周芳 林濤 代月娥 周勤 蔣蓉

關(guān)鍵詞骨癌痛;白藜蘆醇;OPG/RANK/RANK-L信號(hào)通路;鎮(zhèn)痛

骨癌痛為乳腺癌、前列腺癌、肺癌等大部分晚期癌癥患者的常見癥狀之一，極大地降低了患者的生活質(zhì)量[1]。骨癌痛主要表現(xiàn)為痛覺過敏和觸誘發(fā)痛，其中，痛覺過敏是指患者對(duì)于刺激性疼痛的敏感程度增強(qiáng)，觸誘發(fā)痛是指非痛刺激（比如壓迫或者冷刺激）引發(fā)的疼痛。目前，臨床上針對(duì)骨癌痛的治療方式主要有手術(shù)、放療、化療及藥物治療（阿片類鎮(zhèn)痛藥物和雙膦酸鹽類藥物），藥物治療是鎮(zhèn)痛的主要方式;然而由于骨癌痛并非單一的炎性疼痛，且長(zhǎng)期使用阿片類藥物具有較大的副作用，使得常規(guī)藥物治療難以達(dá)到理想的治療效果[2]。因此，尋找新的治療骨癌痛的藥物十分必要。

白藜蘆醇是一種天然多酚類化合物，具有抗腫瘤、抗炎等藥理作用，且副作用小，耐受性良好[3]。研究表明，膠質(zhì)細(xì)胞功能異常可以促進(jìn)骨癌痛的中樞敏化[4]，而鞘內(nèi)注射白藜蘆醇可以有效抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化從而緩解骨癌痛[5]。另有研究表明，白藜蘆醇還可通過降低脊髓背角鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（calmodulin dependentprotein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）的活化來抑制骨癌痛發(fā)生時(shí)的痛覺過敏[6]。然而，引發(fā)骨癌痛的機(jī)制除了神經(jīng)元活化、膠質(zhì)細(xì)胞功能異常，還有骨組織的破損[7]。骨轉(zhuǎn)移過程中，成骨細(xì)胞/破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)失衡導(dǎo)致了骨組織的破損，從而引發(fā)疼痛[8]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞分泌的一系列炎癥因子可增加破骨細(xì)胞的活性，進(jìn)一步加劇骨癌痛[9]。骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）/核因子κB受體激活因子（receptor activator of NF-κ B，RANK）/RANK 配體（RANK-L）信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞/破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡和骨癌痛的發(fā)生發(fā)展[10-11]，但是，白藜蘆醇是否可通過這一信號(hào)通路來發(fā)揮抗骨癌痛的作用尚未明確。

基于此，本研究采用右后肢脛骨注射乳腺癌Walker256 細(xì)胞懸液的方法建立骨癌痛大鼠模型，并以鞘內(nèi)注射的方式進(jìn)行給藥，從而研究白藜蘆醇對(duì)骨癌痛模型大鼠痛覺、OPG/RANK/RANK-L 信號(hào)通路及炎癥因子水平的影響，以期為骨癌痛新藥開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用儀器主要有37370 型足底熱刺痛儀、NC12775 型VonFrey 纖維絲（上海玉研科學(xué)儀器有限公司），311 型二氧化碳培養(yǎng)箱、iBrightTM CL750 型成像儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司），Mini-PROTEAN?Tetra 型垂直電泳槽（美國Bio-Rad 公司），Spectramax M5型多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）。

1.2 主要藥品與試劑

白藜蘆醇購自美國Sigma公司（批號(hào)R5010）;RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）均購自美國Thermo FisherScientific 公司（批號(hào)分別為A1049101、10099）;兔抗RANK-L 多克隆抗體購自美國Proteintech 公司（批號(hào)23408-1-AP）;兔抗RANK多克隆抗體、兔抗OPG多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（二抗）、化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自美國Bio-Rad 公司（批號(hào)分別為ab200369、ab183910、1706515、1705061）;兔抗GAPDH多克隆抗體購自美國Merck公司（批號(hào)G9545）;磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰酶均購自北京索萊寶科技有限公司（批號(hào)分別為P1020、T1300）;蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白上樣緩沖液（5×）、大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、大鼠白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA 試劑盒、大鼠IL-1β ELISA 試劑盒、大鼠趨化因子配體2（chemokine ligand 2，CCL2）ELISA試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)分別為P0033、P0012、P0286、PT516、PI328、PI303、PC128）;其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 細(xì)胞

