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      茯苓多糖調(diào)節(jié)2型糖尿病模型大鼠肝臟糖異生的機(jī)制研究

      2022-07-18 23:19:57韓思婕潘翔朱芊芊張丹丹張涵瑞方敬賢魏瓊劉丹葉曉川
      中國(guó)藥房 2022年13期
      關(guān)鍵詞:糖異生茯苓空白對(duì)照

      韓思婕 潘翔 朱芊芊 張丹丹 張涵瑞 方敬賢 魏瓊 劉丹 葉曉川

      關(guān)鍵詞茯苓多糖;2 型糖尿病;氧化應(yīng)激;PI3K/Akt/FoxO1通路;糖異生

      2 型糖尿病占糖尿病發(fā)病例數(shù)的90%以上,由2 型糖尿病導(dǎo)致的并發(fā)癥大多與患者的高病死率有關(guān)[1-2]。目前,臨床上用于治療糖尿病的雙胍類藥物具有明顯的副作用[3]。而中藥在治病救人方面有幾千年的歷史,更是在防治2 型糖尿病及其并發(fā)癥方面具有多靶點(diǎn)、多途徑、個(gè)體化等不可替代的優(yōu)勢(shì),因此,尋找標(biāo)本兼治、副作用小、療效穩(wěn)定的中藥及其有效成分治療糖尿病是國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)。

      茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核,具有利水滲濕、健脾、寧心的功效[4]。糖尿病屬中醫(yī)“消渴癥”范疇,而茯苓是中醫(yī)治療消渴癥的高頻用藥[5]。茯苓多糖為茯苓菌核中的主要成分,占菌核質(zhì)量的70%~80%[6],具有抗腫瘤、抗炎、保肝、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用[7]。有研究報(bào)道,茯苓多糖能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群來(lái)改善肥胖小鼠的糖脂代謝,減輕肝臟脂肪變性[8]。多項(xiàng)研究表明,茯苓多糖可以減輕糖尿病腎病小鼠的腎損傷[9-11]。在生理?xiàng)l件下,機(jī)體血糖水平通過(guò)體內(nèi)葡萄糖產(chǎn)生和攝取間的動(dòng)態(tài)平衡來(lái)維持穩(wěn)定。糖異生是將一些非糖前體,如乳酸、甘油、生糖氨基酸等轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟堑倪^(guò)程,肝臟糖異生是導(dǎo)致內(nèi)源性葡萄糖生成增加的重要原因,而2 型糖尿病患者中糖異生作用異?;钴S[12]。目前已有研究證明,抑制肝臟糖異生是治療2型糖尿病的有效策略[13]。另有研究證實(shí),磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O1(forkheadbox transcription factor O1,F(xiàn)oxO1)信號(hào)通路可調(diào)節(jié)肝臟糖異生[14]。本研究主要探討茯苓多糖是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt/FoxO1 通路,抑制糖異生關(guān)鍵酶——磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)和葡萄糖-6- 磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6Pase)的蛋白表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)2 型糖尿病模型大鼠血糖,以期為闡明茯苓多糖發(fā)揮降血糖的作用機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。

      1 材料

      1.1 儀器

      LiDE110 型凝膠成像儀購(gòu)自日本Canon 公司;Spark10M型酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士Tecan 公司;Centrifuge 5810R型高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司;530 活力型手持血糖儀購(gòu)自江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司;WTM-1812D型膜分離實(shí)驗(yàn)設(shè)備、ST-2B-1812 型微濾膜元件、V0.2-2B-1812 型超濾膜元件均購(gòu)自杭州沃騰膜工程有限公司;FD-1A-50 型冷凍干燥機(jī)購(gòu)自北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;Eclipse E100 型光學(xué)顯微鏡、DS-U3 型成像系統(tǒng)均購(gòu)自日本Nikon公司。

