趙盈涵，李 田，邵鵬帥，孫景寬，許文靜，張澤浩

(1 濱州學(xué)院 山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實驗室，山東濱州 256603; 2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院 泰山森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站/黃河下游森林培育國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實驗室，山東泰安 271018)

黃河三角洲濕地位于山東省北部黃河入海處，具有重要的環(huán)境養(yǎng)護(hù)功能，在維護(hù)生物多樣性、凈化污染物、調(diào)節(jié)小氣候等方面具有重要作用[1]。然而，近些年由于自然因素及人為活動的影響，濕地土壤的水鹽平衡遭到破壞，土壤鹽漬化程度不斷加大[2]。鹽漬化土壤不僅限制了該地區(qū)許多植物的正常生長，同時還對土壤中的微生物群落產(chǎn)生重要影響[3]。

微生物被認(rèn)為是土壤中最重要和最活躍的部分，它通過自身生命活動，可以改變土壤理化特征，在維持土壤生態(tài)平衡、促進(jìn)植物生長方面發(fā)揮著重要作用，對促進(jìn)土壤養(yǎng)分循環(huán)和提高生態(tài)效率具有積極影響[4]。其中，真菌作為土壤中的主要微生物成分之一，與植物間存在著互惠和共生關(guān)系，其不僅可以分解土壤中的有機(jī)物質(zhì)為宿主植物提供養(yǎng)分，還可以通過抵抗土壤中病原體和環(huán)境壓力來增加植物的抗逆性，在保障植物健康方面發(fā)揮著重要作用[5]。植被類型可影響土壤微生物的結(jié)構(gòu)組成、微生物活性以及功能類群[6-7]。特別是“植物-土壤-微生物”作用最為激烈的根際區(qū)域，不同植物種類，由于其生理代謝機(jī)理不同所導(dǎo)致的根系分泌物種類的差異，使得根際與周圍土壤的理化性質(zhì)產(chǎn)生不同，從而對根際土壤真菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生影響[8-11]。研究發(fā)現(xiàn)，不同植物種類與其作用的特定菌群存在差異，而不同真菌在促進(jìn)植物生長或在抵抗不利環(huán)境時所發(fā)揮的生態(tài)作用也不盡相同[12-13]。因此研究和探討不同植物種類根際土壤真菌群落的組成與特征，可為有益真菌類群的挖掘以及某一地區(qū)的生態(tài)保護(hù)提供參考。

黃河三角洲地區(qū)植被類型以鹽生植物為主，其中拒鹽植物蘆葦(Phragmitescommunis)、聚鹽植物鹽地堿蓬(Suaedasalsa)、泌鹽植物獐毛 (Aeluropussinensis)是該地區(qū)具有代表性且面積分布較廣的不同類型鹽生植物。研究表明，鹽生植物可通過改善土壤微生物活動對生態(tài)系統(tǒng)健康以及維持生態(tài)平衡發(fā)揮重要作用[14-15]。目前，關(guān)于單一種類鹽生植物土壤微生物群落的研究相對較多，其中包括蘆葦根系土壤AM真菌的空間分布[16]、不同生境條件下蘆葦根際土壤微生物群落特征[17-18]以及鹽地堿蓬根際土壤細(xì)菌群落特征[19]等研究。近年來，關(guān)于不同植被類型的土壤微生物群落特征以及植物群落和環(huán)境因子對土壤微生物影響的研究也越來越受到重視。Zhao等[20]揭示了堿蓬根系微生物與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系，Zhang等[21]發(fā)現(xiàn)土壤養(yǎng)分是影響海岸帶濕地不同植物群落土壤微生物多樣性的重要因素。此外，趙嬌等[22]、Cao等[23]對黃河三角洲部分鹽生植物的根際土壤細(xì)菌多樣性進(jìn)行了研究。上述研究可為開展該地區(qū)鹽生植物根際和非根際土壤真菌研究提供一定參考，但目前從不同類型鹽生植物的角度對植物根際和非根際土壤真菌群落特征變化的研究報道不多。本研究以黃河三角洲地區(qū)蘆葦、鹽地堿蓬、獐毛3種不同類型鹽生植物為對象，提取根際與非根際土壤總DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增與純化，并通過高通量測序平臺對土壤真菌群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，揭示3種不同類型鹽生植物根際與非根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和豐度特征，分析土壤真菌群落與土壤環(huán)境因子的內(nèi)在聯(lián)系。研究結(jié)果可豐富對黃河三角洲濱海鹽堿地區(qū)不同類型鹽生植物根際真菌群落特征的認(rèn)識，為鹽漬化土壤修復(fù)提供必要的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 采樣區(qū)概況及樣品采集

