葉植物，其根系形態(tài)與擬南芥等雙子葉植物有很大差別，側(cè)根發(fā)生的過程也不盡相同。過往研究中關(guān)于FA對水稻的作用，多為研究大田環(huán)境中FA對重金屬離子吸收的影響[12-16]，或籠統(tǒng)地研究土壤中提取的HS混合物對水稻生長的影響[17-18]。具體到FA對于水稻根系生長的作用以及相關(guān)機(jī)理研究較少。本實(shí)驗(yàn)研究了FA對水稻幼苗根系發(fā)育的影響，并初步探究了FA和生長素在調(diào)控水稻幼苗根系的生長和發(fā)育中的相互關(guān)系。為生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用FA調(diào)控水稻根系生長、培育優(yōu)質(zhì)水稻苗提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 種子和試劑

本試驗(yàn)參試水稻(OryzasativaL.)品種為‘寧粳6號’，種子購自蘇紅旗種業(yè)股份有限公司。試驗(yàn)所用試劑黃腐酸(FA)購自上海邦景實(shí)業(yè)有限公司，生長素合成抑制劑4-聯(lián)苯硼酸(4-biphenylboronic acid, BBo)、4-苯氧基苯基硼酸(4-phenoxyphenylboronic acid, PPBo)以及生長素極性運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑三碘苯甲酸(triodobenzoic acid, TIBA)、對氯苯氧基異丁酸(p-chlorophenoxy isobutyric acid, PCIB)均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 種子萌發(fā)與植株培養(yǎng)

選取形狀飽滿、大小均勻且無病蟲害的水稻種子，將種子浸泡于含有0.04%苯菌靈的去離子水中，30 ℃下浸種 1 d 后用去離子水洗凈種子。把種子置于濕潤的吸水紙上，于30 ℃的黑暗培養(yǎng)箱中萌發(fā)。當(dāng)大多數(shù)種子萌發(fā)至種子根長約 1 cm 時(shí)，將根長一致的種子移栽到含有1/4 IRRI營養(yǎng)液的塑料水杯中處理。水杯四周和底部包裹避光。

1.3 FA和生長素抑制劑處理

1.3.1 FA處理使用含有不同濃度(50、100、200、400和800 mg·L-1)FA的營養(yǎng)液處理水稻幼苗。將FA溶解于營養(yǎng)液中并調(diào)節(jié)pH至5.0，營養(yǎng)液每 3 d 更換一次，每處理3次重復(fù)。處理 6 d 后采收植株進(jìn)行數(shù)據(jù)測定。

1.3.2 IAA抑制劑處理使用少量二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)分別溶解BBo和PPBo制成母液，配置為含有3 μmol·L-1BBo和3 μmol·L-1PPBo的1/4 IRRI營養(yǎng)液。使用少量DMSO溶解PCIB制成母液，配置為含有30 μmol·L-1PCIB和 1 μmol·L-1TIBA的1/4 IRRI營養(yǎng)液。水稻幼苗在上述培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 d。

1.3.3 FA與IAA抑制劑共同處理使用少量DMSO溶解BBo、PPBo、PCIB和TIBA，加入含400 mg·L-1FA的營養(yǎng)液中，分別配置為含有 3 μmol·L-1BBo、3 μmol·L-1PPBo、30 μmol·L-1PCIB和 1 μmol·L-1TIBA 的1/4 IRRI營養(yǎng)液。為避免不同溶劑影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所有處理組的營養(yǎng)液中DMSO濃度相同。水稻幼苗在上述培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 d。

1.4 根系形態(tài)觀測

FA處理6 d 后，收獲水稻幼苗，以去離子水洗凈根系。選取長勢相對一致的幼苗，使用刻度尺測量其種子根長、人工計(jì)數(shù)種子根上所有長度大于0.5 mm的側(cè)根數(shù)量；以刻度尺測量側(cè)根的長度，并計(jì)算其平均值；以種子根上所有側(cè)根數(shù)量除以種子根長，得到幼苗的側(cè)根密度。

1.5 根尖IAA含量測定

處理6 d 后，收獲水稻幼苗，用去離子水洗凈根系。迅速剪下幼苗的所有根尖(距離根尖端2 cm長)；取0.25 g根尖樣品加入4 ℃預(yù)冷的甲醇2 mL，在液氮中冰凍研磨后加入甲醇，置于4 ℃浸提 18 h；10 000 r·min-1、4 ℃ 離心20 min，取上清液過預(yù)先用2 mL甲醇處理過的C-18固相萃取柱，然后用N2吹干，-80 ℃冰凍保存。采用ELISA法檢測樣品中的IAA含量[19]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析、雙因素方差分析和多重比較，用GraphPad軟件制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 FA濃度對水稻幼苗根長以及側(cè)根發(fā)生的影響