      1.2 藥材與試劑

      茯苓藥材采自湖北省英山縣石頭咀鎮(zhèn),經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院葉曉川教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓P.cocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核。鹽酸二甲雙胍片(批號(hào)ABU7707,規(guī)格0.5 g/片)購(gòu)自中美上海施貴寶制藥有限公司;鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,批號(hào)301V021,規(guī)格1 g)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;三酰甘油(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,HbA1c)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、肝糖原試劑盒(批號(hào)分別為20210423、20210426、20210422、20210420、20210425、20210426、20210420)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;蘇木素-伊紅(HE)染液套裝、RIPA 裂解液(批號(hào)分別為G1003、CR2103126)均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司;TBST緩沖液(批號(hào)21128946)購(gòu)自合肥白鯊生物科技有限公司;兔抗磷酸化PI3K(p-PI3K)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(批號(hào)分別為ab182651、ab181602)均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司;兔抗磷酸化Akt(p-Akt)、兔抗磷酸化FoxO1(p-FoxO1)(批號(hào)分別為#4060、#9461)均購(gòu)自美國(guó)CST 公司;兔抗G6Pase(批號(hào)LS-C446262)購(gòu)自美國(guó)LSBio 公司;兔抗PEPCK(批號(hào)14892-1-AP)購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗(批號(hào)AS1107)購(gòu)自南非Aspen 公司;磷酸和氫氧化鈉均為食品級(jí);水為純水。

      1.3 動(dòng)物

      SPF 級(jí)SD 大鼠購(gòu)自湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(鄂)2020-0018,動(dòng)物合格證號(hào)為42000600040888。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批準(zhǔn)號(hào)為HUCMS202103009。大鼠飼養(yǎng)于(20±2)℃、相對(duì)濕度50%~70%、12 h 明暗交替環(huán)境中,自由飲水、攝食,適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d 后用于實(shí)驗(yàn)。

      2 方法

      2.1 茯苓多糖的制備

      茯苓丁粉碎后經(jīng)80%乙醇回流提取2 次(提取時(shí)間分別為2、1 h),濾過(guò),取濾渣,揮干至無(wú)醇味后用氫氧化鈉溶解,常溫下充分?jǐn)嚢韬筮^(guò)濾。濾液用磷酸調(diào)至pH=7,沉淀用純水洗滌數(shù)次,濾過(guò)后的洗滌液經(jīng)WTM-1812D型膜分離實(shí)驗(yàn)設(shè)備微濾、超濾后,與上述沉淀合并,冷凍干燥后得茯苓多糖。采用苯酚-硫酸法測(cè)得茯苓多糖含量為95.60%。

      2.2 分組、造模與給藥

      大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d 后,禁食4 h(每次禁食均換墊料以避免墊料內(nèi)遺漏有飼料,影響禁食效果),取大鼠尾尖靜脈血,用530 活力型手持血糖儀檢測(cè)空腹血糖,作為大鼠基礎(chǔ)血糖值。將大鼠按照禁食4 h 后基礎(chǔ)血糖水平組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)為標(biāo)準(zhǔn),分為空白對(duì)照組、模型組、二甲雙胍組(陽(yáng)性對(duì)照,劑量為200mg/kg)和茯苓多糖低、中、高劑量組(劑量分別為100、200、400 mg/kg),每組8 只,各給藥組的劑量依據(jù)來(lái)自前期預(yù)實(shí)驗(yàn)。除空白對(duì)照組外,其余各組大鼠采用高脂飼料聯(lián)合STZ 誘導(dǎo)構(gòu)建2 型糖尿病大鼠模型:大鼠飼喂高脂飼料,第21 天時(shí)禁食不禁水12 h,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果腹腔注射STZ 40 mg/kg;3 d 后檢測(cè)造模大鼠空腹血糖值均大于11.3 mmol/L,表明造模成功;繼續(xù)飼喂高脂飼料至第28 天,鞏固造模。造模同時(shí),模型組和空白對(duì)照組大鼠每日灌胃等體積水,各給藥組大鼠每日灌胃相應(yīng)劑量的藥物,每日1 次,連續(xù)灌胃42 d。

      2.3 日常狀態(tài)觀察及體質(zhì)量檢測(cè)