采樣地位于山東省東營市河口區(qū)(N37°35′至38°12′，E118°33′至119°20′)。該地區(qū)土壤為鹽堿土，植被類型以鹽生植物為主。選擇3種不同類型鹽生植物——蘆葦、鹽地堿蓬、獐毛群落各3個，每個植物群落設(shè)置3個樣點(diǎn)，且每兩個樣點(diǎn)之間的距離不小于20 m，每個樣點(diǎn)劃分出1 m×1 m的區(qū)域樣方，每個樣方內(nèi)選擇生長狀況相近且無病蟲害感染的健康植株，用取樣鏟對0～20 cm深度的土層進(jìn)行采挖，將植株主體帶土挖出后，用小鏟取其根系周圍土壤，記為非根際土；采用抖根法收集植物根際土。去除雜物后，將同一樣方內(nèi)的根際土和非根際土分別混合均勻，四分法分成兩份。一份放入自封袋中，自然風(fēng)干后用于測定土壤理化性質(zhì)，另一份放置在50 mL 已滅菌的離心管中，于低溫下帶回實驗室，-80 ℃保存，用于土壤微生物測序。

1.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

每種樣品土壤稱取0.5 g用Omega的“Soil DNA Kit”試劑盒提取DNA，采用NanoDrop2000檢測DNA純度和濃度，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。對ITS1基因片段進(jìn)行擴(kuò)增處理。將每個樣本的3個PCR進(jìn)行重復(fù)后混合，得到的產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，后將得到的產(chǎn)物純化。Miseq文庫構(gòu)建后，進(jìn)行高通量測序和DNA數(shù)據(jù)處理，將得到的有效OTU聚類注釋進(jìn)行下一步分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

SPSS 20.0對真菌群落α多樣性、優(yōu)勢真菌豐度以及不同土壤中總碳(TC)、總氮(TN)、有效磷(aP)含量之和進(jìn)行ANOVA單因素方差分析(One-way analysis)，并計算平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤差。用獨(dú)立T檢驗對根際和非根際土壤理化性質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行比較分析，Origin Pro 9.0進(jìn)行柱狀圖和箱線圖的繪制。將有效的OTU聚類注釋信息借助https://bioincloud.tech/#/平臺分析并繪制土壤真菌群落花瓣圖、PCoA和NMDS排列圖，采用Canoco 5軟件分析土壤真菌群落與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系，并借助上述平臺繪制關(guān)系熱圖和冗余分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序飽和度分析

圖1表明，3種不同類型鹽生植物根際與非根際的土壤樣品的稀釋曲線均已趨于平坦，即各樣本的OTU覆蓋度已飽和，表明真菌測序數(shù)據(jù)量合理。

2.2 不同鹽生植物根際和非根際土壤真菌多樣性分析

由圖2可知，3種不同類型鹽生植物根際與非根際土壤中，共有的OTU數(shù)量為17。蘆葦、鹽地堿蓬、獐毛根際土中分別注釋到各自特有的OTU數(shù)量表現(xiàn)為獐毛>蘆葦>鹽地堿蓬。對3種不同類型鹽生植物根際與非根際土壤的真菌豐富度和多樣性進(jìn)行對比，其OTU注釋、Chao1、Faith指數(shù)均表現(xiàn)為根際土顯著高于非根際土。不同鹽生植物之間，真菌群落多樣性和豐富度存在差異。根際真菌豐富度排序為：獐毛>鹽地堿蓬=蘆葦，獐毛根際土OTU注釋、Chao1、Faith指數(shù)均顯著大于其他2種鹽生植物(P<0.05)；不同鹽生植物非根際土中真菌多樣性和豐富度特征與根際土中差異特征相一致，其中獐毛Shannon和Simpson指數(shù)顯著高于蘆葦(P<0.05)(圖3)。