在含有不同濃度的FA中水培 6 d 的水稻幼苗根系照片(圖1，A)顯示，F(xiàn)A處理促進(jìn)了水稻幼苗種子根和側(cè)根的伸長生長；100、200、400和800 mg·L-1FA處理水稻種子根長分別比對照顯著增加15.72%、28.1%、34.1%和41.02%(圖1，B)， 400和800 mg ·L-1FA處理的平均側(cè)根長分別比對照顯著增加了39.1%和56.0%(圖1，C)。同時(shí)，水稻幼苗種子根上的所有側(cè)根的數(shù)量(長度大于0.5 mm)隨著FA濃度上升而逐漸增加，當(dāng)FA濃度 ≥ 100 mg·L-1時(shí)與對照組均有顯著差異，增幅分別達(dá)到25.6%、50.1%、87.4%和126.8%(圖1，D)。另外，F(xiàn)A處理也增加了水稻幼苗根系的側(cè)根密度，并有隨FA濃度上升而增加的趨勢，且在400和800 mg ·L-1FA處理下與對照差異顯著，如400 mg·L-1FA 處理的側(cè)根密度為對照的1.67倍?？紤]到FA的劑量和效應(yīng)，本研究選擇400 mg·L-1FA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 FA濃度對水稻幼苗根尖游離IAA含量的影響

為了確定FA對水稻內(nèi)源IAA含量的影響，選擇了25、100和400 mg·L-1FA處理水稻幼苗，6 d后檢測幼苗根尖的游離IAA含量。結(jié)果(圖2)表明，水稻幼苗根尖游離IAA含量在25 和100 mg·L-1FA處理下與對照無顯著差異，但在400 mg·L-1FA處理下比對照組顯著提高1.81倍。

2.3 生長素合成抑制劑對FA誘導(dǎo)的根伸長生長及側(cè)根發(fā)生的影響

BBo和PPBo可抑制擬南芥生長素合成途徑中的關(guān)鍵酶黃素單加氧酶(YUCCA)的活性，從而抑制IAA的生物合成[20]。圖3顯示，在不添加FA條件下， 3 μmol·L-1BBo 處理可使幼苗的種子根長比對照(CK)顯著增加13.16%(圖3，A)；3 μmol/L BBo 或 PPBo使幼苗的平均側(cè)根長比CK分別顯著降低38.7%和29%(圖3，B)，但對側(cè)根數(shù)量沒有顯著影響(圖3，C)；由于這些IAA合成抑制劑促進(jìn)了種子根的長度增加，因此使其側(cè)根密度受到顯著抑制(圖3，D)。

同時(shí)，在添加FA的條件下，研究IAA是否參與FA調(diào)控的水稻根的生長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A與BBo 或PPBo 共同處理顯著降低了FA對種子根伸長生長的促進(jìn)作用。其中，與FA處理相比，F(xiàn)A+BBo和FA+PPBo 共同處理幼苗的種子根長略有下降，它們的側(cè)根長分別顯著降低66.3%和71%(圖3，B)，而其側(cè)根數(shù)量分別顯著降低80.9%和80%(圖3，C)，IAA合成抑制劑與FA共同處理也顯著降低了幼苗的側(cè)根密度(圖3，D)。另外，F(xiàn)A與對照、FA+BBo與BBo 、FA+PPBo 與PPBo處理相比，幼苗的根系生長指標(biāo)均顯著增加，進(jìn)一步證明FA對種子根伸長生長的促進(jìn)作用。

2.4 生長素極性運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑對FA誘導(dǎo)的根伸長生長及側(cè)根發(fā)生的影響

PCIB和TIBA分別是生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和極性運(yùn)輸抑制劑。PCIB和TIBA 處理的水稻幼苗平均種子根長均比對照組顯著下降，分別為對照的42.0%和27.4%(圖4，A)；PCIB 處理的平均側(cè)根長也受到極顯著的抑制，僅為對照組的37.1%，而TIBA 處理幼苗的平均側(cè)根長與對照組無顯著差異(圖4，B)；與對照相比，PCIB 和 TIBA處理均對水稻幼苗的側(cè)根數(shù)量有極其顯著的抑制效果(圖4， C)，并顯著降低水稻幼苗的側(cè)根密度(圖4，D)。