      實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠的飲水量、尿量、飲食量、毛色、精神狀態(tài)等情況,并每日測(cè)定大鼠的體質(zhì)量。

      2.4 空腹血糖檢測(cè)和口服葡萄糖耐量試驗(yàn)

      各組大鼠在給藥前、給藥后(給藥結(jié)束前1 d)檢測(cè)空腹血糖??诜咸烟悄土吭囼?yàn):給藥前1 d 禁食4 h 后取大鼠尾尖靜脈血,用530 活力型手持血糖儀檢測(cè)灌胃葡萄糖前(0 h)的血糖;然后灌胃2.5 g/kg 葡萄糖,分別在灌胃0.5、2 h 時(shí)檢測(cè)血糖,計(jì)算口服葡萄糖耐量試驗(yàn)曲線下面積(area under curve,AUC):AUC=0.25×(血糖0 h+4×血糖0.5 h+3×血糖2 h)。AUC越大說(shuō)明2 型糖尿病模型大鼠對(duì)葡萄糖的代謝能力越弱,側(cè)面反映糖尿病的病程。

      2.5 臟器指數(shù)計(jì)算

      末次給藥后,取大鼠腹部主動(dòng)脈血,再解剖得大鼠心臟、肝臟、腎臟組織,用生理鹽水清洗、濾紙擦拭、稱定質(zhì)量后,置于-80 ℃冰箱保存。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×1 000。

      2.6 HbA1c、TG、TC、MDA、GSH-Px、SOD水平及肝糖原含量檢測(cè)

      取“2.5”項(xiàng)下血樣和肝臟組織。用肝素抗凝管取全血2~4 mL,以1 000 r/min 離心5 min,棄上清液,留沉淀的紅細(xì)胞,再用生理鹽水按上述方法洗滌2~3 次,得壓積紅細(xì)胞。取壓積紅細(xì)胞1 mL,加冷雙蒸水1.5 mL,用漩渦混勻器充分混勻1 min 制得溶血液,置于-20 ℃冰箱保存,用于檢測(cè)HbA1c 水平。用普通采血管取全血5mL,以3 000 r/min 離心10 min,小心吸取上清液即為血清,置于-80 ℃冰箱保存,用于檢測(cè)血脂指標(biāo)TG、TC水平和抗氧化指標(biāo)MDA、GSH-Px、SOD 水平。取肝臟組織約100 mg檢測(cè)肝糖原含量。各指標(biāo)檢測(cè)操作均嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

      2.7 肝臟和胰腺組織病理學(xué)觀察

      隨機(jī)選擇“2.5”項(xiàng)下每組3 只大鼠的肝臟和胰腺組織,用4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片,HE染色、二甲苯透明后,于光學(xué)顯微鏡下觀察肝細(xì)胞情況和胰島細(xì)胞變性壞死情況,并用顯微鏡照相系統(tǒng)拍照(每個(gè)樣品隨機(jī)選取3 個(gè)區(qū)域),進(jìn)行病理學(xué)等級(jí)評(píng)分。其中肝臟病理等級(jí)評(píng)分采用Knodell 組織學(xué)活動(dòng)指數(shù)評(píng)分系統(tǒng)并參考文獻(xiàn)[15]:Ⅰ級(jí)為界面性炎癥及橋接壞死的程度,按0~4 分評(píng)定;Ⅱ級(jí)為小葉內(nèi)肝細(xì)胞變性和壞死的范圍及匯管區(qū)的炎癥狀況,按0~4 分評(píng)定;Ⅲ級(jí)為纖維化程度,按0~4 分評(píng)定。胰腺病理等級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[16]:Ⅰ級(jí)為胰島形態(tài)損壞的程度,按0~4分評(píng)定;Ⅱ級(jí)為胰島細(xì)胞排列紊亂及細(xì)胞核游離的程度,按0~4 分評(píng)定;Ⅲ級(jí)為胰島細(xì)胞數(shù)量減少及細(xì)胞壞死的程度,按0~4 分評(píng)定。以上評(píng)分越接近0 分代表病理程度越輕,越接近4分代表病理程度越重。