2.3 真菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 群落物種組成及優(yōu)勢菌屬差異性比較本實驗共分離到1門3屬，球囊菌門(Glomeromycota)為優(yōu)勢門，盾巨胞囊霉屬(Scutellospora)為優(yōu)勢屬(圖4)。球囊菌門中共注釋到3個不同屬，其中優(yōu)勢屬盾巨孢囊霉屬約占球囊菌門總豐度的90.63%(表1)。對相同植物根際與非根際土壤中球囊菌門相對豐度分析發(fā)現(xiàn)(圖5)，鹽地堿蓬表現(xiàn)為根際顯著小于非根際，獐毛則為根際顯著大于非根際，而蘆葦在根際與非根際間差異不顯著。不同鹽生植物根際土壤球囊菌門豐度表現(xiàn)為獐毛與鹽地堿蓬差異不顯著，但顯著高于蘆葦。盾巨孢囊霉屬在相同鹽生植物根際與非根際土壤之間，以及不同鹽生植物根際土壤之間未見顯著差異。

2.3.2 群落間結(jié)構(gòu)差異性比較基于Bray-Curtis相似性系數(shù)對3種不同類型鹽生植物根際與非根際土壤真菌群落數(shù)據(jù)進(jìn)行PCoA分析(圖6)，3個軸共解釋了真菌群落組成差異的33.08%。由排序圖中距離遠(yuǎn)近可知，蘆葦和鹽地堿蓬2種植物根際土真菌群落結(jié)構(gòu)組成相似程度較高，獐毛根際土與其他2種植物根際土壤真菌群落差異大。此外，獐毛根際與非根際土在排序圖上聚在一起，表明獐毛根際與非根際土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)差異較小。由NMDS分析可知，蘆葦和鹽地堿蓬非根際土壤樣品在排序圖中距離其他樣品較遠(yuǎn)，表明蘆葦和鹽地堿蓬非根際土壤與其他樣品土壤之間真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。

2.4 土壤真菌類群與理化性質(zhì)的相關(guān)性

2.4.1 土壤理化性質(zhì)分析圖7表明，相對于非根際土，鹽生植物根際土pH、TC、TN、aP的平均數(shù)值均增高，含鹽量和有機(jī)碳(OC)含量均降低。其中植物根際與非根際土壤的pH、TC、TN、OC、aP均達(dá)顯著差異水平(P<0.05)。

表1 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)類別表

2.4.2 真菌類群與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性土壤理化性質(zhì)與真菌群落多樣性和豐富度關(guān)系熱圖(圖8)表明，TC、TN、pH與土壤真菌群落豐富度和多樣性呈顯著正相關(guān)，aP與Chao 1豐富度和注釋OTU數(shù)量呈顯著正相關(guān)；土壤鹽分含量與Faith指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)。

RDA分析結(jié)果(圖9)顯示，其第一軸和第二軸分別解釋了真菌群落組成的25.55%和17.46%的變異；3種不同類型鹽生植物真菌群落受土壤鹽分和總氮含量的影響較強(qiáng)。土壤樣本排序集中在x的負(fù)半軸，pH、TC在第一象限，與在第四象限的TC、aP、OC呈良好的正相關(guān)關(guān)系，鹽分位于第四象限，與第一象限的pH和TN呈負(fù)相關(guān)。土壤理化性質(zhì)與優(yōu)勢菌門的相關(guān)性分析表明，球囊菌門與pH、TC、TN、aP、OC呈正相關(guān)，與土壤鹽分含量呈負(fù)相關(guān)。