同時(shí)， PCIB和TIBA與FA共同處理組的水稻種子根長均比FA處理組顯著降低，分別為FA處理的48.3%和82.0%(圖4，A)；與FA處理相比，F(xiàn)A+PCIB 處理幼苗的平均側(cè)根長顯著降低了75.3%，但FA+TIBA處理對側(cè)根長度沒有顯著的影響(圖4，B)； FA+PCIB 和FA+TIBA處理的幼苗側(cè)根數(shù)量均比FA處理顯著降低，分別為FA處理的7.2%和57.3%(圖4，C)；FA+PCIB處理幼苗的側(cè)根密度也比FA處理顯著降低，僅為FA處理的19.1%，而FA+TIBA 處理側(cè)根密度與FA處理沒有顯著差異(圖4，D)。另外，與不添加FA各處理(control、PCIB、TIBA)相比，相應(yīng)添加FA處理幼苗的種子根長、平均側(cè)根長、側(cè)根數(shù)量和側(cè)根密度均不同程度增加，且FA和TIBA+FA處理的增幅均達(dá)到顯著水平。

3 討 論

近幾十年來腐殖酸的相關(guān)研究表明， 包括FA在內(nèi)的多種腐殖酸對植物的生長發(fā)育有多種促進(jìn)作用，因此腐殖酸被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。農(nóng)業(yè)上FA主要應(yīng)用于葉面肥或于復(fù)合肥中，通過添加適量FA提升肥料利用率，以及將FA作為土壤改良劑用以改良長期使用化肥而板結(jié)的土壤。

本研究在水培條件下使用50～800 mg·L-1FA處理水稻幼苗，發(fā)現(xiàn)FA達(dá)到一定濃度(≥ 100 mg·L-1)后顯著促進(jìn)幼苗根系伸長生長和側(cè)根發(fā)生。HA與FA均是HS的有效組分之一，在Zandonadi等[13]的研究中，使用從土壤中提取的HA處理可以顯著促進(jìn)玉米幼苗的側(cè)根發(fā)生；Mora 等[21]的研究表明HA處理的黃瓜根長和根系密度顯著增加。在本研究中FA對水稻幼苗側(cè)根發(fā)生的促進(jìn)作用與上述的研究結(jié)果一致，F(xiàn)A有與HA類似的促進(jìn)植物根系伸長生長和側(cè)根發(fā)生的效果。

生長素類植物激素在植物根系的生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用，其極性運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被認(rèn)為與根系生長尤其是側(cè)根發(fā)生關(guān)系極為密切。生長素的極性運(yùn)輸可以改變植物局部組織的生長素濃度[22]。植物根系中生長素的極性運(yùn)輸存在環(huán)流，即生長素沿著中柱往根尖運(yùn)輸，至根冠后再通過表皮和皮層細(xì)胞回流向上運(yùn)輸[23-24]。生長素的極性運(yùn)輸主要通過AUX與PIN蛋白家族調(diào)控完成[24-27]，一些PIN蛋白突變體的側(cè)根密度會產(chǎn)生一定變化，如atpin3突變體的側(cè)根密度明顯減少[24]，而atpin2的側(cè)根密度增多[28]。在生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對側(cè)根發(fā)生的調(diào)控研究中，目前有一種假說認(rèn)為側(cè)根發(fā)生的調(diào)控有兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，一是處在合適位置的中柱鞘細(xì)胞才能形成側(cè)根原基，一是基部分生組織存在的節(jié)律性生長素信號會影響中柱鞘細(xì)胞的激活，當(dāng)原生木質(zhì)部細(xì)胞的生長素濃度最大時(shí)，緊鄰的中柱鞘細(xì)胞就可以開始分裂并逐步形成側(cè)根原基[29-30]。此外，中柱鞘細(xì)胞局部的生長素信號可決定側(cè)根的發(fā)生與發(fā)育，當(dāng)生長素在中柱鞘細(xì)胞中累積到一定程度后，就可以促進(jìn)中柱鞘細(xì)胞分裂形成側(cè)根原基。如果阻斷生長素信號，如使用生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，就可抑制側(cè)根發(fā)生[31]；如果施加外源生長素，可使整個(gè)緊鄰木質(zhì)部的中柱鞘細(xì)胞都被激活，則可以發(fā)育成側(cè)根[32]。目前的假說還有待完善，但在一定程度上解釋了側(cè)根發(fā)生與生長素信號之間的聯(lián)系。