      2.8 肝臟組織PI3K/Akt/FoxO1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

      采用Western blot 法檢測(cè)。取“2.5”項(xiàng)下部分凍存肝臟組織,加RIPA裂解液,冰浴徹底勻漿,將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中,振蕩,冰浴30 min,同時(shí)用移液器反復(fù)吹打,確保勻漿液完全裂解。以12 000 r/min 于4 ℃離心5min,收集上清液,即為總蛋白溶液。取部分總蛋白溶液用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白含量,剩余部分沸水浴5 min使蛋白變性,變性后置于-80 ℃冰箱保存,備用。取變性蛋白40 μg,采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白,其中分離膠電壓80 V,濃縮膠電壓120 V;用0.45 μm的PVDF膜300 mA轉(zhuǎn)膜90 min,用牛奶封閉1 h,分別加入p-PI3K、p-AKT、p-FoxO1、PEPCK、G6Pase 和GAPDH一抗(稀釋度分別為1 ∶500、1 ∶1 000、1 ∶500、1 ∶500、1 ∶2 000、1 ∶10 000),于4 ℃孵育過(guò)夜;次日,用TBST 漂洗3 次,加入相應(yīng)二抗(稀釋度為1 ∶10 000),于常溫下繼續(xù)孵育1 h 后,用TBST漂洗3 次,滴加新鮮配制的ECL混合溶液(魯米諾與過(guò)氧化氫體積比1 ∶1 混合)至膜的蛋白面,暗室中曝光,根據(jù)不同的光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件,顯影、定影。將膠片進(jìn)行掃描存檔,采用AlphaEase? FC 軟件處理系統(tǒng)導(dǎo)出目的蛋白和內(nèi)參GAPDH的灰度值,采用Excel 軟件計(jì)算,以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

      2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

      采用SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以x±s 表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

      3 結(jié)果

      3.1 茯苓多糖對(duì)2 型糖尿病模型大鼠日常狀態(tài)和體質(zhì)量的影響

      實(shí)驗(yàn)期間,大鼠均有較強(qiáng)的行動(dòng)力??瞻讓?duì)照組大鼠皮毛健康有光澤,實(shí)驗(yàn)前后飲食量幾乎無(wú)變化。模型組大鼠表現(xiàn)狂躁,出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀,毛色不華,部分呈淺黃褐色并伴有掉毛現(xiàn)象,體質(zhì)量較空白對(duì)照組顯著減輕(P<0.05)。給予相應(yīng)劑量藥物后,二甲雙胍組大鼠多飲、多食、多尿、毛色不華等狀態(tài)改善,但體質(zhì)量與空白對(duì)照組比較仍顯著減輕(P<0.05),并伴有便溏現(xiàn)象。與模型組比較,茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠狂躁?duì)顟B(tài)改善,多飲、多食、多尿、毛色不華等現(xiàn)象得到緩解,體質(zhì)量回升,其中茯苓多糖中劑量組分別與模型組、二甲雙胍組比較,以及茯苓多糖高劑量組與二甲雙胍組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

      3.2 茯苓多糖對(duì)2型糖尿病模型大鼠臟器指數(shù)的影響

      與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠肝臟、腎臟臟器指數(shù)均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,二甲雙胍組大鼠腎臟臟器指數(shù)和茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠肝臟(除茯苓多糖低劑量組外)、腎臟臟器指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

      3.3 茯苓多糖對(duì)2 型糖尿病模型大鼠口服葡萄糖耐量的影響

      灌胃葡萄糖溶液0~0.5 h 期間,各組大鼠的血糖水平均呈逐漸增加的趨勢(shì);而在灌胃0.5~2 h 期間,其血糖水平又均呈逐漸降低的趨勢(shì)。與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠在灌胃葡萄糖溶液0、0.5、2 h 時(shí)的血糖水平和AUC均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,二甲雙胍組和茯苓多糖低(除0 h 時(shí)外)、中、高劑量組大鼠在灌胃葡萄糖溶液0、0.5、2 h 時(shí)的血糖水平和AUC均顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