3 討 論

3.1 不同類型鹽生植物根際和非根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

本研究中，球囊菌門為3種不同類型鹽生植物根際與非根際土壤中的優(yōu)勢門。該菌門通常可增強(qiáng)植物應(yīng)對鹽脅迫的能力[24]。本研究中的優(yōu)勢屬為盾巨孢囊霉屬，這與其他有關(guān)黃河三角洲真菌多樣性研究得出的子囊菌門和毛殼菌屬/焦孢殼屬相對豐度最高的結(jié)論不同[25-27]，這是因為植物根際微環(huán)境因子的差異會對微生物多樣性產(chǎn)生顯著影響[28]。另外，與其他關(guān)于鹽生植物根際真菌多樣性研究相比，本研究中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢菌屬并不相同且種類較少。如艾比湖濕地鹽生植物根際土壤真菌的主要優(yōu)勢真菌門屬為子囊菌門和鏈格孢霉屬，南疆鹽生植物根際真菌的共有優(yōu)勢屬可達(dá)4種(鐮孢菌屬、支頂孢屬、曲霉屬和青霉菌屬)[29-30]。Suresh等[31]對土壤中優(yōu)勢菌屬的相關(guān)論斷中指出，大部分研究中球囊菌屬被認(rèn)為是絕對優(yōu)勢屬，但也存在個例，如在砂質(zhì)土壤中存在巨孢囊霉屬或盾巨孢囊霉屬為優(yōu)勢屬的情況[32]，可能因為其菌絲體較為豐富，孢子形成和成熟時間較長，從而對沙質(zhì)以及營養(yǎng)貧瘠土壤具有一定的適應(yīng)性。盾巨孢囊霉屬屬于巨孢囊霉科，為叢枝菌根(AM)真菌重要科之一。該科真菌為內(nèi)陸少見種，主要分布于沿海沙丘、海島或近海域的農(nóng)田及草原中，尤其在山東地區(qū)為優(yōu)勢科之一[33]。本研究中的優(yōu)勢屬為盾巨孢囊霉屬，這一結(jié)果正好與黃河三角洲地區(qū)的土壤特性相吻合，較好地反映出這一地區(qū)的真菌特點(diǎn)。

植物種類是影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素之一[34]，由于宿主植物種類的差異，其根系形態(tài)以及根系分泌物的復(fù)雜性可造就不同的土壤微環(huán)境，也會對土壤中微生物的結(jié)構(gòu)造成一定影響[35]。研究表明，植物根系與球囊菌門的真菌之間存在共生關(guān)系，兩者通過耦合過程在土壤中形成菌絲橋網(wǎng)絡(luò)，提高宿主植物的抗逆能力[36]，而不同鹽生植物根系對真菌具有選擇性[37]，因此本研究中3種不同類型鹽生植物根際土壤中球囊菌門豐度存在差異，且蘆葦(拒鹽植物)根際真菌多樣性略低于鹽地堿蓬(聚鹽植物)根際，這與南疆蘆葦根際土壤真菌群落多樣性低于鹽爪爪(聚鹽植物)根際的結(jié)果相一致[30]。

3.2 不同類型鹽生植物根際和非根際土壤真菌群落多樣性與土壤因子的關(guān)系

在各種非生物脅迫下，植物根際微區(qū)域會發(fā)生復(fù)雜的反應(yīng)來減少根際養(yǎng)分的損失，根際土壤真菌可以促進(jìn)土壤腐殖質(zhì)的形成與分解，對提高宿主植物抗逆性、促進(jìn)植物生長發(fā)育等方面具有重要作用[38-39]。本研究中，植物根際與非根際土壤養(yǎng)分含量等理化性質(zhì)均存在明顯差異，根際土壤養(yǎng)分含量顯著高于非根際土壤，表明3種不同類型鹽生植物根際土壤出現(xiàn)明顯的養(yǎng)分富集現(xiàn)象。這是由于植物根系可以不斷地從外界環(huán)境中吸取養(yǎng)分，使養(yǎng)分在根際區(qū)域沉淀[40]；另一方面通過植物根系分泌物的作用，根際微域養(yǎng)分的含量及分布產(chǎn)生一系列的復(fù)雜變化，使得根際土壤中微生物的活性增強(qiáng)，養(yǎng)分轉(zhuǎn)化速率也因此提高[41]。3種不同類型鹽生植物各自根際與非根際土壤相比，鹽地堿蓬和獐毛根際對土壤養(yǎng)分的富集能力顯著強(qiáng)于蘆葦，說明這2種類型鹽生植物在適應(yīng)鹽堿地區(qū)環(huán)境過程中，需要更多的營養(yǎng)物質(zhì)來滿足其自身生長發(fā)育的需要。這與3種不同類型鹽生植物的耐鹽生理特性正相吻合，即聚鹽和泌鹽植物對鹽分的積累和分泌過程伴隨著養(yǎng)分的攝入，而拒鹽植物蘆葦在防止鹽分吸收的同時會阻止養(yǎng)分的吸收[42]。