大鼠乳腺癌Walker256 細(xì)胞（編號(hào)ZQ0544）購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.4 動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所用SD 雄性大鼠共40 只，體質(zhì)量200～220 g，6～8 周齡，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0011。所有大鼠隨機(jī)分籠飼養(yǎng)，提供充足的食物、飲用水并進(jìn)行12 h/12 h 的晝夜光照循環(huán)，飼養(yǎng)環(huán)境保證通風(fēng)、溫度適宜（20～23 ℃）。動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境2 周后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將Walker256 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用PBS清洗1 遍后，用0.25%胰酶消化1 min，制成單細(xì)胞懸液，并用細(xì)胞凍存液調(diào)整細(xì)胞密度為2×107個(gè)/mL，用液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 鞘內(nèi)置管處理

大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進(jìn)行麻醉，根據(jù)文獻(xiàn)[12]方法操作：使大鼠俯臥于手術(shù)布上，以脊髓L6～S1 棘突間隙為中心用碘伏消毒，依次切開皮膚、淺筋膜，分離肌肉暴露出大鼠脊髓L6 的硬脊膜，將PE-10 導(dǎo)管緩慢推入至脊髓L6（插入深度為3 cm），再縫合固定近端導(dǎo)管。術(shù)后大鼠分籠飼養(yǎng)，并給予足夠的食物和水。取無運(yùn)動(dòng)障礙且髓鞘注射2%利多卡因20 mL后30 s 內(nèi)出現(xiàn)雙下肢麻痹的大鼠用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 造模、分組與給藥

參考文獻(xiàn)[13]方法，建立骨癌痛大鼠模型。將鞘內(nèi)置管5 d 后且可用于實(shí)驗(yàn)的大鼠，分為假手術(shù)組、模型組和白藜蘆醇低、中、高劑量組（0.25、1、2 mg/kg，以二甲基亞砜溶解），每組8 只。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進(jìn)行麻醉，使大鼠仰臥于手術(shù)臺(tái)上，固定右后肢，進(jìn)行脫毛、碘伏消毒;在大鼠右后肢膝關(guān)節(jié)處向下切開約0.5 cm，鈍性分離肌肉，暴露脛骨;用1 mL針頭在脛骨遠(yuǎn)端鉆孔，并注入Walker256細(xì)胞懸液20 μL（注射完停留1～2 min），再用醫(yī)用膠水迅速封閉針孔，然后逐層縫合。假手術(shù)組大鼠暴露脛骨鉆孔后，注射等體積生理鹽水。術(shù)后12 d，所有造模大鼠的機(jī)械縮足反射閾值和熱縮足反射潛伏期較假手術(shù)組大鼠均顯著降低，表明造模成功。造模成功后，白藜蘆醇各劑量組大鼠分別鞘內(nèi)注射相應(yīng)藥物，假手術(shù)組和模型組大鼠鞘內(nèi)均注射等體積二甲基亞砜，鞘內(nèi)注射量為10 μL，每天1次，連續(xù)5 d。

2.4 機(jī)械縮足反射閾值的檢測(cè)

檢測(cè)造模前、造模后（即術(shù)后12 d）和給藥后第3、5天各組大鼠的機(jī)械縮足反射閾值變化。將大鼠置于底部為金屬網(wǎng)格、四周為透明玻璃的盒子中。待大鼠適應(yīng)后，用不同彎折力的VonFrey 纖維絲刺激大鼠右后足足底，每次刺激5 s，間隔15 s。當(dāng)大鼠出現(xiàn)縮足、抬足、舔足等行為時(shí)，記錄此時(shí)VonFrey 纖維絲對(duì)應(yīng)的折力值（g），即機(jī)械縮足反射閾值。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程由同一名實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行觸痛刺激，以保持刺激強(qiáng)度一致。每只大鼠重復(fù)測(cè)量3 次，取平均值。

2.5 熱縮足反射潛伏期的檢測(cè)

檢測(cè)造模前、造模后（即術(shù)后12 d）和給藥后第3、5天各組大鼠的熱縮足反射潛伏期。同樣將大鼠置于底部為金屬網(wǎng)格，四周為透明玻璃的盒子中。待大鼠適應(yīng)后，用熱刺痛儀刺激大鼠右后足足底。當(dāng)大鼠出現(xiàn)抬足時(shí)，記錄此時(shí)熱刺痛儀對(duì)應(yīng)的數(shù)值，即熱縮足反射潛伏期。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程由同一名實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行熱刺激，以保持刺激強(qiáng)度一致。每只大鼠重復(fù)測(cè)定3 次（每隔5 min測(cè)量1 次），取平均值。