      3.4 茯苓多糖對(duì)2 型糖尿病模型大鼠空腹血糖和HbA1c的影響

      給藥前,各組大鼠空腹血糖水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給藥后(給藥結(jié)束前1 d),與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠空腹血糖、HbA1c 水平均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,二甲雙胍組和茯苓多糖中、高劑量組大鼠空腹血糖水平,以及二甲雙胍組和茯苓多糖中劑量組大鼠HbA1c 水平均顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

      3.5 茯苓多糖對(duì)2 型糖尿病模型大鼠血脂水平、抗氧化水平及肝糖原含量的影響

      與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠血清中TC、TG、MDA水平和肝糖原含量顯著升高,GSH-Px、SOD 水平顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,二甲雙胍組和茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠TC、TG、MDA水平和肝糖原含量均顯著降低,SOD水平顯著升高(P<0.05);茯苓多糖中劑量組大鼠GSH-Px 水平顯著升高(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表4。

      3.6 肝臟和胰腺組織病理學(xué)觀察結(jié)果

      大鼠肝臟組織HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1 所示,空白對(duì)照組大鼠肝小葉形狀規(guī)則,肝細(xì)胞形態(tài)正常,肝索排列整齊、呈放射狀分布。模型組大鼠肝小葉不明顯,肝細(xì)胞排列散亂,肝索結(jié)構(gòu)消失,肝竇擴(kuò)大,細(xì)胞間呈不同程度的皺縮,導(dǎo)致空泡較多,可見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。二甲雙胍組大鼠肝索明顯,但中央靜脈周圍有巨噬細(xì)胞,表明肝細(xì)胞有炎癥。茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠肝索和肝竇結(jié)構(gòu)較模型組有所恢復(fù),細(xì)胞皺縮情況均有所改善。各組大鼠肝臟病理等級(jí)評(píng)分見(jiàn)表5。由表5可知,與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠肝臟病理等級(jí)評(píng)分均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,二甲雙胍組和茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠肝臟病理等級(jí)評(píng)分均顯著降低(P<0.05)。

      大鼠胰腺組織HE染色結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2 所示,空白對(duì)照組大鼠胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、呈橢圓形,細(xì)胞排列整齊、孔隙較小,細(xì)胞核大小相差不大。模型組大鼠胰島形態(tài)被破壞、變形呈葫蘆狀,中央可見(jiàn)空亮區(qū)和許多空泡,細(xì)胞核大小不一且游離于細(xì)胞邊緣。二甲雙胍組和茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠胰島形態(tài)、細(xì)胞核情況較模型組均有所改善。各組大鼠胰腺病理等級(jí)評(píng)分見(jiàn)表6。由表6 可知,與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠胰腺病理等級(jí)評(píng)分均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,二甲雙胍組和茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠胰腺病理等級(jí)評(píng)分均顯著降低(P<0.05)。

      3.7 茯苓多糖對(duì)2 型糖尿病模型大鼠肝臟組織中PI3K/Akt/FoxO1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

      與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠肝臟組織中p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1 蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05),PEPCK、G6Pase蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,二甲雙胍組和茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠肝臟組織中p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1(除茯苓多糖低劑量組外)蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05),PEPCK、G6Pase蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。

      4 討論

      本研究采用高脂飼料聯(lián)合STZ構(gòu)建了2 型糖尿病大鼠模型,所得模型大鼠常伴有血脂異常、體質(zhì)量減輕,且伴有HbA1c 水平持續(xù)升高等癥狀,與以往文獻(xiàn)一致[17]。