生長素的各類抑制劑對植物的根系發(fā)育也有一定影響。Kakei 等[20]的研究表明，在含有1 μmol·L-1IAA合成抑制劑BBo 或PPBo的培養(yǎng)基上生長的擬南芥內(nèi)源IAA含量顯著下降，擬南芥根的伸長生長受到顯著抑制。3 μmol·L-1BBo 或PPBo 處理下擬南芥的正常生長受到嚴(yán)重抑制，擬南芥植株表現(xiàn)出明顯的向重力性缺失，且初生根幾乎不生長。因此，本研究中選用了3 μmol·L-1作為BBo 和PPBo的工作濃度。本研究在水稻上的試驗(yàn)結(jié)果與擬南芥的相關(guān)結(jié)果相吻合，3 μmol·L-1BBo 或PPBo 處理顯著抑制了水稻根系的伸長生長與側(cè)根發(fā)生。Yin等[33]在水培條件下使用PCIB處理水稻，0.5～50 μmol·L-1PCIB可顯著增加水稻根長，PCIB濃度超過50 μmol·L-1后顯著抑制水稻根長。對此作者推測低濃度的PCIB使得水稻根系的IAA信號處于一個(gè)更適合根系伸長生長的強(qiáng)度，高濃度下則顯示出對根系生長的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)30 μmol·L-1PCIB處理對水稻幼苗的根系伸長生長以及側(cè)根發(fā)生均有顯著的抑制作用。綜合來看，BBo、PPBo對水稻幼苗種子根長的影響和PCIB對種子根長的影響有著相似的趨勢：即這些抑制劑在達(dá)到一定濃度后使根系中IAA信號水平顯著下降，從而抑制根系的生長發(fā)育過程。

目前已在擬南芥和番茄等植物中對腐殖質(zhì)促進(jìn)植物根系生長的效應(yīng)做了一些研究。HS可以促進(jìn)野生型番茄的側(cè)根發(fā)生，但番茄生長素不敏感突變體dgt側(cè)根發(fā)生被抑制且無法被HS恢復(fù)[11]。Trevisan等[34]的研究表明，如果使用TIBA或PCIB與HA共同處理AUX1-DR5∷GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥，擬南芥中AUX1表達(dá)與只接受外源HA處理組相比受到顯著抑制，幼苗的側(cè)根密度也顯著下降。HA對擬南芥和番茄幼苗側(cè)根發(fā)生的促進(jìn)作用與根系內(nèi)源IAA含量以及IAA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

在本研究中，IAA合成抑制劑可抑制FA對水稻幼苗種子根伸長生長以及側(cè)根發(fā)生的促進(jìn)作用。此外，對水稻根尖內(nèi)源IAA含量的測定顯示400 mg·L-1FA顯著增加水稻根尖內(nèi)源IAA含量，可推測在水稻中FA可能通過增加內(nèi)源IAA含量的方式達(dá)到促進(jìn)根系伸長生長與側(cè)根發(fā)生的效果。FA可促進(jìn)水稻根系內(nèi)源IAA含量上升，推測可因此促使更多的中柱鞘細(xì)胞分裂并形成側(cè)根原基，增加側(cè)根原基的數(shù)量，從而提高側(cè)根密度。此處需進(jìn)一步的研究確認(rèn)其中的具體機(jī)制。

IAA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑可顯著抑制FA對幼苗根系伸長生長與側(cè)根發(fā)生的促進(jìn)作用。FA對水稻幼苗側(cè)根發(fā)生的促進(jìn)作用與HA對擬南芥?zhèn)雀l(fā)生的促進(jìn)作用一致[35]，促進(jìn)作用可以被PCIB抑制的結(jié)果也與Mora等關(guān)于HA的研究結(jié)果一致[21]。本研究中TIBA可顯著抑制FA對水稻幼苗種子根伸長以及側(cè)根發(fā)生的促進(jìn)作用，但無法抑制FA對水稻幼苗側(cè)根伸長生長的促進(jìn)作用，表明FA對水稻幼苗根系伸長生長的效應(yīng)可能存在不受IAA極性運(yùn)輸以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)影響的途徑，而FA對水稻幼苗側(cè)根發(fā)生的促進(jìn)作用受到IAA極性運(yùn)輸以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響。植物體中PCIB可通過干擾泛素-蛋白酶體途徑抑制Aux/IAA蛋白降解，從而抑制受IAA調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，顯示出根系生長受阻、側(cè)根發(fā)生受抑制和向重力性下降的表型[36]。FA對根系伸長生長與側(cè)根發(fā)生的促進(jìn)作用被PCIB抑制，當(dāng)PCIB阻礙了水稻體內(nèi)的IAA信號識別過程時(shí)，F(xiàn)A對水稻幼苗根系生長的促進(jìn)作用便受到抑制。這表明FA對水稻幼苗根系生長的促進(jìn)作用需通過IAA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)。