2.6 血清中炎癥因子水平的檢測(cè)

采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。末次給藥后，采集各組大鼠的外周血，置于1.5 mL離心管中，室溫靜置2 h 后，以2 000 r/min 離心10 min，收集血清（上清液）于離心管中。按照ELISA 試劑盒說明書方法分別檢測(cè)血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、CCL2 的水平。

2.7 大鼠脛骨中RANK、RANK-L、OPG蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。末次給藥取血后，假手術(shù)組、模型組和白藜蘆醇中劑量組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（300 mg/kg）處死后，迅速取出大鼠的脛骨，置于預(yù)冷的生理鹽水中充分浸泡，然后用水清洗3～5 遍。將脛骨組織剪碎，用液氮研磨成粉末。每100 mg骨組織粉末用300 μL RIPA 裂解液混合勻漿，冰浴30 min 后，于4 ℃條件下以12 000 r/min 離心15 min，收集上清液，即為骨組織蛋白。用BCA 試劑盒測(cè)量骨組織蛋白的濃度。將骨組織蛋白樣品用loading buffer（5×）稀釋，然后煮沸滅活。待滅活蛋白冷卻至室溫，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜并用5%脫脂奶粉封閉90 min，加入RANK、RANK-L、OPG一抗（稀釋度均為1 ∶1 000）和GAPDH一抗（稀釋濃度為1 ∶10 000）孵育過夜;以TBST 漂洗5 min×3 次后，加入二抗（稀釋度為1 ∶10 000）室溫孵育90 min。采用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，并用凝膠成像儀成像，采用Quantity-one 軟件分析蛋白灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠機(jī)械縮足反射閾值的檢測(cè)結(jié)果

造模前各組大鼠機(jī)械縮足反射閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模后，與假手術(shù)組相比，模型組和白藜蘆醇各劑量組大鼠機(jī)械縮足反射閾值均顯著降低（P<0.05）。給藥后第3、5 天，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠機(jī)械縮足反射閾值均顯著降低（P<0.05）;與模型組相比，白藜蘆醇低劑量組大鼠機(jī)械縮足反射閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而白藜蘆醇中、高劑量組大鼠機(jī)械縮足反射閾值均顯著升高（P<0.05），且呈劑量依賴趨勢(shì)。結(jié)果見表1。

3.2 大鼠熱縮足反射潛伏期的檢測(cè)結(jié)果

造模前各組大鼠熱縮足反射潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模后，與假手術(shù)組相比，模型組和白藜蘆醇各劑量組大鼠熱縮足反射潛伏期均顯著降低（P<0.05）。給藥后第3、5 天，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠熱縮足反射潛伏期均顯著降低（P<0.05）;與模型組相比，白藜蘆醇低劑量組大鼠熱縮足反射潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而白藜蘆醇中、高劑量組大鼠熱縮足反射潛伏期均顯著升高（P<0.05），且呈劑量依賴趨勢(shì)。結(jié)果見表2。

3.3 大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β、CCL2 的水平的檢測(cè)結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、CCL2 表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組相比，白藜蘆醇低劑量組大鼠血清中IL-6 水平顯著降低（P<0.05），TNF-α、IL-1β和CCL2 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;白藜蘆醇中、高劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、CCL2 水平均顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見表3。

3.4 大鼠脛骨中RANK、RANK-L、OPG蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脛骨中RANK、RANK-L蛋白表達(dá)水平顯著升高，OPG蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。與模型組相比，白藜蘆醇中劑量組大鼠脛骨中RANK、RANK-L 蛋白表達(dá)水平均顯著降低，OPG 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。結(jié)果見圖1、表4。