      體質(zhì)量下降被認(rèn)為是糖尿病的典型特征,這與葡萄糖代謝缺陷和組織蛋白過(guò)度分解有關(guān),而HbA1c 常作為糖尿病控制的監(jiān)測(cè)指標(biāo)[18]。在糖尿病的發(fā)生過(guò)程中,高血糖、高胰島素血癥和游離脂肪酸升高均可誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生,而強(qiáng)氧化環(huán)境可能會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗等生理功能障礙和糖尿病并發(fā)癥發(fā)生[19]。本研究結(jié)果顯示,茯苓多糖給藥后,能夠恢復(fù)大鼠體質(zhì)量,顯著降低2 型糖尿病模型大鼠的空腹血糖、HbA1c 水平,改善葡萄糖耐受情況,減輕氧化應(yīng)激水平。此外,茯苓多糖還可降低2 型糖尿病模型大鼠血清中的TC、TG 水平,遏制糖尿病病程中因糖脂代謝異常導(dǎo)致的膽固醇代謝異常,減輕胰腺組織的結(jié)構(gòu)破壞,從而發(fā)揮保護(hù)胰島β細(xì)胞的作用。

      肝臟在能量平衡中起著至關(guān)重要的作用,而糖尿病病程發(fā)展中容易引起肝臟相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生,嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致死亡[20]。因此,肝臟損傷程度和肝糖原含量間接反映了機(jī)體的胰島素活性和糖代謝能力[21]。本研究中,模型組大鼠肝糖原含量顯著升高,肝臟病理切片顯示肝細(xì)胞形態(tài)改變,肝小葉不明顯,肝細(xì)胞排列散亂,肝索結(jié)構(gòu)消失,肝竇擴(kuò)大,表明2 型糖尿病模型大鼠的肝臟損傷可能與糖脂代謝失調(diào)及長(zhǎng)期高糖刺激引起的炎癥損傷有關(guān)。茯苓多糖給藥后,各劑量組大鼠的肝糖原含量顯著降低,肝臟組織病理學(xué)檢查顯示肝索和肝竇結(jié)構(gòu)得到改善,表明茯苓多糖可以改善2 型糖尿病模型大鼠的肝臟損傷情況,也間接反映了茯苓多糖可以改善胰島素活性和糖代謝能力。

      PI3K信號(hào)分子調(diào)節(jié)葡萄糖的攝取和代謝,其下游的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)Akt 磷酸化后可以調(diào)節(jié)糖異生和糖原合成[22]。FoxO1 是位于PI3K/Akt 途徑下游的關(guān)鍵因子,其轉(zhuǎn)錄活性受磷酸化的Akt 調(diào)節(jié),而肝臟FoxO1 功能增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致胰島素作用受損及肝臟糖異常增多;相反,糖尿病發(fā)展過(guò)程中會(huì)損壞PI3K/Akt 通路,負(fù)調(diào)控使FoxO1 去磷酸化相對(duì)激活并移位到細(xì)胞核,去磷酸化的FoxO1 活性增強(qiáng),從而增加糖異生[23]。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1 蛋白表達(dá)水平均顯著升高,表明茯苓多糖可以激活2 型糖尿病模型大鼠肝臟PI3K/Akt/FoxO1通路。

      正常生理情況下,肝臟通過(guò)葡萄糖和糖原的互相轉(zhuǎn)化來(lái)維持空腹血糖的正常水平。而2 型糖尿病患者的空腹高血糖主要是由肝臟糖異生所導(dǎo)致的[24]。PEPCK 和G6Pase 是肝臟糖異生過(guò)程中2 種關(guān)鍵的限速酶,可通過(guò)抑制這2 種酶來(lái)干預(yù)肝臟糖異生[25]。FoxO1 是肝臟糖異生關(guān)鍵酶調(diào)控的上游靶點(diǎn),被磷酸化的FoxO1 能夠抑制G6Pase 和PEPCK 的蛋白表達(dá),從而抑制糖異生[26]。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠PEPCK 和G6Pase 蛋白表達(dá)水平均顯著降低,表明茯苓多糖可以抑制肝臟糖異生。

      綜上所述,茯苓多糖可以通過(guò)減弱氧化應(yīng)激,上調(diào)PI3K/Akt/FoxO1 通路,從而下調(diào)糖異生關(guān)鍵酶PEPCK和G6Pase的蛋白表達(dá),發(fā)揮抑制肝臟糖異生的作用,進(jìn)而有效降低2型糖尿病模型大鼠的血糖水平,調(diào)節(jié)糖脂代謝。

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