土壤環(huán)境因子對土壤真菌群落多樣性和豐富度有重要影響[43-44]，土壤養(yǎng)分含量是影響土壤真菌群落多樣性與豐富度的主要驅(qū)動因子。熱圖分析表明TC、TN、aP、pH與土壤真菌群落多樣性和豐富度之間呈正相關(guān)，這與Liang[45]研究結(jié)果具有一定的一致性。本研究中鹽地堿蓬和獐毛的根際土壤養(yǎng)分含量顯著高于非根際土，但蘆葦根際土和非根際土中差異并不顯著，這表明聚鹽植物鹽地堿蓬和泌鹽植物獐毛在土壤改良方面較拒鹽植物蘆葦存在一定的優(yōu)勢。植物耐鹽方式的不同對土壤肥力產(chǎn)生了不同程度的影響，而土壤肥力又會影響土壤微生物的結(jié)構(gòu)[46]。研究表明土壤肥力的增加有利于真菌的生長[47]，而球囊菌的代謝產(chǎn)物在生態(tài)系統(tǒng)碳匯、土壤質(zhì)地和土壤肥力提升方面發(fā)揮著重要作用[48]。依據(jù)獐毛根際土中球囊菌門豐度及根際土壤養(yǎng)分含量的特點(diǎn)，說明獐毛根際與球囊菌門真菌間形成了良好的互惠關(guān)系。

本研究表明，土壤鹽分是影響黃河三角洲地區(qū)土壤真菌群落多樣性和豐富度的重要因子，兩者之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與袁鐘鳴等[49]對蘇北泥質(zhì)海岸帶土壤研究結(jié)果相同，也進(jìn)一步說明了鹽分對海岸帶濕地土壤微生物多樣性的限制性作用。本研究中pH與土壤真菌群落多樣性和豐富度呈正相關(guān)，這與楊春雪等[50]對松嫩鹽堿草地的研究結(jié)果相一致，但與李雪靜等[51]對荒漠和草原土壤真菌多樣性測定分析結(jié)果相反，這表明相對于荒漠和草原地區(qū)，鹽堿地區(qū)的土壤真菌對pH值的適應(yīng)范圍可能更高。植物凋落物是土壤有機(jī)碳的主要來源，不同類型植被下土壤有機(jī)碳來源和含量存在差異[52]。本研究中，土壤有機(jī)碳含量與真菌群落多樣性指數(shù)呈正相關(guān)，與真菌群落豐富度指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。研究表明，有機(jī)碳含量對微生物多樣性和豐度有著直接影響，是土壤真菌多樣性的主要影響因素[53-54]。土壤有機(jī)碳含量對土壤真菌多樣性起到促進(jìn)的原因在于很多真菌在土壤中具有腐生性，而土壤有機(jī)碳含量的增加有助于腐生性真菌的生存與繁衍，如隸屬于球囊菌門的叢枝菌根真菌通過分解植物殘體和有機(jī)質(zhì)在獲取自身所需碳源的同時，還可改善植物根際的微環(huán)境，從而對土壤真菌群落多樣性的增加產(chǎn)生影響[55]。

4 結(jié) 論

黃河三角洲地區(qū)3種不同類型鹽生植物根際土壤真菌群落豐富度顯著大于各自非根際土，獐毛根際土壤真菌群落豐富度顯著大于蘆葦和鹽地堿蓬的根際土；球囊菌門為絕對優(yōu)勢門，獐毛根際土中該菌門豐度顯著高于蘆葦，與鹽地堿蓬差異不顯著；優(yōu)勢屬盾巨孢囊霉屬在不同鹽生植物根際土之間無顯著差異。群落間結(jié)構(gòu)差異性比較表明，蘆葦和鹽地堿蓬非根際土壤真菌群落間的相似性最大，同時與其他樣品土壤之間真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。土壤真菌多樣性和豐富度與土壤TC、TN、aP、pH呈正相關(guān)，與土壤鹽分含量呈負(fù)相關(guān)；球囊菌門豐度與土壤TC、TN、aP、OC、pH呈正相關(guān)，與鹽分呈負(fù)相關(guān)。不同鹽生植物根際養(yǎng)分富集程度不同，鹽地堿蓬和獐毛對土壤養(yǎng)分的富集能力顯著強(qiáng)于蘆葦。