4 討論

骨癌由多種癌癥的原發(fā)性或繼發(fā)性骨轉(zhuǎn)移誘發(fā)，約90%的乳腺癌和前列腺癌患者會(huì)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移[14]。骨癌發(fā)生發(fā)展過程中會(huì)引起劇烈且持續(xù)的疼痛，增加患者死亡率，因此，深入了解骨癌痛的分子機(jī)制可為骨癌痛藥物及新作用靶點(diǎn)的開發(fā)提供依據(jù)。本研究選用大鼠乳腺癌Walker256 細(xì)胞制備骨癌痛大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠機(jī)械縮足反射閾值和熱縮足反射潛伏期均顯著降低，提示骨癌痛模型大鼠出現(xiàn)機(jī)械痛敏反應(yīng)和神經(jīng)病理性疼痛，表明造模成功。進(jìn)一步鞘內(nèi)注射白藜蘆醇發(fā)現(xiàn)，大鼠機(jī)械縮足反射閾值和熱縮足反射潛伏期均有所升高。這表明白藜蘆醇可以改善大鼠骨癌痛。

研究發(fā)現(xiàn)，骨腫瘤細(xì)胞和相關(guān)免疫細(xì)胞可釋放大量炎癥因子，如CXCL 家族趨化因子、IL-6、TNF-α和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）等，這些炎癥因子可通過致敏外周傷害性感受器或作用于成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、神經(jīng)纖維上的效應(yīng)器，從而導(dǎo)致骨癌痛的產(chǎn)生[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α和IL-1β是導(dǎo)致骨癌痛的主要促炎因子，可以激活膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞分泌CCL2，進(jìn)一步加劇炎癥疼痛[17]。在骨癌痛等慢性疼痛中，機(jī)體TNF-α和IL-1β水平升高[18];TNF-α與TNF受體結(jié)合[包括TNF-α受體1（TNFR1）和TNF-α受體2（TNFR2）]可導(dǎo)致神經(jīng)元的敏化[19];IL-1β可以直接增加神經(jīng)元突觸間興奮傳播，導(dǎo)致機(jī)械痛敏反應(yīng)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和CCL2 的水平均顯著升高，而經(jīng)白藜蘆醇干預(yù)后，大鼠上述炎癥因子水平均降低。這表明白藜蘆醇可以改善大鼠骨癌痛引起的炎癥反應(yīng)。

在炎癥條件下，OPG/RANK/RANK-L 信號(hào)通路調(diào)節(jié)的破骨細(xì)胞分化會(huì)受到影響，從而影響破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡[21]。RANK-L 與其受體RANK 結(jié)合后可促進(jìn)破骨細(xì)胞的成熟和分化;而OPG是破骨細(xì)胞抑制因子，可通過調(diào)節(jié)TNF-α、TGF-β、糖皮質(zhì)激素等的激活，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制RANK與RANKL的結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞分化，并促進(jìn)其凋亡[22]。骨腫瘤中，成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的平衡被打破，破骨細(xì)胞的增殖及活化可以分泌溶解酶，引發(fā)進(jìn)行性的溶骨活動(dòng)，降解骨基質(zhì)，從而引發(fā)劇烈疼痛[23-24]。一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，49 例骨轉(zhuǎn)移瘤患者外周血中RANK-L 水平遠(yuǎn)高于未發(fā)生骨轉(zhuǎn)移瘤的腫瘤患者，表明RANK-L 可以作為骨轉(zhuǎn)移瘤的生物標(biāo)志物[25]。此外，成骨細(xì)胞、免疫細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞分泌的炎癥因子可以增加破骨細(xì)胞的活性，從而下調(diào)OPG，上調(diào)RANK-L;同時(shí)，活化后的破骨細(xì)胞又進(jìn)一步分泌多種生長(zhǎng)因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠脛骨中OPG蛋白表達(dá)水平顯著降低，RANK-L蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示大鼠脛骨出現(xiàn)了骨吸收和骨破損。由于中劑量的白藜蘆醇已具有鎮(zhèn)痛和緩解炎癥的作用，因此，本研究在后續(xù)Western blot 實(shí)驗(yàn)中僅檢測(cè)了白藜蘆醇中劑量組大鼠脛骨中OPG/RANK/RANK-L 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)白藜蘆醇干預(yù)后，模型大鼠脛骨中RANK、RANK-L 蛋白表達(dá)水平均顯著降低，OPG蛋白表達(dá)水平顯著升高。這表明白藜蘆醇可通過抑制OPG/RANK/RANK-L 信號(hào)通路活性，抑制破骨細(xì)胞活化和骨質(zhì)破損，從而緩解大鼠骨癌痛。

綜上所述，鞘內(nèi)注射白藜蘆醇可緩解大鼠骨癌痛引起的炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與抑制OPG/RANK/RANK-L信號(hào)通路活性有關(guān)。